שיטה מעבדה למדוד מדבק מפהק בחולדות

Summary

השיטה המתוארת כאן שואפת להשיג עקומות הדבקה מפהק בזוגות של חולדות גבריות מוכרות או לא מוכרות. כלובים עם חורים המופרדים באמצעות מחיצות ברורות או אטומות עם (או ללא) חורים משמשים כדי לזהות אם חזותי, חוש הריח, או שני סוגי הרמזים הסנסוריים יכולים לעורר מדבקת פיהוק.

Abstract

תקשורת היא היבט חיוני של חיי חברה בעלי חיים. בעלי חיים יכולים להשפיע אחד על השני ולהתאחד בבתי ספר, להקות ועדרים. תקשורת היא גם דרך המינים אינטראקציה במהלך חיזור ואיך יריבים ליישב סכסוכים בלי להילחם. עם זאת, יש כמה דפוסי התנהגות שקשה לבחון את קיומו של הפעילות הכרוכה בתקשורת, משום שכמה סוגים של שיטות חישה מעורבות. לדוגמה, הפיהוק המדבק הוא מעשה תקשורת ביונקים שעלולים להתרחש באמצעות ראייה, שמיעה, ריח או שילוב של חושים אלה, בהתאם לשאלה אם החיות מוכרות זו לזה. לכן, כדי לבחון השערות על התפקיד האפשרי של התנהגויות כאלה, יש צורך בשיטה מתאימה כדי לזהות את השיטות התחושתיות המשתתפות.

השיטה המוצעת כאן מבקשת לקבל עקומות הדבקה מפהק לחולדות מוכרות ובלתי מוכרות ולהעריך את ההשתתפות היחסית של השיטות החושיות החזותיות והריח. השיטה משתמשת בחומרים זולים, ובשינויים משניים, ניתן להשתמש בה גם עם מינים אחרים של מכרסמים כגון עכברים. באופן כללי, השיטה כרוכה בהחלפת חוצצים ברורים (עם או בלי חורים) עם חוצצים אטומים (עם או בלי חורים) המאפשרים או למנוע תקשורת בין חולדות הנמצאות בכלובים סמוכים עם חורים בצדדים סמוכים. בהתאם, ניתן לבחון ארבעה תנאים: תקשורת הריח, תקשורת חזותית, הן תקשורת חזותית וריח, וגם תקשורת חזותית ולא ריח. כאשר האינטראקציה החברתית מתרחשת בין העכברושים, תנאי הבדיקה הללו מדמות מה שעלול להתרחש בסביבה טבעית. במובן זה, השיטה המוצעת כאן יעילה יותר מאשר שיטות מסורתיות המסתמכות על מצגות וידאו שתוקפם הביולוגי יכול לעורר חששות. עם זאת, הוא אינו מפלה בין התפקיד הפוטנציאלי של שמיעה ותפקידים של ריח וחזון בפיהוק מדבקת.

Introduction

באופן מסורתי, התנהגות התקשורת נחקרה משתי נקודות מבט. מנקודת מבט אחת, ethologists להתבונן ולתעד את ההתנהגות של בעלי חיים בהגדרות טבעיות ולנסות לזהות את הערך האדפטיבית שלה¹. התחושה המסוימת או החושים המעורבים לא היו האינטרס העיקרי של מחקרים אלה. מנקודת מבט אחרת, פיזיקולוגים מעוניינים יותר להתיר את המנגנונים שבהם בעלי החיים מתקשרים¹; מכאן, לימודי מעבדה סיפקו שיטות להתמודדות עם התפקיד שדפוסי החישה מנגנים בתקשורת^2,3. שתי הפרספקטיבות הללו אכן משלימות, משום שהידע הן על הערך הגמיש והן על מנגנונים מיידיים יש צורך להבין הבנה מקיפה של התנהגויות תקשורת בחיי החברה.

התנהגות מפהק היא מרכיב בולט ברפרטואר התנהגותי במספר מינים של בעלי חוליות⁴, החל מדגים לפרימטים⁵. ניתן לתאר אותה כפתיחה איטית של הפה והתחזוקה של העמדה הפתוחה שלה, ולאחריה סגירה מהירה יותר של הפה⁵. משך כל הרצף תלוי במין; לדוגמה, פרימטים מפהק למשך זמן רב יותר מאשר מינים שאינם פרימטים⁶. במינים רבים, כאשר בני האדם הם יוצאי דופן, הזכרים נוטים לפהק בתדירות גבוהה יותר מאשר נקבות⁷. תכונה זו עשויה להיות מתחת לפונקציית התקשורת האפשרית של הפיהוק, למרות שדפוסים רגילים של הפיהוק והתדר היומי שלה עשויים גם הם להציע פונקציה פיזיולוגית. בחולדות, הפיהוק הספונטני עוקב אחר קצב מעגלי, עם פסגות של תדר גבוה המתרחשים בבוקר ואחר הצהריים^8,9.

תכונה מעניינת אחת של התנהגות מפהק היא שזה יכול להיות מעשה מדבק (כאשר הגירוי שחרור של התנהגות במקרה היא חיה אחרת המתרחשת באותה הדרך¹⁰) בכמה מינים של בעלי חוליות^{11,12, 13,14,15,16}, כולל ציפורים¹⁷ ו מכרסמים¹⁸. יתר על כן, הראיות האחרונות הראו כי מפהק מדבקת עשוי לשקף תפקיד בתקשורת, כי הפיהוק של עכברוש אחד יכול להשפיע על המצב הפיזיולוגי של האחר כאשר נחשף הריח רמזים¹⁹. עם זאת, בין אם לפהק יש תפקיד מתקשר הוא עדיין תחת הדיון^20,21, וניתוח מפהק מדבקת הוא צעד ראשון חיוני כדי לפתור את הבעיה.

מצד שני, הפיהוק המדבק נקשר ליכולת של בעל חיים להזדהות עם הפרספקטיבות של בעלי חיים אחרים; מכאן, אנשים קרובים יותר סביר יותר להראות הזיהום⁴. השערה זו נבדקה לעתים קרובות במצבי מעבדה שבהם בעלי חיים מוצגים עם גירויים מפהק בוידאו^12,13; לכן, הזיהום יכול להתרחש רק באמצעות רמזים חזותיים. חקירות אחרות העריכו פיהוק מדבקת בתנאים טבעיים יותר באמצעות קבוצות של בעלי חיים^14,15. הבעיה העיקרית לכך היא שבעלי חיים בעלי אינטראקציה חברתית מגיבים לעתים קרובות לרמזים ולאותות החלפה המעבירים דרך שילובים של שיטות חישה. לשלול את החושים הממשיים המעורבים בהתנהגות נתונה מההשפעות המשולבות שלהם היא לא תמיד משימה קלה. בדרך כלל, חוקרים פרמקואובולוגית או בניתוח לעכב את השימוש של בעל חיים במובן נתון, ולאחר מכן להסיק את התפקיד של התחושה הזאת בהתנהגות הרלוונטית^2,3,18,22. למרבה המזל, ישנן שיטות נוספות בהן רק מחסומים פיזיים משמשים כדי לאפשר או לעכב את התקשורת בין בעלי חיים^23,24,25, ובכך להשיג תוקף ביולוגי גדול יותר.

השיטה המוצעת כאן תוכננה במיוחד כדי ללמוד מפהק מדבקת בחולדות מוכרות ולא מוכרות בסביבה חברתית. על פי ההשערה האמפטית, הקבוצה הקודמת צריכה להיות חשופה יותר לפיהוק מדבק. השיטה אינה דורשת מבעלי החיים להיות מונעים באופן כירורגי או תרופתי של כל החושים. במקום זה, זה עובד על ידי הצבת חולדות בכלובים סמוכים עם חורים ומפריעה פיזית התקשורת שלהם באמצעות חוצצים ברורים או אטומים עם או בלי חורים. כך, ארבעה מבחנים ניתן לבחון: (1) הריח תקשורת (OC, מחורר המפריד אטום), (2) תקשורת חזותית (VC, מפריד ברור לא מחורר), (3) תקשורת חזותית וריח (VOC, מחורר ברור מנוקב), ו (4) לא תקשורת חזותית ולא ריח (NVOC, מפריד אטום ללא מחורר). לכן, החוקרים יכולים להשוות את התרומה היחסית של חוש הריח, ויזואלית, ובמידה מסוימת, רמזים שמיעתי הדבקה מפהק. גישה זו אינה חדשה, כמו שיטות דומות שימשו כדי לבודד את החושים הכרוכים בתקשורת מסויימת בבעלי חיים כגון לטאות²³ ועכברים²⁶. למעשה, גאלופ ועמיתים²⁷ השתמשו בשיטה דומה כדי להדגים את התפקיד של רמזים חזותיים מדבקת מפהק ב budgerigars. התכונות העיקריות של שיטות אלה הן הדמיה של הקשר החברתי ואת הלחץ המינימלי שנגרם על החיות. יתרה מזאת, השימוש בבעלי חיים באינטראקציה מגביר את תוקפו הביולוגי של המסקנות.

ישנן מספר דרכים למדוד מדבק מפהק^25,28. ד ר סטפן א. ג. לאה (תקשורת אישית, 2015) עזר לנו להתאים מספרית שיטה שעבדה בעבר על ידי primatologists^13,14 עבור ניתוח מוקדם יותר של הנתונים המשמשים כאן¹⁸. המוצג בפרוטוקול זה הוא גרסה משופרת של שיטה זו עם מגוון רחב יותר של יישומים. הוא כולל שקלול את המספר הכולל של הצרחה של החולדה, בתוך ומחוץ לחלון זמן נתון, ביחס לזמן ההתבוננות המתאים לפיהוק בתוך ומחוץ לחלון הזמן.

לדוגמה, אם מניחים שחולדות A ו-B נצפו במשך 12 דקות, הפיהוק שלהם נרשם לדקה הקרובה ביותר, וחלון 3 דקות של זמן מוגדר למדוד מדבק מידבק. לאחר מכן, רצפי הפיהוק הבאים עבור כל אחד מאותם חולדות נחשבים: עכברוש A (0, 0, 0, 1, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 2, 1) ו-B עכברוש (0, 1, 1, 0, 1, 1, 0, 0, 0,0, 0, 3). יש לציין כי כל מספר (0-3) מקביל למספר הפיהוק הבקיע בכל דקה. עבור עכברוש A, במהלך הדקות 1, 10, ו -11 (מספרים באותיות מודגשות), עכברוש B אינו מפהק בתוך 3 דקות לפני (חלון הזמן שנבחר) או בתוך אותו דקה. . בדקות האלה, עכברוש. מפהק לגמרי 2 פעמים לכן, שיעור פיהוק של עכברוש ללא גירוי מפהק (שיעור הפיהוק לא לאחר הפיהוק) הוא 2/3 (כלומר, 0.67 פיאנס/מינימום). ב 9 דקות הנותרות, עכברוש B מפהק לפחות פעם אחת באותה דקה או 3 הדקות הקודמות. חולדה-הצרחה הכוללת ארבע פעמים ב -9 הדקות הללו. לכן, שיעור הפיהוק של חולדה A בתגובה גירוי מפהק (שיעור הפיהוק לאחר הפיהוק) הוא 4/9 (כלומר, 0.44 פיאנס/דקות). היישום של אותו הליך כדי עכברוש B תשואות שיעור שאינו לאחר הפיהוק מפהק של 2/3 (כלומר, 0.66) ושיעור הפיהוק לאחר הפיהוק של 5/9 (0.55).

מצד שני, אם מפהק נרשם לנקודה העשרונית הקרובה ביותר של דקה, הדבקת הפיהוק תגרום לזמן מותאם לאחר הפיהוק. לדוגמה, אם שעות הפיהוק הבאות נרשמות לאורך 12 דקות של תצפית על חולדות A ו-B: עכברוש A (2.3, 5.1, 5.8, 10.4, 10.8, 11.1) ו-rat B (1.2, 2.4, 4.5, 5.1, 11.2, 11.6, 11.8). עבור עכברוש A, תקופות הזמן שבהן עכברוש B לא מפהק בתוך העבר 3 דקות טווח מ -0 עד 1.2 דקות ו מ 8.1 ל 11.2 דקות (כלומר, 3.1 דקות), אשר מניב סך של כ-4.3 מינימום של זמן שאינו לאחר הפיהוק. מספר הפעמים שעכברוש מפהק בתקופה הזאת הוא שלושה (מספרים באותיות מודגשות), כך שיעור הפיהוק שאינו לאחר הפיהוק הוא 3/4.3 (כלומר, 0.69), ואילו שיעור הפיהוק לאחר הפיהוק הוא 3/7.7 (כלומר, 0.38; המכנה מ-12-4.3 דקות). באופן דומה, עבור עכברוש B, תקופות הזמן שבהן עכברוש A לא מפהק בתוך העבר 3 דקות טווח מ -0 עד 2.3 דקות ו מ 8.8 ל 10.4 min, אשר מניב סך של 3.9 min. מספר פעמים עכברוש B מפהק בתוך תקופות אלה הוא אחד, כך שיעור הפיהוק שאינו לאחר הפיהוק הוא 1/3.9 (כלומר, 0.25). לפיכך, שיעור הפיהוק לאחר הפיהוק הוא 6/8.1 (כלומר, 0.74).

בעוד התאמה כמעט ההסכמה בהתנהגות הוא קריטריון אידיאלי כדי להדגים את הנוכחות של המצאות, היבטים כגון האילוצים על מה אדם משתתף, זמן התגובה גירוי, התפלגות ההתנהגות לאורך זמן (למשל, מפהק עלול להתרחש בפרקים), והזמן להפוך את ההגדרה הניסיונית כל להצמיח הבדלים המינים, מה שמקשה על השימוש בחלון זמן ייחודי. זו עשויה להיות הסיבה מדוע החוקרים השתמשו בחלונות זמן שמשתנים בין שניות⁵ למספר דקות¹¹, אשר יוצר בעיות בעת השוואת תוצאות²⁸. בגלל זה, הוא מוצע לחזור על ההליך המתואר לעיל עבור מגוון של חלונות זמן לקבל עקומות הדבקה מפהק ולהשוות את העקומות הדבקה הפיהוק בין המינים.

עקומות הדבקה מקבילה של פיהוק ניתן להשוות על ידי הפצת באופן אקראי את מספר הפימות שנצפו עבור כל חולדה על פני תקופת התצפית. כך, השיטה המוצעת כדי למדוד הדבקה פיהוק מציעה שני סוגים של פקדים: שיעור הפיהוק (1) המתרחשים מחוץ לחלון הזמן (זמן שאינו לאחר הפיהוק) ו (2) עקומת מלאכותי הדבקה השיגה מתוך התפלגות אקראית של מספר הצרחה. לפיכך, גישה זו לניתוח הדבקה מפהק היא צעד קדימה מהליכים אחרים, כגון אלה המשווה בין אחוז או תדירות הפיהוק בתוך חלון זמן בודד שמתרחש מחוץ לחלון זה²⁵, מבלי לקחת בחשבון את ה מסגרות לפעמים בפועל. השיטה משלימה תוכנית מבוססת R²⁹ כדי לחשב בנוחות ובאופן אובייקטיבי את ההסתברות לפיהוק מדבק עבור חלון זמן אחד או יותר.

כדי להמחיש את השימושיות של שיטה זו והיתרונות של התוכנית מבוססת R, ערכת נתונים ממחקר שפורסם בעבר¹⁸ משמש. המצב הניסיוני כללה 144 עכברים זכרים שהוקצו למצב מוכר או לא מוכר. החולדות בכל מצב ניסיוני היו מחולקת לארבע קבוצות של תשעה זוגות ונחשפו לכל אחד מארבעת מצבי המבחן שתוארו לעיל. התנהגויות מפהק של החולדות בכל מצב ניסיוני ומצב בדיקה נרשמו לאחר מכן על פני תקופה של 60 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקולים הניסיוניים והגידול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המוסדיים.

1. חומרים

1. מצא רשימה מלאה של החומרים המשמשים למימוש השיטה בטבלת החומרים. השתמש באיור 1 וחפש ייעוץ מומחה לבניית שולחן הפוך בצורת T, כלובי תצפית וחוצצים בכלוב. בצע את אינדיקציות בטיחות לשימוש של כלים חדים וחומרים העלולים להיות מסוכנים.
2. הפוך שולחן בצורת T הפוך על-ידי הדבקת שני ברים מעץ דמוי המעקה (45 ס מ אורך, מופרדים 0.6 ס מ זה מזה) אל החלק העליון באמצע פיסת עץ (100 ס"מ x 45 ס"מ x 1.5 ס"מ). לאחר מכן, מניחים פיסת עץ שנייה (50 ס"מ x 45 ס"מ x 0.6 ס"מ) אנכית בין הסורגים כמו מסילות. ודא כי פיסת עץ השני מונעת את זוג חולדות בצד אחד מלראות את זוג אחר בצד השני (איור 1).
3. השתמשו בזכוכית ואקריליק ליצירת שמונה כלובי תצפית. ודא כי כל כלוב (19 ס"מ רוחב, 19 ס"מ, 10 ס"מ גבוה, 3 מ"מ עבה) יש 24 חורים רחוקים (5 מ"מ קוטר) מסודרים בשלוש שורות באמצע אחד הצדדים שלה. להפוך בצד זה של אקריליק (3 מ"מ עבה) ולקצר את הגובה של הצד הנגדי על ידי 0.7 ס מ כדי לאפשר לעכברוש לנשום.
   1. ודא שכל כלוב התצפית כולל מכסה החלקה עשוי אקריליק כדי למנוע את החולדה מגידול ולהסיח את עצמו במהלך תקופת התצפית 60 דקות.
4. להפוך ארבעה חוצצים של אקריליק (19 ס"מ רוחב, 30 ס"מ גבוה, 3 מ"מ עבה). מקדחה 24 חורים (קוטר 5 מ"מ) המתאימים לאלה שבכלובים התצפית, כל אחד במפריד אחד ברור ומפריד אחד אטום.
5. הכן גיליונות נתונים מראש כדי לתעד את התרחשות הצרחה. כלול, בכותרת של כל גליון נתונים, את שם המתבונן, מצב ניסיוני (כלומר, חולדות מוכרות או לא מוכרות), מצב מבחן רלוונטי (OC, VC, VOC, NVOC), התאריך, והמועדים הראשוניים והסופיים של ההתבוננות. חלק את שאר גיליון הנתונים לשתי עמודות, כל אחד עם מספר החולדה נכתב בחלק העליון, כדי להקליט את התנהגות מפהק של החולדות.

2. נוהל

1. בית 144 חולדות גברים בקבוצות של ארבעה בכלובים פלסטיים (בית כלובים) מן הגמילה עד שהם מגיעים 2.5 חודשים בגיל. אין להשתמש בחולדות נשיות, משום שהן נוטות להראות וריאציה גדולה יותר בהתנהגות עקב מחזורים הורמונליים, אשר עשויים להתבלבל עם ההשפעות של מצב הבדיקה. ודא כי החולדות בכל כלוב אינם אחים.
   הערה: ייתכן שיהיה קשה להשיג את כל העכברושים יחד. במקרה זה, ליצור בלוקים של לפחות 8 חולדות מוכרות 8 חולדות לא מוכר כך כל מצב מבחן מיוצג פעם אחת בכל מצב ניסיוני³⁰.
2. כדי לזהות את העכברושים, סמנו אותם במספרים סמליים על הזנבות באמצעות סמן מסחרי. לדוגמה, מייצגים את המספרים 1 עד 4 על-ידי שילוב נקודות וקווים (לדוגמה, נקודה אחת עבור מספר 1 ושורה אחת עבור מספר 4). זיהוי חולדות מוכרות ולא מוכרות באמצעות צבעים שונים.
   הערה: לטפל בחולדות בעקבות כיווני הבטיחות המסופקים על ידי צוות מתקן בעלי חיים, ולציית להמלצות לגבי השימוש הנכון בבעלי חיים מעבדתיים במוסד שבו יבוצעו ניסויים.
3. באופן אקראי לבחור אילו כלובים בבית יהיה בית הקבוצה של חולדות מוכרות אשר יהיה לבית הקבוצה לא מוכר. לדוגמה, נניח שקיימים 16 חולדות זמינות המתגוררים בארבעה כלובים ביתיים: מספר כלובי הבית 1 עד 4, ולאחר מכן השתמש ב-R (הורד אותו ב-http://cran.r-project.org/) כדלקמן [לאחר הבקשה (>)]:
   > לדוגמה (4, 4)
   [1] 4 3 2 1
   1. לקבץ את העכברושים המוכרים (או לא מוכרים) בכלובים ביתיים 4 ו-3, ולקבץ את העכברושים לא מוכרים (או מוכרים) בכלובים ביתיים 2 ו-1. ודאו שצוות המתקן בעל החיים שומר על זהותו של כל כלוב ומטפל בחולדות באותו אופן כמו כל העכברושים האחרים במתקן החי.
   2. השתמש בתוכנית R שוב באופן אקראי לבחור חולדות כדי ליצור כל זוג בכל מצב ניסיוני. ודא כי חולדות בכל זוג חולדות מוכרות מקורם באותו כלוב, ולהבטיח כי ההיפך הוא נכון עבור זוגות בקבוצה לא מוכר. באופן אקראי לבחור זוגות של חולדות עבור כל מצב בדיקה בכל מצב ניסיוני.
4. בצע שני הפעלות בדיקה ביום עם שניים מתוך שמונה מצבי בדיקה אפשריים (ארבעה עבור כל חולדות מוכר ולא מוכר) לכל הפעלה (כלומר, 60 מינימום תקופת התצפית). בצע את שני מפגשי הבדיקה ברציפות בתוך 3 שעות.
   הערה: הקפידו לערוך את כל הפעלות הבדיקה (ארבע זוגות חולדות ליום) בבוקר או בשעות אחר הצהריים כדי להימנע מכל גורם מייסד. הפעל שכפול מלא (שמונה מצבי מבחן) של הניסוי במשך שני ימים רצופים.
   1. הקפד להשתמש במצבי הבדיקה ברצף אקראי עבור כל שכפול של הניסוי. לדוגמה, השתמש במספרים 1 עד 8 כדי לזהות כל אחד ממצבי הבדיקה, ולאחר מכן השתמש ב-R באופן הבא:
      > לדוגמה (8, 8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. הקצה מצבי מבחן 8 ו -7 כדי לבדוק את ההפעלה 1, מצבי בדיקה 4 ו-6 כדי לבדוק את ההפעלה 2, וכן הלאה. אז, באקראי לבחור את הצד של השולחן בצורת T הפוך שבו כל זוג חולדות (מצב הבדיקה) ימוקמו.
5. חזור על אותו ההליך (שלבים 2.3 to 2.4.2) עבור שכפול שני (כלומר, בלוק) של הניסוי.
   הערה: אם מטרת המחקר היא לבחון את ההשפעות של מצבו החברתי (כלומר, שני חולדות מובחנות) על תדר מפהק, השתמשו בעכברוש אחד הממוקם בכלוב תצפית ליד כלוב תצפית ריק כפקד לכל אחד מארבעת מצבי המבחן. בצע את הניסוי 2x עבור כל מצב בדיקה עבור קבוצת שליטה של שמונה חולדות.
6. הגדר את הפעלת המבחן על ידי העברת ארבעת החולדות הראשונות ממתקן החי לחדר התצפית, שם הם יישארו עבור 15 דקות כדי התאקלם לסביבה הרומן. להעביר את החולדות בכלובים בודדים ולשמור אותם מופרדים זה מזה במהלך התחבורה בחדר התצפית.
   הערה: בצע את הוראות הבטיחות להובלת בעלי חיים המסופקים על ידי צוות המתקן של בעל החיים והשתמש בבגדים המצוינים לעבודה עם בעלי חיים במעבדה. לחולדות לא תהיה גישה למזון ולמים בזמן שהם נמצאים בחדר התצפית.
7. לאחר שתקופת ההסתגלות חלפה, הצב את הטבלה ההפוכה בצורת T על שולחן מלבני גדול יותר. ודא שיש מנורת תקרה הגורמת לתאורה מספקת של החדר בעת ביצוע התצפיות.
8. לשים נייר סינון על החלק התחתון של כל כלוב התצפית ולמקם את הכלובים בזוגות בכל צד של השולחן בצורת T הפוכה. הצב את המפריד המתאים בין כל זוג כלובים.
   הערה: נייר הסינון מקל על ניקוי הכלובים ומספק משטח מחוספס שעליו יכולים החולדות לנוע מבלי לחמוק.
9. אסטרטגית מקום שני מצלמות וידיאו דיגיטליות כגון כל רשומה התנהגות מפהק של כל זוג חולדות. ודא כי מצלמות וידיאו קבועות בבטחה לטריפודים ומיועדים כראוי לכלובים התצפית. לחבר את מצלמות וידאו למחשב שולחני במקביל לפקח על התנהגות של חולדות.
   הערה: אחסן את המידע הדיגיטלי בכונני flash כדי לאחסן בארכיון לצמיתות את ההפעלות הנסיוניות. השתמש בכונני flash עם קיבולת אחסון גבוהה.
10. בעקבות תקופת ההסתגלות, הציבו את העכברושים בכלובים התצפיות לפי ההקצאה שנקבעה קודם לכן. להגדיר את הפוקוס האוטומטי של מצלמת וידאו ולהתחיל את הקלטת וידיאו בו זמנית עם סטופר. הפסק את הקלטת הווידאו בסוף תקופת התצפית 60 דקות.
    הערה: בעוד שהנסחנים עשויים להיות מחוץ לחדר במהלך הבחינה ולהתבונן מרחוק, מומלץ לאדם אחד להיות בחדר התצפית (רחוק ככל האפשר מן ההגדרה הניסיונית) תוך פיקוח על התנהגות החולדות ל ודא שהפעלת הבדיקה ממשיכה ללא הפרעה.
11. כאשר התצפית מסתיים, החזר את העכברושים לכלובים הבית שלהם במתקן החי. בקשו מצוות מתקן החיות להבטיח שיהיו לחולדות גישה לאוכל ולמים שוב. נקה ביסודיות את כלובי התצפית באמצעות חומרי ניקוי לא רעילים והכינו את הערכה הניסיונית לביצוע הבדיקות השניות והסופיות של היום.
    הערה: נקו את העץ כדי להסיר את כל הריחות שנותרו על ידי החולדות כאשר מניחים בכלובים התצפית, אשר יכול להשפיע על ההתנהגות של זוג העכברושים הבא שנבדק.
12. הרכבת אחד לשני מתנדבים עיוור באופן חלקי לטיפולים שהוקצו כדי לזהות ולהקליט מפהק באמצעות שיטת דגימה כל התרחשות. ודאו שהמשקיפים משתמשים בהגדרת הפיהוק המתואר בסעיף המבוא.
13. הפעל בחזרה והצג כל וידאו על מסך מחשב באמצעות כל מערכת הפעלה סטנדרטית. בקשו מהצופה להציג כל סרטון וידאו ולהתבונן ולהקליט התנהגות מפהק באמצעות גיליונות הנתונים שהוכנו בעבר, ולאחר מכן לאפשר לו/לה לסקור את קטעי הווידאו במהירויות איטיות יותר כדי לשפר את היכולת להתבונן ולמדוד מפהק.
    1. בקשו מהמשבאים להבקיע באמצעות מערכת סימון דומה: השתמש בקווים אנכיים בדקה שנכתבה ככתב עילי כדי לייצג את ההתרחשות של פיהוק (לדוגמה, | ³ | | ⁶ | ⁹, המציין אחד פיהוק בדקה 3, שני מפהק בדקה 6, ואחד פיהוק בדקה 9). הציון מפהק כרצף (לדוגמה, 1.2, 2.2, 3.2, 5.0, 5.8) כדי להקליט אותו עם דיוק רב יותר (דקות מעוגלות למקום עשרוני אחד).
    2. לחלופין, הקלט נתונים ישירות מסרטוני הווידאו למחשב באמצעות תוכניות איסוף נתונים סטנדרטיות. ודא שמתבונן מכיר תוכניות כאלה.
       הערה: במידת הצורך, אפשר למתבונן להציג כל סרטון וידאו ביותר מהפעלה אחת. ודא שמתבונן אחד צופה בכל הסרטונים התואמים לבלוק ניסויים אחד. אם שני משקיפים שונים צפו קטעי וידאו אלה, יכול להיות סיכון כי הבדלים ביכולות שלהם להתבונן ולהקליט מפהק יהיה לבלבל את ההשפעות של מצבי בדיקה. חשוב להבקיע את האמינות פנים-המתבונן בין משקיפים שונים על 10%-20% של קטעי וידאו כדי להבטיח כי מפהק מסומן באותו אופן.

3. עיבוד נתונים

1. תעתור את הרצף הזמני של הפיהוק בכל חולדה מדפי הנתונים לגיליון אלקטרוני. ודא שיש עמודה אחת לכל חולדה עם כותרת קצרה (למשל, fr1. l ו-fr1 r כדי לציין את זוג העכברושים הראשונים בצדדים השמאליים והימניים, בהתאמה). ודא שכל העמודות הן באותו אורך על-ידי מילוי התאים הריקים עם 0 או NA (ראה להלן).
   הערה: השתמש במדריך הכללי כמסמך משלים כדי להבין באופן מלא את השלבים הבאים כדי לעבד את הנתונים, למדוד מפהק מדבק ולהשיג עקומות פיהוק מדבקות.
   1. אם הוא הוקלט בדקה הקרובה ביותר, הקלד את מספר הפיהוק בכל דקה רלוונטית והשתמש ב -0 (אין פיהוק) כדי למלא את התאים כאשר לא התרחשה פיהוק בדקה נתונה. שמור את גליון העבודה כקובץ טקסט (. txt).
   2. אם הפיהוק הוקלט לנקודה העשרונית הקרובה ביותר של דקה, הקלד את החלק העליון של הרצף והשתמש ב-"NA" כדי למלא את החללים הריקים של עמודות (חולדות) שבהן מספר הפימות (שורות) נמוך מזה של העמודה עם המספר המירבי (שורות) של פיטים שנרשמו עבור r ב. שמור את גליון העבודה כקובץ טקסט (. txt).
      הערה: כ-R יש אפשרות לעבוד עם תאים ריקים, ניתן לשמור את גליון העבודה עם עמודות באורכים שונים. השתמש באפשרויות העזרה שסופקו על-ידי R כדי לטפל בנתונים חסרים.
2. הפעל את R. יבא את הנתונים מהקובץ שבו הם אותרו בעבר.
3. שמור את קודי התוכנית עם הסיומת ". R "(מסופק כחומר משלים) ולאחר מכן הורד את קוד התוכנית הספציפי (ראה מדריך כללי), בהתאם לשאלה אם הפיהוק הוקלט כמספרים שלמים או כמספרי שברים. הפעל את התוכנית עבור כל זוג חולדות ואת המספר הרצוי של מסגרות זמן.
   1. הפעל שוב את התוכנית, כעת באמצעות התפלגות אקראית של מספר הפיהוק מכל חולדה (ראה מדריך כללי). בצע את אותם צעדים (צעדים 3.3 כדי 3.3.1) עבור כל התנאים הניסיוניים (כלומר, חולדות מוכרות ולא מוכרות) ו/או כל מצבי הבדיקה. המשך כמצוין במדריך הכללי וייצא את התוצאות ל-Excel.
      הערה: במקום לייבא תוכנית שנשמרה בעבר, כפי שהוצע לעיל באמצעות עורך טקסט, העתק והדבק ישירות את התוכנית בסביבת העבודה של R.
4. כדי ליצור עקומות הדבקה מפהק, השתמש בנתונים שנשמרו בעבר בגיליון אלקטרוני. הפחת את שיעורי אי-ההידבקות מקצבי ההידבקות עבור כל זוג חולדות, חלון זמן ומצב בדיקה. הפרד בין הניתוחים של הנתונים הנצפים והנתונים המלאכותית (המופצים באופן אקראי).
   1. לאחר מכן, חשב מרווחי ביטחון (CI) עבור כל חלון זמן ובדיקת מצב באמצעות הליך אתחול (עיין במדריך הכללי). הפרידו את הניתוחים לעכברושים מוכרים ולא מוכרים. לאחר מכן, שלב את הנתונים המלאכותית מארבעת מצבי הבדיקה עבור כל תנאי ניסיוני ולחשב את CI עבור כל חלון זמן באמצעות הליך אתחול.
   2. לאחר מכן, ליצור מגרשים עבור כל מצב בדיקה ומצב ניסיוני (ראה איור 2 ואיור 3). לבסוף, בצע ניתוח רגרסיה מרובה כדי להשוות את עוצמת הפיהוק בין מצבי בדיקה (ראה להלן).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

העכברושים נבחרו משושלת משנה שנוצרה בעבר משני עכברי הג-דאולי שנבחרו לפיהוק תדיר (כ -22 פינקרים לשעה³¹). עם זאת, תשעה זוגות של מוכר ותשעה זוגות של חולדות גברים מוכרות (בין 2.5 ו-3 חודשים של גיל) השתמשו בכל מצב מבחן פיהק כ 12 פעמים בשעה, בממוצע¹⁸. לכן, מצבי הב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם שלבים קריטיים בשיטה שיש לקחת בחשבון כדי להשיג תוצאות מוצלחות. חולדות מוכרות חייב לחלוק בכלובים בבית לפחות 1.5 חודשים לאחר הגמילה ולפני הפעלת ניסויים. עם זאת, חולדות לא מוכרות חייבות לחיות בכלובים ביתיים נפרדים. בשני המקרים, זוגות העכברושים חייבים לבוא מתוך מטות שונות, אך להיות דומים ככ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.