Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

Özet

Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.

Özet

Enfeksiyon süreçlerinin doku ve organlarda immunolabeling tarafından görselleştirilmesi, modern enfeksiyon biyolojisinde önemli bir yöntemdir. Organ dokularının içindeki dağıtım, tropizm ve patojenlerin zenginliğini gözlemlemek ve incelemek yeteneği, hastalık gelişimi ve ilerlemesi hakkında önemli veriler sağlar. Konvansiyonel mikroskopi yöntemlerini kullanarak immünolabeling çoğunlukla parafin-katıştırılmış veya dondurulmuş örneklerden elde edilen ince bölümlerle sınırlıdır. Ancak, bu ince bölümlerin sınırlı 2D görüntü düzlemi, virüslü bir organın karmaşık yapısı ve enfeksiyonun hücresel bağlamında önemli bilgi kaybına yol açabilir. Modern çok renkli, immünostatif uyumlu doku Temizleme teknikleri şimdi virüs enfekte organ dokusu yüksek hacimli 3D görüntü yığınları incelemek için nispeten hızlı ve ucuz bir yol sağlar. Dokuyu organik çözücülere maruz bırakarak optik olarak şeffaflaşır. Bu, numunenin refraktif endeksler ile eşleşir ve sonunda ışık saçılma önemli bir azalma yol açar. Böylece, uzun serbest çalışma mesafesi hedefleri ile birlikte, yüksek çözünürlükte geleneksel Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile boyutu 1 mm 'ye kadar büyük doku bölümleri görüntülenmiş olabilir. Burada, virüs patogenezi, Spread, tropizm ve nöroinvazyon gibi konuları incelemek amacıyla enfekte beyinlerde kuduz virüsü dağıtımını görselleştirmek için doku temizledikten sonra derin doku görüntülemenin uygulanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

Konvansiyonel Histoloji teknikleri çoğunlukla karmaşık bir 3D ortama sadece 2D Öngörüler sağlayabilen organ dokularının ince bölümlerine güveniyor. Prensip olarak uygulanabilir olsa da, seri ince bölümlerden 3D yeniden yapılanma hem Dilimleme ve elde edilen görüntülerin silico hizalama sonraki için teknik boru hatları talep gerektirir¹. Ayrıca, mikrotome Dilimleme işleminden sonra z-hacimlerin kesintisiz yeniden oluşturulması, hem mekanik hem de Hesaplamalı eserler nedeniyle örtüşmeyen görüntü düzlemleri, boyama varyasyonları ve fiziksel doku imha, örneğin, mikrotome bıçak. Buna karşılık, bozulmamış kalın doku örneklerinin saf optik Dilimleme çakışan görüntü düzlemleri (aşırı örnekleme) satın alma ve böylece, 3D yeniden yapılanma kolaylaştırır sağlar. Bu, sırayla, karmaşık hücre nüfuslarında enfeksiyon süreçlerinin analizi için son derece yararlıdır (örneğin, çevreleyen glial ve bağışıklık hücrelerinin bağlamında nöronal ağlar). Ancak, kalın doku bölümlerinin doğal engelleri doku içine ışık saçılma ve sınırlı antikor penetrasyonunu içerir. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirilmiştir ve bu sorunların üstesinden gelmek için optimize edilmiştir^{2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10} ' dan fazla ^{, 11} ' i ^{, 12} tane ^{, 13}. esasen, hedef dokular, sulu^2,3,4,5,6,7 ile tedavi ile optik şeffaf olarak dönüşmüştür ^,8,9 veya organik solvent bazlı^10,11,12,13 çözümler. 3disco (solvent temizlenmiş organların 3B görüntüleme)^11,12 ve onun halefi udisco (solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme) tanıtımı¹³ , nispeten hızlı, basit ve ucuz bir araç sağladı mükemmel temizleme yetenekleri. Temizleme protokolünün ana bileşenleri organik çözücüler tert-Butanol (TBA), Benzil alkol (BA), Benzil benzoat (BB) ve difenil eter (DPE) ' dir. Geliştirme ve iDISCO eklenmesi (solvent temizlenmiş organların immünolabeling-etkin 3D görüntüleme)¹⁴, uyumlu bir immünostat protokolü, mevcut yöntemler üzerinde başka bir avantaj oluşturdu ve antijenlerin derin doku etiketleme etkin hem de immünosteli numunelerin uzun süreli depolanması. Böylece, iDISCO¹⁴ ve udisco¹³ kombinasyonu, geleneksel CLSM kullanarak büyük doku bölümlerinde (1 mm 'ye kadar) antikor etiketli proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin sağlar.

Bir organın her üç boyutta kompleks yapısının korunması özellikle beyin dokusu için önemlidir. Nöronlar çok çeşitli 3D morfolojileri nörit projeksiyonlarına dayalı çok heterojen hücresel alt nüfus oluşturur (Masland tarafından gözden¹⁵). Ayrıca beyin, glial hücreler ve nöronlar (von Bartheld ve al.¹⁶tarafından gözden geçirilmiş) dahil olmak üzere farklı hücresel alt nüfus ve oranlardan oluşan bir dizi bölmeler ve alt bölmesinden oluşur. Bir nörotropik virüs olarak, kuduz virüsü (rabv, Fooks ve al.¹⁷tarafından gözden geçirilmiş) öncelikle nöronlar bozar, kendi taşıma makineleri kullanarak orta sinir sistemi (CNS) enfeksiyon birincil sitesinden akons boyunca retrograd yönde seyahat etmek. Burada açıklanan protokol (Şekil 1A) enfekte beyin dokusundan elde edilen büyük, tutarlı görüntü yığınlarında rabv ve rabv enfekte hücrelerin immünostal destekli algılama ve görselleştirme için izin verir. Bu, enfeksiyon ortamının tarafsız, 3D yüksek çözünürlüklü değerlendirmesini sağlar. Bu türlerin çeşitli beyin dokusu için uygulanabilir, tespit sonra hemen yapılabilir veya civarında formaldehite numunelerin uzun süreli depolama sonra (PFA), ve depolama ve ay için lekeli ve temizlenmiş numunelerin yeniden görüntüleme sağlar.

Protokol

RABV-enfekte, PFA-sabit arşivlenmiş beyin malzemesi kullanıldı. İlgili hayvan deneysel çalışmaları Mecklenburg-Batı Pomerania (LALFF M-V) Devlet Tarım, gıda güvenliği ve balıkçılık eyalet ofisi sorumlu hayvan bakımı, kullanımı ve Etik Komitesi tarafından değerlendirildi ve izinler ile onay kazandı 7221.3-2.1-002/11 (fareler) ve 7221.3-1-068/16 (Ferrets). Hayvan deneylerinde kullanılan genel bakım ve Yöntemler onaylanmış yönergelere göre yürütülmüştür.

DIKKAT: Bu protokol PFA, metanol (MeOH), hidrojen peroksit (H₂O₂), sodyum azid (NaN₃), TBA, ba, BB ve DPE dahil olmak üzere çeşitli toksik ve/veya zararlı maddeler kullanır. MeOH ve TBA son derece yanıcı. Uygun kişisel koruyucu ekipman (bir laboratuar ceket, eldiven ve göz koruması) giyen ve bir duman kaputu deneyler yaparak maruz kalma kaçının. Uygun konteynerlerde ayrı olarak atık toplayın ve yerel yönetmeliklere göre bertaraf edin. Kuduz virüsü bir Biyogüvenlik seviyesi olarak sınıflandırılır (BSL)-2 patojen ve bu nedenle, genellikle BSL-2 koşulları altında ele alınabilir. Aerosoller oluşturabilir, yüksek virüs konsantrasyonlarına sahip veya yeni lyssaviruses ile çalışabilir prosedürler de dahil olmak üzere bazı faaliyetler, BSL-3 sınıflandırma gerektirebilir. Ön pozlama profilaksisi, animal Caretakers ve laboratuar işçileri de dahil olmak üzere yüksek riskli personel için tavsiye edilir^18,19. Yerel yetki yönetmeliklerine bakın.

1. beyin dokusunun ve sekleme fikreme

1. Beyin örneklerini, 4 °C ' de en az 48 h (1:10 [v/v] ' nin yaklaşık doku-fikratif oranı ile) için fosfat-tamponlu tuz (PBS [pH 7,4]) içinde% 4 PFA uygun bir hacimde düzeltin.
2. PBS 'de 3 adet doku örneğini en az 30 dakika yıkayın ve% 0,02 NaN₃/PBS 'de 4 °c ' de kullanıma kadar saklayın.
3. Dokuyu bir vibratome (Blade ilerleme oranı: 0.3 – 0.5 mm/s, genlik: 1 mm, dilim kalınlığı: 1.000 μm) kullanarak 1 mm kalınlığında bölüme yerleştirin.
4. Doğru dilim sırasını korumak için, her doku bölümünü ayrı bir multiwell hücre kültürü plakasının iyi olarak saklayın. 0,02% NaN₃/PBS ekleyin ve doku bölümlerini kullanım kadar 4 °c ' de saklayın.

2. metanol ile numune ön tedavisi

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Örnek ön tedavi, antikor difüzyon iyileştirilmesi ve MeOH ve H₂O₂, sırasıyla¹⁴pozlama ile doku otofloresans azaltılması genel amacı hizmet vermektedir.

1. Damıtılmış suda% 20 (v/v),% 40,% 60 ve% 80 MeOH çözeltileri hazırlayın. Örneğin,% 20 MeOH için, 10 mL 100% MeOH 40 mL damıtılmış su uygun bir mühürlenebilir gemi ve mix için ters çevirme ile ekleyin.
2. Numuneleri makul boyutta gemiler (örn. 5 mL reaksiyon tüpleri) ile aktarın. Bu protokolde kullanılan reaktiflere kimyasal olarak dayanıklı materyalleri kullanmak için özen yapın. Örneğin, Polipropilen uygun iken, polistiren değildir unutmayın.
   Not: bu protokoldeki hacim spesifikasyonları 5 mL reaksiyon tüpüne başvurur. Farklı bir gemi kullanılırsa, hacimleri buna göre ayarlayın.
3. Her biri 1 h için artan düzende MeOH çözümlerinin hazırlanmış serisinin her konsantrasyonunun 4 mL 'de örneklerini inküt.
4. Her biri saf (% 100) 1 saat için 2x örnekleri inküt MeOH.
5. Numuneleri 4 °C ' ye (örn. laboratuar-güvenli buzdolabında) soğutur.
6. Hazırlamak beyazlatma çözeltisi (5% H₂o₂ içinde MeOH) tarafından, örneğin, seyreltme bir 30% h₂o₂ stok çözüm 1:6 saf (100%) Ve 4 °C ' de sakin ol.
7. 100% MeOH 'ini soğutulmuş örneklerden çıkarın ve 4 mL prechilled beyazlatma çözeltisi (% 5 H₂O₂ in MeOH) ekleyin. Gece 4 °C ' de inküyün.
8. 80% MeOH 4 mL için beyazlatma solüsyonu değişimi ve 1 h için inkük. 1 h her biri için azalan düzende MeOH çözümleri hazırlanmış dizi kullanmaya devam edin örnekleri 1 saat 4 mL içinde% 20 MeOH.
9. 4 mL PBS ile 1 saat için 1x örnekleri yıkayın.

3. immünostakajlı

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Mikrobiyal büyümesini önlemek için, bu bölümdeki çözümlere% 0,02 oranında son konsantrasyona NaN₃ ekleyin. Doku örnekleri, Noniyonik deterjanlar Triton X-100 ve Tween 20 ile tedavi ile daha fazla geçirgen. Normal serum, spesifik olmayan antikor bağlayıcılığı engellemek için kullanılır. Gcine ve heparin immünolabeling arka plan azaltmak için eklenir¹⁴.

1. 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS 'de her biri 1 saat için 2x örnekleri yıkayın.
2. Örnekleri 2 gün 37 °C ' de 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M Glycine/PBS ile geçirebilin.
3. 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/% 6 normal serum/PBS olarak 37 °C ' de 2 gün boyunca numuneleri kulyatlayarak antikorların spesifik olmayan bağlayıcılığı engelleyin.
   Not: İkinci antikor ideal engelleme sonuçları elde etmek için yükseltilmiş aynı türden normal serum kullanın.
4. Numuneleri 2 mL primer antikor çözeltisi içinde (3% normal serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 ile heparin] + primer antikor/antikorlar) 37 °C ' de 5 gün boyunca inküserin. 2,5 gün sonra primer antikor çözümünü yenileyin.
   1. PTwH için, 10 mg/mL stok çözeltisi yapmak için distile suda heparin sodyum tuzunu yeniden oluşturur (Bu çözümü 4 °C ' de yer alan bir şekilde saklayın). 10 μg/mL 'Lik son konsantrasyona% 0,2 ara 20/PBS 'ye stok çözümünü ekleyin.
      Not: doğru antikor seyreltme seçiminde optimizasyon gerekebilir. Genel olarak, standart immünhistokimya konsantrasyonları iyi bir başlangıç noktasıdır.
5. Numuneleri 1 gün boyunca 4 mL PTwH 'de yıkayın, yıkama tamponunu gün boyunca en az 4X – 5x olarak değiş tokuş yapın ve gecede son yıkamayı bırakınız.
6. Numuneleri 2 mL ikincil antikor çözeltisi içinde (% 3 normal serum/PTwH + ikincil antikor/antikorlar) 37 °C ' de 5 gün boyunca inküserin. 2,5 gün sonra ikincil antikor çözümünü yenileyin.
   1. Sekonder antikor/antikorları 1:500 at ikincil antikor çözeltisi (örn., 2 mL 'de 4 μL) seyreltin.
7. Numuneleri 1 gün 3,5 adımda açıklandığı gibi yıkayın, son yıkamayı gecede bırakınız.

4. nükleer boyama

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Hiçbir nükleer boyama gerekli veya uyarılma dalga boyu/emisyon spektrum TO-PRO-3 uyarılma veya başka bir fluorophore tespiti için gereklidir, bu adımı atlayın.

1. PTwH içinde 1:1000 ' de nükleik asit lekesini-PRO-3 ' e seyreltin ve 5 h için 4 mL nükleer boyama çözeltisi içinde numuneleri inkük.
2. Numuneleri 1 gün 3,5 adımda açıklandığı gibi yıkayın, son yıkamayı gecede bırakınız.
   Not: yıkama işleminden sonra, örnekler optik temizleninceye kadar 4 °C ' de PBS 'de depolanabilir.

5. doku Temizleme

Not: tüm inkübasyon adımlarını nazik salınımla ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında gerçekleştirin. Örnekleri ışığa karşı koruyun. Doku numuneleri, kademeli bir TBA çözeltileri serisinde susuz kalmış durumdadır. İmmünosteme sulu çözümler gerektirdiğinden, tüm boyama prosedürleri doku temizliğiyle önce bitmiş olmalıdır. Optik boşluk ve Refraktif endeks eşleştirme, BA, BB ve DPE karışımı ile tedavi ile elde edilir. Temizleme çözümü, bir antioksidan olarak DL-α-tocopherol ile desteklenmektedir¹³.

1. Damıtılmış suda% 30 (v/v),% 50,% 70,% 80,% 90 ve% 96 TBA çözeltileri hazırlayın. Örneğin,% 30 TBA için, uygun bir mühürlenebilir damar içinde 35 mL distile su için% 100 TBA 15 mL ekleyin ve ters çevirme ile karıştırın.
   Not: TBA 'nın erime noktası 25 – 26 °C; Böylece, oda sıcaklığında katı olma eğilimindedir. TBA çözümlerini hazırlamak için, iyi mühürlü şişeyi 37 °C ' de bir kuluçba veya su banyosunda ısıtın.
2. 2 h her için artan düzende TBA çözümleri hazırlanmış serisinin her konsantrasyon 4 mL ile numuneleri kurutmak. Gece 96% TBA bırakın.
3. Numuneleri saf (% 100) daha fazla kurutmak TBA için 2 h.
4. BABB-D15 Temizleme çözümünü hazırlayın.
   Not: BABB-D15, x: 1 oranında DPE ile karışık olan BA ve BB (BABB) ' nın bir kombinasyonudur ve bu durumda 15 ' in çözümün adıyla x belirtilir.
   1. BABB için, iki parça BB ile tek parçalı BA karıştırın.
   2. 15:1 oranı ile BABB ve DPE karıştırın.
   3. Ekle 0,4 Vol% DL-α-tocopherol (vitamin E).
      Not: Örneğin, 20 mL BABB-D15 için, mix 6,25 mL, BB 12,5 mL ile BA. 1,25 mL DPE ekleyin ve 0,08 mL DL-α-tocopherol ile ek.
5. Temizleme çözeltisi içindeki numuneleri optik olarak saydam olana kadar temizleyin (2 – 6 saat).
6. Numuneler BABB-D15 ' d e 4 °C ' de saklanabilir, ışık korumalı, montaj ve görüntüleme kadar.

6. numune montajı

1. 3D yazıcı kullanarak, görüntüleme odası ve kapak baskı (malzeme: kopolyester [CPE], nozul: 0,25 mm, katman yüksekliği: 0,06 mm, duvar kalınlığı: 0,88 mm, duvar sayısı: 4, dolgu: 100%, hiçbir destek yapısı; karşılık gelen. STL dosyası bu protokolün ek malzemelerinde bulunabilir).
2. Görüntüleme bölmesini birleştirin (Şekil 2).
   1. RTV-1 (tek bileşenli oda-sıcaklık-vulkanizasyon) silikon kauçuk ile görüntüleme odasına bir yuvarlak lamel magazini (çapı: 30 mm) monte edin. Bir su ıslatılmış pamuk çubukla ile aşırı silikon kauçuk çıkarın ve gecede tedavi.
   2. RTV-1 silikon kauçuk kapağında yuvarlak lamel magazini (çap: 22 mm) monte edin. Bir su ıslatılmış pamuk çubukla ile aşırı silikon kauçuk çıkarın ve gecede tedavi.
3. Numuneyi bir görüntüleme odasına yerleştirin, küçük bir hacmine BABB-D15 ekleyin ve kapağı takın. Bir Hipodermik iğne kullanarak, giriş yoluyla BABB-D15 ile odası doldurun (27 G x 3/4 inç [0,40 mm x 20 mm]).
4. Giriş fişini takın ve görüntüleme bölmesini RTV-1 silikon kauçukla mühürleyin. Karanlık bir gecede Cure.

7. görüntüleme ve görüntü işleme

1. Kullanılan fluorophores eşleştirmek için ilgili lazer hatları seçerek görüntü edinme ayarlayın. Kanallar arasında sinyal çakışmayı önlemek için her dedektör algılama aralığını ayarlayın.
   Not: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 ve TO-PRO-3 için örnek algılama aralıkları sırasıyla 500 – 550 nm, 590 – 620 nm ve 645 – 700 nm arasındadır.
2. Edinme parametrelerini seçin, z yığınının üst ve alt kenarlığını tanımlayın ve görüntü yığınını edinin.
   Not: örnek edinme parametreleri 60-90 nm piksel boyutunda, 0,5 μm z-Step boyutu, 1 satır ortalaması, 400 Hz tarama hızı ve 1 havadar birimin iğne deliği boyutu ile sıralı bir taramalıdır.
3. 3B projeksiyonları oluşturmak veya derinlemesine analizler yapmak için uygun görüntü analiz yazılımını (örneğin, Fiji) kullanarak görüntü yığınını işlemektir.
   Not: elde edilen görüntü dosyalarının büyük boyutu nedeniyle, bir iş istasyonu kullanımı genellikle gereklidir.
   1. Fiji 'deki edinme veya görüntü dosyalarını (Dosya | Açık | Dosyaları seçin).
      1. Örneğin, kullanıyorsanız. LıF dosyaları, Bio-biçimler iletişim penceresinde istediğiniz seçenekleri seçin veya seçimini kaldırın. Hyperstackile görünüm yığını. Bunun dışında, belirli seçimler veya Ticks gerekli değildir. Oktuşuna basın.
      2. Dosya birden fazla görüntü yığını içeriyorsa, analiz edilecek olanları seçin ve oktuşuna basarak onaylayın.
   2. Birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölerek çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | Bölünmüş kanallar). Her kanal için, çamaşır suyu düzeltmesi seçin (resim | Adjust | Bleach düzeltme) ve basit oran (arka plan yoğunluğu: 0,0) seçin.
      Not: bazı durumlarda, örneğin, sinyalin doğrusal çürümesi olmadığında veya sinyal genel olarak çok zayıfsa, basit oran başarısız olabilir. Alternatif olarak, üstel Sığdır 'ı deneyin veya çamaşır suyu düzeltmesi atlayın.
   3. Kaydırıcıları kullanarak her kanal için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın (resim | Ayar | Parlaklık | Kontrast).
   4. Kanalları Birleştir (resim | Renk | Birleştirme kanalları), bileşik yapmak (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | Bileşik olun) ve RGB biçimine dönüştürmek (resim | Renk | Kanallar aracınıseçin ve daha fazla | RGB 'ye Dönüştür).
   5. Gerekirse, hesaplama süresini ve dosya boyutunu azaltmak için görüntü yığınını yeniden boyutlandırın (resim | Adjust | Boyutu, her iki seçenek de çift doğrusal interpolasyon işaretli).
   6. 3B projeksiyon oluşturma (resim | Yığınları | 3D projesi). En parlak nokta olarak projeksiyon yöntemi seçin ve dilim aralığını, elde edilen görüntü yığınının z-Step boyutuna uyacak şekilde ayarlayın. Maksimum kalite için döndürme açısı artışını 1 olarak ayarlayın ve interpolasyonu etkinleştirin. Toplam döndürme, saydamlık eşikleri ve opaklık gerektiği gibi değiştirin.
   7. Gerekirse, 3D projeksiyon geri 8-bit biçimine dönüştürerek kontrast ve parlaklık yeniden (görüntü | Türü | 8-bit). İlgili sürgüleri kullanın (resim | Adjust | Parlaklık | Kontrast) ve adım 7.3.4 ' de açıklandığı gibi görüntü yığınını RGB biçimine yeniden dönüştürün.
   8. 3D projeksiyon olarak kaydedin. TıF dosyası (görüntü dosyası formatı) ve. AVI dosyası (video dosyası formatı).

Sonuçlar

Yüksek çözünürlüklü CLSM ile birlikte iDISCO¹⁴ ve udisco¹³ kombinasyonu, beyin dokusunun ve çevreleyen hücresel bağlamda rabv enfeksiyonunun uzamsal çözünürlüğü ve plastisite içine derin öngörüler sağlar.

RABV fosfoprotein (P) immünostasyon kullanarak, enfekte nöronal hücrelerin karmaşık katmanları fare beynin kalın bölümlerde görselleştirilebilir (Şekil 3). Daha sonra, elde edilen g...

Tartışmalar

Sonyıllarda doku Temizleme tekniklerini canlandırmak ve daha da geliştirilmesi^2,3,4,5,6,7,^{8, 9 , 10} ' dan fazla ^{, 11} ' i ^{, 12} tane ^,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500