溶剂清除脑组织狂犬病病毒感染的高分辨率3D成像

摘要

新颖的免疫染色兼容组织清除技术,如溶剂清除器官的终极 3D 成像,允许狂犬病病毒脑感染及其复杂的细胞环境的 3D 可视化。厚厚的抗体标记脑组织切片在光学上透明,以增加成像深度,并通过共聚焦激光扫描显微镜实现 3D 分析。

摘要

通过免疫标记对组织和器官的感染过程进行可视化是现代感染生物学的关键方法。观察和研究器官组织内病原体分布、病变和丰度的能力为疾病发展和进展提供了关键数据。使用传统的显微镜方法,免疫标签主要限于从石蜡嵌入或冷冻样品获得的薄部分。然而,这些薄截面的有限2D图像平面可能导致关于受感染器官复杂结构和感染细胞背景的关键信息丢失。现代多色、免疫染色兼容的组织清除技术现在提供了一种相对快速和廉价的方式来研究受病毒感染的器官组织的大容量 3D 图像堆栈。通过将组织暴露于有机溶剂中,它变得光学透明。这与样品的折射率相匹配,最终导致光散射的显著减少。因此,结合长距离自由工作距离目标,传统的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)可以以高分辨率成像高达1毫米的大组织部分。在这里,我们描述了一个协议,在组织清除后应用深层组织成像来可视化受感染大脑中的狂犬病病毒分布,以便研究病毒发病机制、传播、肌动和神经入侵等主题。

引言

传统的组织学技术主要依靠器官组织的薄部分,这本质上只能提供对复杂 3D 环境的 2D 见解。虽然原则上是可行的,但串行薄截面的 3D 重建需要苛刻的技术管道,以便对采集的图像¹进行切片和后续的硅对齐。此外,在微缩切片后无缝重建 z 体积至关重要,因为机械和计算伪影可能由于非重叠图像平面、染色变化和物理物理造成的图像配准不理想而保留破坏组织,例如,微托姆刀片。相比之下,对完整厚组织样本进行纯光学切片允许获取重叠的图像平面(过采样),从而有助于 3D 重建。这反过来又对分析复杂细胞群(例如,周围胶质和免疫细胞的神经元网络)中的感染过程非常有益。然而,厚组织部分的固有障碍包括光散射和有限的抗体渗透到组织。近年来,开发和优化了各种技术,以克服这些问题2,3,4,5,6,7,8 ^{,9,10,11,12,13.}基本上,目标组织通过处理水^性2、3、4、5、6^、7进行光学透明化 ^,8,9或有机溶剂基10,11,12,13溶液。引入 3DISCO (溶剂清除器官的 3D 成像)^11、12及其后续 uDISCO(溶剂清除器官的最终 3D 成像)¹³提供了一个相对快速、简单且廉价的工具,出色的清算能力。清除协议的主要成分是有机溶剂特-丁醇(TBA)、苯基醇(BA)、苯甲酸酯(BB)和二苯醚(DPE)。iDISCO(溶剂清除器官的免疫标记支持3D成像)14的开发和添加,这是一种兼容的免疫染色方案,与现有方法形成另一个优势,使抗原的深层组织标记得以实现以及免疫染色样本的长期储存。因此,iDISCO¹⁴和 uDISCO¹³的组合允许使用传统的 CLSM 在大组织部分(高达 1 mm)对抗体标记蛋白进行高分辨率成像。

在所有三个维度中保存器官的复杂结构对脑组织尤其重要。神经元构成一个非常异质的细胞亚群,其基于其神经质投影的3D形态高度多样化(由马斯^兰15审查)。此外,大脑由多个隔间和子隔间组成,每个隔间和子隔间由不同的细胞亚群及其比例组成,包括胶质细胞和神经元(由冯·巴托尔德等人^审查)。作为一种神经性病毒,狂犬病病毒(RABV,由Fooks^等人17审查)主要感染神经元,利用他们的运输机械沿着轴向方向从感染的主要部位到达中枢神经系统(CNS)。此处描述的协议(图1A)允许在从受感染的脑组织获得的大型、连贯的图像堆栈中,对RABV和RABV感染的细胞进行免疫染色辅助检测和可视化。这样就可以对感染环境进行无偏见的 3D 高分辨率评估。它适用于各种物种的脑组织,可在固定后或长期储存在甲醛(PFA)中的样品后立即进行,并允许对染色和清除的样品进行数月的储存和再成像。

研究方案

使用RABV感染,PFA固定存档脑材料。各自的动物实验研究由国家农业、食品安全和渔业办公室负责的动物护理、使用和道德委员会(LALFF M-V)进行评估,并获得许可。7221.3-2.1-002/11(小鼠)和7221.3-1-068/16(雪铁龙)。根据批准的指南进行动物实验中使用的一般护理和方法。

注意:本议定书使用各种有毒和/或有害物质,包括PFA、甲醇(MeOH)、过氧化氢(H2O_2)、阿齐德钠(NaN3)、TBA、BA、BB和DPE。MeOH 和 TBA 高度易燃。通过佩戴适当的个人防护设备(实验室外套、手套和眼睛保护)并在烟罩中进行实验,避免接触。将废物分别收集在适当的容器中,并按照当地法规进行处理。狂犬病病毒被归类为生物安全级别(BSL)-2病原体,因此,一般可在BSL-2条件下处理。某些活动,包括可能产生气溶胶、处理高病毒浓度或使用新型莱沙病毒的程序,可能需要BSL-3分类。建议高危人员进行暴露前预防,包括动物看护员和实验室工作人员18、19。请参阅地方当局法规。

1. 脑组织的固定和切片

1. 在磷酸盐缓冲盐水(PBS [pH 7.4])中将脑样本固定在适当的体积为 4% PFA 中,在 4 °C 下至少 48 小时(在 4°C 下,大约组织与固定比率为 1:10 [v/v])。
2. 在PBS中清洗组织样本3x,每次清洗至少30分钟,并将其储存在0.02%NaN₃/PBS中,直到使用。
3. 使用振动膜将组织分割成 1 毫米厚的部分(刀片进给率:0.3±0.5 mm/s,振幅:1 mm,切片厚度:1,000 μm)。
4. 要保持正确的切片顺序,将每个组织部分分别存储在多孔细胞培养板的井中。加入0.02%NaN3/PBS,将组织部分储存在4°C,直到使用。

2. 甲醇样品预处理

注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。样品预处理有助于提高抗体扩散和减少组织自荧光,分别暴露于MeOH和H2 O2,14。

1. 在蒸馏水中制备 20% (v/v)、40%、60% 和 80% MeOH 解决方案。例如,对于 20% MeOH,在适当的可密封容器中加入 10 mL 的 100% MeOH 到 40 mL 蒸馏水,并通过反转进行混合。
2. 将样品转移到大小合理的容器(例如,5 mL 反应管)。注意使用耐化学腐蚀的耐此协议中使用的试剂的材料。例如,请注意,虽然聚丙烯是合适的,但聚苯乙烯并不合适。
   注:本协议中的体积规格指5 mL反应管。如果使用其他容器,则相应地调整体积。
3. 以每粒MeOH溶液的浓度在4 mL中孵育样品,每个上升顺序为1小时。
4. 在纯(100%)中孵育样品2倍,每次1小时甲醇。
5. 将样品冷却至 4°C(例如,在实验室安全的冰箱中)。
6. 例如,在纯(100%) 中稀释 30% H₂O₂库存溶液,制备漂白溶液(MeOH 中的 5% H₂O₂₎我,并在4°C冷却。
7. 从冷藏样品中取出 100% MeOH,并加入 4 mL 的预冷漂白溶液(MeOH 中的 5% H₂O_2)。在4°C下孵育过夜。
8. 将漂白溶液交换4mL,为80%MeOH,孵育1小时。继续使用制备的MeOH溶液系列,每个顺序为1小时,直到样品在4 mL20%MeOH中孵育1小时。
9. 用 4 mL 的 PBS 清洗样品 1x 1 小时。

3. 免疫染色

注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。为了防止微生物生长,在本节中的溶液中加入NaN₃的最终浓度为0.02%。组织样本通过非离子洗涤剂Triton X-100和Tween 20的治疗进一步渗透。正常血清用于阻断非特异性抗体结合。甘氨酸和肝素被添加以减少免疫标签^背景14。

1. 在 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 中,将样品清洗 2 倍,每次 1 小时。
2. 在37°C下渗透样品2天,4mL为0.2%Triton X-100/20%DMSO/0.3M甘氨酸/PBS。
3. 在4mL的0.2%Triton X-100/10%DMSO/6%正常血清/PBS中,在37°C下孵育样品2天,从而阻断抗体的未特异性结合。
   注:使用来自同一物种的正常血清,在二级抗体中升高,以达到理想的阻断结果。
4. 在2 mL原发抗体溶液(3%正常血清/5%DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 与肝素] + 原发抗体/抗体)中孵育样品5天,在37°C下孵育。2.5天后刷新原抗体溶液。
   1. 对于PTwH,在蒸馏水中重组肝素钠盐,形成10mg/mL的库存溶液(在4°C下储存此溶液,无电)。将库存溶液加入 0.2% 补间 20/PBS,最终浓度为 10 μg/mL。
      注:选择正确的抗体稀释可能需要优化。一般来说,标准的免疫性化学浓度是一个很好的起点。
5. 在 4 mTwH 的 4 mL 中清洗样品 1 天,在一天中至少更换 4x-5x 洗涤缓冲液,最后清洗过夜。
6. 在2 mL的二级抗体溶液(3%正常血清/PTwH +二级抗体/抗体)中孵育样品5天,在37°C下孵育。2.5天后刷新二级抗体溶液。
   1. 在二级抗体溶液(即 2 mL 中的 4 μL)中,在 1:500 处稀释二级抗体/抗体。
7. 如步骤 3.5 所述,将样品洗涤 1 天,让最终洗涤过夜。

4. 核染色

注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。如果不需要核染色,或者需要 TO-PRO-3 的激发波长/发射光谱来激发或检测另一种荧光,请跳过此步骤。

1. 在 PTwH 中 1:1,000 稀释核酸染色 TO-PRO-3,并在 4 mL 的核染色溶液中孵育样品 5 小时。
2. 如步骤 3.5 所述,将样品洗涤 1 天,让最终洗涤过夜。
   注:在进行清理后,样品可储存在PBS4°C,直到光学清除。

5. 组织清理

注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。组织样品在一系列分级的TBA溶液中脱水。由于免疫染色需要水溶液,所有染色程序必须在组织清除之前完成。光间隙和折射率匹配是通过BA、BB和DPE的混合物进行处理实现的。清除溶液辅以DL-α-生育酚作为^{抗氧化剂13。}

1. 在蒸馏水中制备 30% (v/v)、50%、70%、80%、90% 和 96% 的 TBA 溶液。例如,对于 30% TBA,在适当的可密封容器中加入 15 mL 的 100% TBA 到 35 mL 蒸馏水,并通过反转进行混合。
   注:TBA的熔点为25~26°C;因此,在室温下,它往往是固体的。为了制备TBA溶液,在孵化器或水浴中以37°C加热密封的瓶子。
2. 用制备的TBA溶液系列每浓度4 mL脱水样品,每个上升顺序为2小时。让 96% 的 TBA 过夜。
3. 进一步纯脱水样品 (100%)待定2小时。
4. 准备清除解决方案 BABB-D15。
   注: BABB-D15 是 BA 和 BB (BABB) 的组合,它们与 DPE 混合,比例为x:1,其中x在解决方案的名称中指定,在本例中为 15。
   1. 对于 BABB,将单部分 BA 与两个部分 BB 混合。
   2. 以 15:1 的比例混合 BABB 和 DPE。
   3. 加入0.4伏尔加DL-+生育酚(维生素E)。
      注:例如,对于 20 mL 的 BABB-D15,将 6.25 mL 的 BA 与 12.5 mL 的 BB 混合。加入1.25 mL的DPE,并补充0.08 mL的DL-α-生育酚。
5. 在清除溶液中清除样品,直到它们光学透明 (2~6 小时)。
6. 样品可储存在BABB-D15的4°C下,在安装和成像之前不受光线照射。

6. 样品安装

1. 使用 3D 打印机,打印成像室和盖子(材料:共聚酯 [CPE],喷嘴:0.25 mm,层高度:0.06 mm,壁厚:0.88 毫米,壁数:4,填充:100%,无支撑结构;相应的 。STL 文件可在本协议的补充材料中找到)。
2. 组装成像室 (图 2.
   1. 使用 RTV-1(单组分室温-硫化)硅橡胶在成像室上安装圆形盖玻片(直径:30 mm)。用水湿棉签去除多余的硅橡胶,并一夜固化。
   2. 使用 RTV-1 硅橡胶在盖子上安装圆形盖玻片(直径:22 mm)。用水湿棉签去除多余的硅橡胶,并一夜固化。
3. 将样品放入成像室,加入少量 BABB-D15,然后插入盖子。使用皮下针(27 G x 3/4 英寸 [0.40 mm x 20 mm])将 BABB-D15 填充到入口。
4. 用 RTV-1 硅橡胶插入进气口并密封成像室。在黑暗中过夜。

7. 成像和图像处理

1. 通过选择相应的激光线来匹配所使用的荧光光道来设置图像采集。调整每个探测器的检测范围,以防止通道之间的信号重叠。
   注: Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的示范检测范围分别为 500*550 nm、590*620 nm 和 645*700 nm。
2. 选择采集参数,定义 z 堆栈的上下边框,并获取图像堆栈。
   注: 示例采集参数是像素大小为 60-90 nm、z 步长 0.5 μm、线平均 1、扫描速度为 400 Hz 和针孔大小为 1 Airy 单位的连续扫描。
3. 使用适当的图像分析软件(例如斐济)处理图像堆栈,以生成 3D 投影或执行深入分析。
   注: 由于获取的图像文件大小较大,通常需要使用工作站。
   1. 在斐济打开采集或图像文件(文件|打开|选择文件)。
      1. 如果使用,例如 , 。LIF 文件,在"生物格式"对话框窗口中选择或取消选择所需的选项。使用超堆栈查看堆栈。除了这一点,不需要特定的选择或刻度。按"确定"。
      2. 如果文件包含多个图像堆栈,请选择要分析的图像堆栈,然后按"确定"进行确认。
   2. 通过将合并的图像拆分为单个通道(图像|颜色|通道工具,然后选择更多|拆分通道)。对于每个通道,选择漂白剂校正(图像|调整|漂白剂校正)并选择简单比率(背景强度:0.0)。
      注:在某些情况下,例如,当信号没有线性衰减或信号整体太弱时,简单比率可能会失败。或者,尝试指数拟合或跳过漂白剂校正。
   3. 使用滑块调整每个通道的亮度和对比度(图像|调整|亮度|对比.
   4. 合并通道 (图像|颜色|合并通道),制作复合 (图像|颜色|通道工具,然后选择更多|制作复合),并将其转换为 RGB 格式 (图像|颜色|通道工具,然后选择更多|转换为 RGB。
   5. 如有必要,调整图像堆栈的大小以减少计算时间和文件大小(图像|调整|大小,两个选项都勾选加上双线性插值)。
   6. 生成 3D 投影(图像|堆栈|3D项目。选择最亮点作为投影方法,并设置切片间距以匹配获取图像堆栈的 z 步长大小。为获得最佳质量,将旋转角度增量设置为1并启用插值。根据需要修改总旋转、透明度阈值和不透明度。
   7. 如有必要,通过将 3D 投影转换回 8 位格式来重新调整对比度和亮度(图像|类型|8 位。使用相应的滑块(图像|调整|亮度|对比)并将映像堆栈重新转换为 RGB 格式,如步骤 7.3.4 中所述。
   8. 将 3D 投影另存为 。TIF 文件(图像文件格式)和 。AVI 文件(视频文件格式)。

结果

iDISCO¹⁴和 uDISCO¹³结合高分辨率 CLSM,可深入了解脑组织 RABV 感染和周围细胞环境的时空分辨率和可塑性。

使用RABV磷蛋白(P)的免疫染色,在小鼠大脑的厚部分可以可视化受感染神经元细胞的复杂层(图3)。随后,可以重建采集图像堆栈的无缝 3D 投影(图 3A、B、右侧面板;动画图 1?...

讨论

近年来组织清除技术的复苏和进一步发展^{2、3、4、5、6、7、89,10,11,12,13,}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500