Imagerie 3D haute résolution de l'infection par le virus de la rage dans un tissu cérébral éclairci par solvant

Résumé

Les nouvelles techniques de compensation des tissus immunostaining-compatibles comme l'imagerie 3D ultime des organes éclaircis par solvant permettent la visualisation 3D de l'infection cérébrale du virus de la rage et de son environnement cellulaire complexe. D'épaisses tranches de tissu cérébral étiquetées par anticorps sont rendues optiquement transparentes afin d'augmenter la profondeur d'imagerie et de permettre l'analyse 3D par microscopie de balayage laser confocal.

Résumé

La visualisation des processus d'infection dans les tissus et les organes par immunolabeling est une méthode clé dans la biologie moderne d'infection. La capacité d'observer et d'étudier la distribution, le tropisme et l'abondance des agents pathogènes à l'intérieur des tissus d'organes fournit des données cruciales sur le développement et la progression de la maladie. À l'aide de méthodes de microscopie conventionnelles, l'immunolabeling est principalement limité aux sections minces obtenues à partir d'échantillons incrustés de paraffine ou congelés. Cependant, le plan d'image 2D limité de ces sections minces peut mener à la perte de l'information cruciale sur la structure complexe d'un organe infecté et le contexte cellulaire de l'infection. Les techniques modernes de compensation des tissus multicolores et immunostaining-compatibles offrent maintenant un moyen relativement rapide et peu coûteux d'étudier des piles d'images 3D à fort volume de tissus d'organes infectés par le virus. En exposant le tissu à des solvants organiques, il devient optiquement transparent. Cela correspond aux indices de réfraction de l'échantillon et conduit finalement à une réduction significative de la diffusion de la lumière. Ainsi, en combinaison avec de longs objectifs de distance de travail libre, de grandes sections de tissu jusqu'à 1 mm de taille peuvent être imaged par microscopie de balayage laser confocal e conthique conventionnelle (CLSM) à haute résolution. Ici, nous décrivons un protocole pour appliquer l'imagerie de tissu profond après dégagement de tissu pour visualiser la distribution de virus de rage dans les cerveaux infectés afin d'étudier des sujets comme la pathogénie de virus, la propagation, le tropisme, et la neuroinvasion.

Introduction

Les techniques d'histologie conventionnelles reposent principalement sur de fines sections de tissus d'organes, qui peuvent intrinsèquement fournir seulement des aperçus 2D dans un environnement 3D complexe. Bien que faisable en principe, la reconstruction 3D à partir de sections minces en série nécessite des pipelines techniques exigeants à la fois pour le découpage et l'alignement silico suivant des images acquises¹. En outre, la reconstruction transparente des z-volumes après le découpage de microtome est critique car les artefacts mécaniques et computationnels peuvent rester en raison de l'enregistrement d'image sous-optimal causé par des plans d'image non overlapping, les variations de coloration, et physique destruction des tissus par, par exemple, la lame du microtome. En revanche, le découpage optique pur des échantillons intacts de tissu épais permet l'acquisition des plans d'image de chevauchement (suréchantillonnage) et, de ce fait, facilite la reconstruction 3D. Ceci, à son tour, est très bénéfique pour l'analyse des processus d'infection dans les populations cellulaires complexes (par exemple, les réseaux neuronaux dans le contexte des cellules gliales et immunitaires environnantes). Cependant, les obstacles inhérents des sections épaisses de tissu incluent la diffusion légère et la pénétration limitée d'anticorps dans le tissu. Ces dernières années, une variété de techniques a été développée et optimisée pour surmonter ces problèmes^{2,3,4,5,6,7,8 , 9} (en) ^{, 10} Ans et plus ^{, 11} Ans, états-unis ( ^{, 12 Ans, états-unis , 13}. Essentiellement, les tissus cibles sont devenus optiquement transparents par traitement avec soit aqueuse^2,3,4,5,6^{,7 ,8,9} ou à base de solvants organiques^10,11,12,13 solutions. L'introduction de 3DISCO (imagerie 3D d'organes éclaircis par solvant)^11,12 et son successeur uDISCO (imagerie 3D ultime d'organes éclaircis par solvant)¹³ a fourni un outil relativement rapide, simple et peu coûteux avec d'excellentes capacités de compensation. Les principaux constituants du protocole de compensation sont les solvants organiques tert-butanol (TBA), l'alcool de benzyl (BA), le benzoate de benzyl (BB), et l'éther de diphenyl (DPE). Le développement et l'ajout d'iDISCO (imagerie 3D immunolabeling d'organes éclaircis par solvant)¹⁴, un protocole d'immunostaining compatible, ont constitué un autre avantage par rapport aux méthodes existantes et ont permis l'étiquetage des tissus profonds des antigènes d'intérêt, ainsi que le stockage à long terme d'échantillons immunostained. Ainsi, la combinaison de l'iDISCO¹⁴ et de l'uDISCO¹³ permet l'imagerie à haute résolution de protéines étiquetées par anticorps dans de grandes sections de tissus (jusqu'à 1 mm) à l'aide du CLSM conventionnel.

La préservation de la structure complexe d'un organe dans les trois dimensions est particulièrement importante pour le tissu cérébral. Les neurones constituent une sous-population cellulaire très hétérogène avec des morphologies 3D très diverses basées sur leurs projections neurites (revue par Masland¹⁵). En outre, le cerveau se compose d'un certain nombre de compartiments et de compartiments, chacun composé de différentes sous-populations cellulaires et les ratios de celui-ci, y compris les cellules gliales et les neurones (examiné par von Bartheld et al.¹⁶). En tant que virus neurotrope, le virus de la rage (RABV, examiné par Fooks et coll.¹⁷) infecte principalement les neurones, utilisant leurs machines de transport pour voyager dans la direction rétrograde le long des axones du site primaire de l'infection au système nerveux central (SNC). Le protocole décrit ici (figure 1A) permet la détection et la visualisation immunostaining-assistées des cellules RABV et RABV-infectées dans de grandes piles cohérentes d'image obtenues à partir du tissu cérébral infecté. Cela permet une évaluation impartiale et 3D à haute résolution de l'environnement infectieux. Il s'applique aux tissus cérébraux d'une variété d'espèces, peut être effectué immédiatement après la fixation ou après le stockage à long terme d'échantillons de paraformaldéhyde (PFA), et permet le stockage et la réimagerie des échantillons tachés et défrichés pendant des mois.

Protocole

Le matériel cérébral archivé RABV-infecté et PFA-fixe a été employé. Les études expérimentales animales respectives ont été évaluées par le comité responsable de soins, d'utilisation et d'éthique des animaux du Bureau d'État de l'agriculture, de la sécurité alimentaire et de la pêche en Mecklembourg-Poméranie occidentale (LALFF M-V) et ont obtenu l'approbation avec les autorisations 7221.3-2.1-002/11 (souris) et 7221.3-1-068/16 (ferrets). Les soins généraux et les méthodes utilisées dans les expériences sur les animaux ont été effectués conformément aux lignes directrices approuvées.

CAUTION: Ce protocole utilise diverses substances toxiques et / ou nocives, y compris pfA, méthanol (MeOH), peroxyde d'hydrogène (H₂O₂), azide de sodium (NaN₃), TBA, BA, BB, et DPE. MeOH et TBA sont très inflammables. Évitez l'exposition en portant un équipement de protection individuelle approprié (une blouse de laboratoire, des gants et une protection oculaire) et en menant des expériences dans une hotte de fumée. Recueillir les déchets séparément dans des conteneurs appropriés et les éliminer conformément à la réglementation locale. Le virus de la rage est classé comme agent pathogène de niveau de biosécurité (BSL)-2 et peut donc généralement être manipulé dans des conditions De BSL-2. Certaines activités, y compris les procédures qui peuvent générer des aérosols, travailler avec des concentrations élevées de virus, ou de travailler avec de nouveaux lyssavirus, peuvent nécessiter la classification BSL-3. La prophylaxie pré-exposition est recommandée pour le personnel à risque élevé, y compris les gardiens d'animaux et les travailleurs de laboratoire^18,19. Consultez les règlements des autorités locales.

1. Fixation du tissu cérébral et de la sectionnement

1. Fixez des échantillons de cerveau dans un volume approprié de 4 % de PFA dans la saline tamponnée en phosphate (PBS [pH 7.4]) pendant au moins 48 h à 4 oC (avec un rapport tissu-fixatif approximatif de 1:10 [v/v]).
2. Laver les échantillons de tissus 3x dans le PBS pendant au moins 30 min chaque lavage et les stocker dans 0,02% NaN₃/PBS à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
3. Sectionnez le tissu en sections de 1 mm d'épaisseur à l'aide d'un vibratome (taux d'alimentation de la lame : 0,3 à 0,5 mm/s, amplitude : 1 mm, épaisseur de la tranche : 1 000 m).
4. Pour conserver la séquence de tranche correcte, entreposez chaque section de tissu séparément dans un puits d'une plaque de culture de cellules multiwell. Ajouter 0,02 % NaN₃/PBS et conserver les sections de tissus à 4 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées.

2. Prétraitement d'échantillon avec le méthanol

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d'incubation avec une oscillation douce et, si elle n'est pas indiquée autrement, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Le prétraitement de l'échantillon sert à améliorer la diffusion des anticorps et à réduire l'autofluorescence tissulaire par exposition à MeOH et H₂O₂, respectivement¹⁴.

1. Préparer 20 % (v/v), 40 %, 60 % et 80 % de solutions MeOH dans de l'eau distillée. Par exemple, pour 20 % de MeOH, ajouter 10 ml de 100 % de MéOH à 40 ml d'eau distillée dans un récipient étanche approprié et mélanger en l'inversant.
2. Transférer les échantillons à des récipients de taille raisonnable (p. ex., tubes de réaction de 5 ml). Prenez soin d'utiliser des matériaux chimiquement résistants aux réactifs utilisés dans ce protocole. Par exemple, notez que même si le polypropylène convient, le polystyrène ne l'est pas.
   REMARQUE : Les spécifications de volume de ce protocole se réfèrent à des tubes de réaction de 5 ml. Si un autre navire est utilisé, ajustez les volumes en conséquence.
3. Incuber les échantillons en 4 ml de chaque concentration de la série préparée de solutions MeOH en ordre croissant pour 1 h chacun.
4. Incuber les échantillons 2x pour 1 h chacun en pur (100%) MeOH.
5. Refroidir les échantillons à 4 oC (p. ex., dans un réfrigérateur sécuritaire pour le laboratoire).
6. Préparer une solution de blanchiment (5% H₂O₂ dans MeOH) en diluant, par exemple, une solution de 30% H₂O₂ stock à 1:6 en pur (100%) MeOH, et réfrigérer à 4 oC.
7. Retirer le 100% MeOH des échantillons réfrigérés et ajouter 4 ml de solution de blanchiment préréfrigérée (5% H₂O₂ dans MeOH). Incuber toute la nuit à 4 oC.
8. Échangez la solution de blanchiment pour 4 ml de 80 % De MeOH et incubez-vous pendant 1 h. Continuez d'utiliser la série préparée de solutions MeOH en ordre décroissant pour 1 h chacune jusqu'à ce que les échantillons aient été incubés pendant 1 h dans 4 ml de 20 % de MeOH.
9. Laver les échantillons 1x pour 1 h avec 4 ml de PBS.

3. Immunostaining

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d'incubation avec une oscillation douce et, si elle n'est pas indiquée autrement, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Pour prévenir la croissance microbienne, ajoutez NaN₃ à une concentration finale de 0,02 % aux solutions de cette section. Les échantillons de tissus sont encore perméabilisés par le traitement avec des détergents nonionic Triton X-100 et Tween 20. Le sérum normal est utilisé pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique. Glycine et héparine sont ajoutés pour réduire le fond d'immunolabeling¹⁴.

1. Laver les échantillons 2x pour 1 h chacun dans 4 ml de 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Perméabilisez les échantillons pendant 2 jours à 37 oC avec 4 ml de 0,2 % Triton X-100/20 % DMSO/0,3 M glycine/PBS.
3. Bloquer la liaison non spécifique des anticorps en couvant les échantillons pendant 2 jours à 37 oC dans 4 ml de 0,2 % De 0,2 % Triton X-100/10 % DMSO/6 % sérum normal/PBS.
   REMARQUE : Utilisez le sérum normal de la même espèce que l'anticorps secondaire a été élevé pour obtenir des résultats de blocage idéaux.
4. Incuber les échantillons dans 2 ml de solution d'anticorps primaire (3 % de sérum normal/5 % DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 avec héparine] - anticorps/anticorps primaires) pendant 5 jours à 37 oC. Rafraîchissez la solution d'anticorps primaire après 2,5 jours.
   1. Pour PTwH, reconstituer le sel de sodium héparindans dans de l'eau distillée pour faire une solution de stock de 10 mg/mL (stocker cette solution, aliquoted, à 4 oC). Ajouter la solution de stock à 0,2% Tween 20/PBS à une concentration finale de 10 g/mL.
      REMARQUE : Le choix de la dilution correcte des anticorps peut nécessiter une optimisation. En général, les concentrations standard d'immunohistochimie sont un bon point de départ.
5. Laver les échantillons pendant 1 jour dans 4 ml de PTwH, échanger le tampon de lavage au moins 4x à 5x au cours de la journée et laisser le lavage final pendant la nuit.
6. Incuber les échantillons dans 2 ml de solution d'anticorps secondaire (3 % de sérum normal/PTwH - anticorps/anticorps secondaires) pendant 5 jours à 37 oC. Rafraîchissez la solution d'anticorps secondaire après 2,5 jours.
   1. Diluer les anticorps/anticorps secondaires à 1:500 dans la solution secondaire d'anticorps (c.-à-d., 4 l dans 2 mL).
7. Laver les échantillons pendant 1 jour comme décrit à l'étape 3.5, en laissant le lavage final pendant la nuit.

4. Taches nucléaires

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d'incubation avec une oscillation douce et, si elle n'est pas indiquée autrement, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Si aucune coloration nucléaire n'est requise ou si le spectre de longueur d'onde/émission d'excitation de TO-PRO-3 est nécessaire pour l'excitation ou la détection d'un autre fluorophore, sautez cette étape.

1. Diluer la tache d'acide nucléique TO-PRO-3 à 1:1,000 dans PTwH et couver les échantillons dans 4 ml de solution de coloration nucléaire pendant 5 h.
2. Laver les échantillons pendant 1 jour comme décrit à l'étape 3.5, en laissant le lavage final pendant la nuit.
   REMARQUE : Après les lavages, les échantillons peuvent être stockés dans le PBS à 4 oC jusqu'à ce que le défrichement optique.

5. Défrichement des tissus

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d'incubation avec une oscillation douce et, si elle n'est pas indiquée autrement, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Les échantillons de tissus sont déshydratés dans une série de solutions TBA graduées. Comme l'immunostaining nécessite des solutions aqueuses, toutes les procédures de coloration doivent être terminées avant le défrichement des tissus. Le dégagement optique et l'appariement d'index réfractif sont réalisés par traitement avec un mélange de BA, BB, et DPE. La solution de compensation est complétée par DL-tocophérol comme antioxydant¹³.

1. Préparer 30 % (v/v), 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 96 % des solutions TBA dans l'eau distillée. Par exemple, pour 30 % d'ACT, ajouter 15 ml de 100 % de TBA à 35 ml d'eau distillée dans un récipient étanche approprié et mélanger par inversion.
   REMARQUE : L'ACT a un point de fusion de 25 à 26 oC; ainsi, il tend à être solide à la température ambiante. Afin de préparer des solutions TBA, chauffer la bouteille bien scellée à 37 oC dans un incubateur ou un bain d'eau.
2. Déshydrater les échantillons avec 4 ml de chaque concentration de la série préparée de solutions TBA en ordre croissant pour 2 h chacune. Laissez le 96% TBA sur la nuit.
3. Déshydrater davantage les échantillons en pur (100%) TBA pour 2 h.
4. Préparer la solution de compensation BABB-D15.
   REMARQUE: BABB-D15 est une combinaison de BA et BB (BABB) qui est mélangé avec DPE à un rapport de x:1, où x est spécifié dans le nom de la solution, dans ce cas 15.
   1. Pour BABB, mélanger une partie BA avec deux parties BB.
   2. Mélanger BABB et DPE à un ratio de 15:1.
   3. Ajouter 0,4 vol% DL-Tocophérol (vitamine E).
      REMARQUE : Par exemple, pour 20 ml de BABB-D15, mélangez 6,25 ml de BA avec 12,5 ml de BB. Ajouter 1,25 ml de DPE et le compléter avec 0,08 ml de DL-tocophérol.
5. Effacer les échantillons dans la solution de compensation jusqu'à ce qu'ils soient optiquement transparents (2 à 6 h).
6. Les échantillons peuvent être stockés à 4 oC dans BABB-D15, à l'abri de la lumière, jusqu'à ce que le montage et l'imagerie.

6. Montage d'échantillon

1. À l'aide d'une imprimante 3D, imprimez la chambre d'imagerie et le couvercle (matériel : copolyester [CPE], buse : 0,25 mm, hauteur de la couche : 0,06 mm, épaisseur du mur : 0,88 mm, nombre de murs : 4, remplissage : 100 %, pas de structure de support ; le correspondant . Le fichier STL se trouve dans les documents supplémentaires de ce protocole).
2. Assembler la chambre d'imagerie (figure 2).
   1. Montez un couvercle rond (diamètre : 30 mm) sur la chambre d'imagerie avec du caoutchouc en silicone RTV-1 (une pièce-température-vulcanisation). Retirer l'excès de caoutchouc de silicone à l'eau et guérir toute la nuit.
   2. Montez un couvercle rond (diamètre : 22 mm) sur le couvercle avec du caoutchouc en silicone RTV-1. Retirer l'excès de caoutchouc de silicone à l'eau et guérir toute la nuit.
3. Placez l'échantillon dans une chambre d'imagerie, ajoutez un petit volume de BABB-D15 et insérez le couvercle. Remplissez la chambre de BABB-D15 à travers l'en-plein, à l'aide d'une aiguille hypodermique (27 G x 3/4 po [0,40 mm x 20 mm]).
4. Branchez l'inlet et scellez la chambre d'imagerie avec du caoutchouc en silicone RTV-1. Cure toute la nuit dans l'obscurité.

7. Imagerie et traitement d'image

1. Configurez l'acquisition d'image en sélectionnant les lignes laser respectives pour correspondre aux fluorophores utilisés. Ajuster les plages de détection de chaque détecteur pour éviter le chevauchement du signal entre les canaux.
   REMARQUE : Les plages de détection exemplaires pour Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 et TO-PRO-3 sont de 500 à 550 nm, 590 à 620 nm et 645 à 700 nm, respectivement.
2. Choisissez les paramètres d'acquisition, définissez la bordure supérieure et inférieure de la z-stack et acquérez la pile d'images.
   REMARQUE : Les paramètres d'acquisition exemplaires sont un scan séquentiel d'une taille de pixel de 60-90 nm, une taille z-étape de 0,5 m, une moyenne de ligne de 1, une vitesse d'analyse de 400 Hz, et une taille de sténopé de 1 unité Airy.
3. Traiter la pile d'images à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image approprié (p. ex., Fidji) pour générer des projections 3D ou effectuer des analyses approfondies.
   REMARQUE : En raison de la grande taille des fichiers d'image acquis, l'utilisation d'un poste de travail est habituellement nécessaire.
   1. Ouvrez le fichier d'acquisition ou d'image (s) aux Fidji (Fichier Ouvert à l'ouvert Sélectionnez les fichiers).
      1. Si vous utilisez, par exemple, . Fichiers LIF, sélectionnez ou désélectionnez les options souhaitées dans la fenêtre de dialogue Bio-Formats. Afficher la pile avec Hyperstack. A part cela, aucune sélection ou tique spécifique n'est nécessaire. Appuyez sur OK.
      2. Si le fichier contient plusieurs piles d'images, sélectionnez ceux à analyser et confirmez en appuyant sur OK.
   2. Effectuer la correction de l'eau de Javel en divisant l'image fusionnée en canaux individuels (Image La couleur Outil de canaux, puis sélectionnez Plus Split Channels). Pour chaque canal, sélectionnez correction de l'eau de Javel(Image Ajuster Correction de blanchiment) et choisissez Simple Ratio (intensité de fond : 0,0).
      REMARQUE : Dans certains cas, par exemple, lorsqu'il n'y a pas de décomposition linéaire du signal ou que le signal est trop faible dans l'ensemble, Simple Ratio peut échouer. Sinon, essayez Exponential Fit ou sautez la correction de l'eau de Javel.
   3. Ajuster la luminosité et le contraste pour chaque canal à l'aide des curseurs (Image Ajuster Luminosité de l'année Contraste).
   4. Fusionner les canaux (Image La couleur Merge Channels), faire un composite (Image La couleur Outil de canaux, puis sélectionnez Plus Make Composite), et le convertir en format RGB (Image La couleur Outil de canaux, puis sélectionnez Plus Convertir en RGB).
   5. Si nécessaire, redimensionnez la pile d'images pour réduire le temps de calcul et la taille du fichier (Image Ajuster Taille,les deux options cochées plus interpolation bilinear).
   6. Générer une projection 3D (Image Piles ( Projet 3D). Choisissez Brightest Point comme méthode de projection et configurez l'espacement de tranche pour correspondre à la taille z-step de la pile d'image acquise. Pour une qualité maximale, fixez l'incrément de l'angle de rotation à 1 et activez l'interpolation. Modifier la rotation totale, les seuils de transparence et l'opacité au besoin.
   7. Si nécessaire, réajuster le contraste et la luminosité en reconverti la projection 3D en format 8 bits (Image Type de type 8 bits). Utilisez les curseurs respectifs (Image Ajuster Luminosité de l'année Contraste) et reconvertir la pile d'images en format RGB tel que décrit à l'étape 7.3.4.
   8. Enregistrer la projection 3D comme . Fichier TIF (format de fichier d'image) et . Fichier AVI (format de fichier vidéo).

Résultats

La combinaison de l'iDISCO¹⁴ et de l'uDISCO¹³ couplée à la Haute résolution CLSM fournit des aperçus profonds dans la résolution spatiotemporale et la plasticité de l'infection DE RABV du tissu cérébral et le contexte cellulaire environnant.

En utilisant l'immunostaining de la phosphoprotéine RABV (P), des couches complexes de cellules neuronales infectées peuvent être visualisées dans des sections épaisses du cerveau de souris (

Discussion

La résurgence et le développement ultérieur des techniques de défrichement des tissus au cours des dernières années^{2,3,4,5,6,7,8, 9} (en) ^{, 10} Ans et plus ^{, 11} Ans, états-unis (

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500