多端根结核细胞迁移的实时监测

摘要

在这里，我们提出了一个前活体混合单层培养系统，用于实时研究人类胶质瘤细胞（hGC）迁移。该模型提供了观察hGCs与隔板腔内骨髓和非骨髓化斧子之间的相互作用的能力。

摘要

胶质母细胞瘤是最具攻击性的人类癌症之一，由于广泛的细胞异质性和hGCs的迁移特性。为了更好地了解胶质瘤细胞迁移背后的分子机制，研究hGC和斧子在肿瘤微环境中的相互作用的能力至关重要。为了模拟这种细胞相互作用，我们开发了一个混合培养系统，由hGC和背根神经结膜（DRG）的斧状-寡核苷酸共培养物组成。选择DRG文化是因为它们可以有效地隔离，并可以形成长期、广泛的投影，非常适合这种性质的迁移研究。然后，在纯化大鼠DRG斧子上加入纯化大鼠寡核苷酸，并诱导至骨髓酸。在确认形成紧凑型骨髓后，hGCs最终被添加到共培养物中，并使用延时显微镜实时监测它们与DRG斧子和寡核苷酸物的相互作用。在这些条件下，hGCs形成肿瘤状的聚合结构，表达GFAP和Ki67，沿着骨髓和非骨髓化的斧道迁移，并通过伪波迪亚的形成与这些斧子相互作用。我们的前体共培养系统可用于识别hGC迁移的新型细胞和分子机制，并可能用于体外药物疗效测试。

引言

胶质母细胞瘤是人脑中最具攻击性和致命性的肿瘤之一。目前的护理标准包括肿瘤的手术切除，然后是辐射¹加上伴随的特莫佐洛米德²的辅助和辅助。即使采用这种多疗法，肿瘤复发也是不可避免的^。这部分是由于肿瘤细胞的广泛迁移性质，它侵入大脑胸痛，在大脑⁴内产生多个手指状的投影，使得完全切除的可能性不大。

近年来，胶质细胞瘤的侵略性明显增强，部分原因在于肿瘤质量^5、6中存在一群癌症干细胞，其中^7、8、抗化疗^{和放疗9、10}和形成继发性肿瘤¹¹的能力具有很高的^{迁移潜力。}当异种移植到裸鼠⁵时，GsCs能够重述原始的多克隆肿瘤。

尽管关于胶质细胞瘤遗传背景的知识丰富，但缺乏有效的体外或体内迁移模型目前阻碍了对胶质瘤细胞（GC）迁移的研究。值得注意的是，虽然由细胞和环境因素调节的胶质瘤细胞-斧理相互作用是胶质瘤入侵的核心组成部分，但据我们所知，目前没有实验系统能够模拟这些相互作用12、13、14。为了解决这一缺陷，我们开发了一种与纯化DRG的腺苷酸联合培养的原生hG的体外培养系统，该系统导致分化肿瘤标记物的表达升高，以及hGCs与骨髓化和非骨髓化纤维的广泛迁移和相互作用。这个外体平台由于其条块分割的布局，适合测试新疗法对hGC迁移模式的影响。

研究方案

罗德岛医院IRB委员会批准了患者源性人类胶质瘤细胞的收集、分离和繁殖方案。所有动物都按照NIH《实验室动物护理和使用指南》进行维护。所有动物使用协议都通过了罗得岛医院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 媒体和缓冲准备

1. 制备50 mL的神经球培养基:1x神经基底培养基培养基，不含维生素A，1x血清免费补充剂，不含维生素A，2 mM L-谷氨酰胺，20纳克/mL表皮生长因子（EGF），20纳克/mL基本纤维细胞生长因子（FGF），2微克/mL肝素，和1x抗生素抗肌（抗抗）。
2. 准备50 mL补充神经基底培养基:1x神经基底培养基，1x血清免费补充，4 g/L D-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，和50纳克/mL神经生长因子（NGF）。
3. 准备 500 mL N2B2 介质: 1:1 Dulbecco 的改良鹰中-哈姆的 F12 营养混合物 （DMEM-F12）， 1x 胰岛素-转移素-硒 （ITS-G）， 66 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA）， 0.1 毫克/mL 转移素， 0.01毫克/mL生物素，6.29毫克/mL孕酮，5微克/mL N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），和1 mM普瑞辛。在-20°C时进行等分并冷冻。
4. 制备 500 mL 的 C-Media:1x 最小必需介质 （MEM）、D-葡萄糖（最终 4 g/L）、10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 2 mM L 谷氨酰胺。在-20°C时进行等分并冷冻。在使用前添加神经生长因子 （NGF） 新鲜 （50 纳克/mL）。
5. 准备200 mL的帕平缓冲液:1x厄尔平衡盐溶液（EBSS），100 mM Mg₂SO 4，30%葡萄糖，0.25 M EGTA和1M NaHCO₃。
6. 准备 10 mL 的 DMEM-ITS-G 介质:1x DMEM、0.5% BSA 和 1x ITS-G。
7. 制备 200 mL 的 PB 缓冲液:1x Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），不含 Ca²⁺和 Mg²⁺和 0.5% BSA。使用前将缓冲液除气，并保持在冰上。

2. 胶质瘤干细胞神经球的分离与培养

1. 神经球的隔离
   1. 从手术室收集IRB批准和患者同意的新鲜人类胶质细胞瘤（GBM）组织。将含有 2 倍抗性剂的 DPBS 冰上 GBM 样品转移到 BL2 认证的生物安全柜中。
   2. 将一个1厘米³ GBM样品，将最小的坏死或红细胞污染转移到60毫米的板中，切成1毫米³个碎片;删除任何多余的 DPBS。
   3. 在37°C下用5 mL胶原酶/消脂酶（1mg/mL）消化30分钟，每5-10分钟轻轻旋转一次。
   4. 将消化的片段转移到50 mL管中，并通过用10mL移液器多次移液进行三聚体，以分离组织。
   5. 加入同等体积的神经圈介质，并再次对组织进行三聚体;允许大碎片沉降。
   6. 去除没有组织碎片的介质，缓慢通过放置在新鲜 50 mL 管上的 70 μM 细胞滤网。
   7. 重复步骤 2.1.5-2.1.6，直到所有组织都分离，根据需要更换细胞滤网。
   8. 将细胞悬架在 110 x g下旋转 10 分钟。
   9. 去除上清液，将颗粒重新悬浮在10 mL的ACK赖清缓冲液中，以消除红细胞污染。在室温下孵育10分钟。
   10. 将细胞悬架在 110 x g下旋转 5 分钟。
   11. 去除上清液，并在10 mL的神经圈介质中重新悬浮细胞。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。在100mm悬浮培养板中，在10mm悬浮培养板中，在3 x 10⁶个细胞的密度下，使用自动细胞计数器或血细胞计和板在10mL的神经圈介质中计数10μL细胞悬浮液。
   12. 每周2-3次，向培养中加入2 mL的新鲜神经球介质。
       注:神经球将在3-4周内形成悬浮状态。分培养2-4次后，通过限制稀释测定和肿瘤重述，在免疫功能低下小鼠中进行异种移植，如前^所述22，确认其干细胞。
2. 亚培养神经球
   1. 当球体形成并达到直径在200-500 μm之间时，将神经球转移到15 mL管中，以110 x g旋转5分钟。
   2. 在预热细胞分离溶液的1 mL中重新悬浮神经球。
   3. 转移到1.5 mL管，在37°C孵育5分钟。
   4. 将 P200 移液器设置为 150 μL，并通过上下移液到分离神经球进行三聚。
   5. 分离细胞转移到15 mL管。添加 4 mL 的神经圈介质，以 300 x g旋转 5 分钟。
   6. 去除上清液，并在5 mL的神经圈介质中重新悬浮细胞。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计和板在1 x 10⁶细胞/60毫米盘的密度，最终体积为4 mL的细胞悬浮液计数10 μL。
   7. 每周刷新媒体 2 次，并根据需要进行亚培养。在神经基基培养基中冷冻整个神经球，维生素A补充10%DMSO。神经球可用于P4后的实验。

3. 大鼠大鼠根甘利亚（DRG）、奥洛根德罗基特（OpCs）和hGC的隔离培养

1. 准备分舱文化菜肴
   注:在计划收获 DRG 前几天执行以下步骤。
   1. 组装分舱文化菜肴。
   2. 在无菌蒸馏_H2O中稀释胶原蛋白库存溶液至500微克/mL;彻底混合。
   3. 使用无菌转移移液器，用 2 mL 胶原蛋白溶液填充 35 mm 培养盘;去除溶液，留下一层胶原蛋白薄膜，并将其放入下一个35毫米的盘中。重复此过程，根据需要添加更多胶原蛋白溶液，直到所有菜肴都涂覆。
   4. 涂覆所有板后，将板放在 245 mm x 245 mm 培养盘中，并在托盘中心放置三个 1 mm x 1 mm 纱布垫。
   5. 为了聚合胶原蛋白，湿纱布垫与1 mL的浓缩氢氧化铵和覆盖托盘15分钟。
   6. 拆下纱布垫，让 35 mm 的盘子在层流罩中干燥。
   7. 当洗碗干燥时，用高真空润滑脂装入注射器润滑脂施用器的桶。将隔腔室放入装满蒸馏水的大口介质瓶中。通过高压灭菌和冷却来消毒两者。
   8. 文件关闭点18G需要使一个钝提示。在70%乙醇中消毒。将针头连接到润滑脂注射器。
   9. 浸泡70%乙醇，对针铲进行消毒;使其在层流罩中风干。
   10. 从干燥的胶原蛋白涂层 35 mm 盘中取下盖子。将盘子放在拇指和指针手指之间。用另一只手握住销刀。施加稳固的压力，在盘子中心形成 200 μM 宽的划痕。
   11. 使用牧场移液器，在划痕的中心放置两滴补充神经基底介质。
   12. 重复步骤 3.1.10-3.1.11，直到所有盘子都划伤。
   13. 在层流罩中干燥隔腔室。
   14. 使用无菌止血钳，抓住中心分频器的一个隔间室。翻转止血钳，使腔室底部朝上。
   15. 将硅胶润滑脂涂抹到隔腔室，从顶部开始。确保润滑脂放置整齐，并在所有角落重叠。
   16. 从 35 mm 盘上取下盖子。反转盘子，将划痕放在造型室上。用一对钳子轻轻轻敲盘子的底部。
   17. 使用止血钳轻轻翻转板。松开钳子。
   18. 在中心隔间底部放置一堆润滑脂。用补充的神经元基底介质 （NB） 填充每个腔室，并检查有无泄漏。根据需要用硅胶密封泄漏。
   19. 继续组装所有文化菜肴，并在 37°，5% CO₂中隔夜存储。
2. 大鼠DRG神经元与隔离室中的分离
   1. 通过_CO2窒息或化学过量牺牲一个及时怀孕的E16斯普拉格-道利大鼠。
   2. 将动物置于清洁表面上的上部位置;用70%乙醇对腹部进行消毒。
   3. 用钳子抓住下腹部的皮肤，轻轻抬起。
   4. 用剪刀，沿着动物的中线切开一个"I"切口，注意不要刺穿腹壁的肌肉。
   5. 用一对干净的钳子，抓住肌肉壁，用干净的剪刀做横向切口，小心不要刺穿子宫或肠子。
   6. 用一对钝钳，抓住子宫，轻轻地从围肠腔中抬起。
   7. 使用新鲜无菌剪刀，夹住每个子宫角底部的结缔组织。
   8. 将整个子宫放入无菌的 100 mm 组织培养盘中。
   9. 将子宫带到层流罩进行解剖。
   10. 从子宫中取出胚胎，一次一个，通过羊水囊剪贴，轻轻地戏弄胚胎出来，并进入一个60毫米的盘子，含有5 mL的L-15与1倍笔链球菌。
   11. 用细钳子，将3-4个胚胎放入含有5mL L-15的60毫米盘中，并带有1倍笔链球菌。
   12. 在解剖显微镜下工作，一次使用一个胚胎，通过斩首来安乐死。
   13. 将胚胎腹侧向上躺着，取出四肢和尾巴。
   14. 用细钳子，在动物中做一个中线切口。
   15. 去除内部器官和组织，以暴露背膜结构，特别是脊髓，在完成时应可见。
   16. 在椎骨柱和脊柱管之间放置一把微解剖剪刀，并仔细切开椎骨柱，露出脊髓。小心不要夹住脊髓。
   17. 用细钳子，轻轻抓住脊髓的脊柱，慢慢从胚胎中抬起来。DRG 将连接到脊髓。
   18. 转移脊髓，并将DRG连接到含有2mlL-15的35毫米管菜，带1倍笔链球菌。放在冰上
   19. 一旦所有脊髓被分离，使用细钳从脊髓中单独拔下DRG。将 DRG 放入新鲜的 35 mm 盘中。
   20. 如果 DRG 上存在神经根，则将其夹走。
   21. 从 37°C、5% CO₂培养箱中取出准备好的 35 mm 盘子。从前一天删除媒体。将含有10μM 5-Fluoro-2'-脱氧尿碱（FUDR）的80 μL补充神经基底介质（NBF）放在中心隔间内，在每个外舱中放置250μL介质。
   22. 在每个中心隔间中放置 2 个侧心。将菜肴返回到 37°C，5% CO₂培养箱。
   23. 第二天添加 2.5 mL 的 NBF。
   24. 按照表 1中的计划馈送区域性，根据选择开始 DRG 准备的时间更改计划。
   25. 在第21天（或当斧子到达远端腔末端时），要么用GBM神经球（继续执行步骤3.2.26）的种子培养物，要么用寡核苷酸培养物（继续到步骤3.3）进行种子培养，然后用GBM神经球进行种子培养。骨髓后。
   26. 在每个远端隔间室中更换补充的 NB 介质，该腔室将采用包含 10% FBS 的加补 NB 介质的 GBM 神经球进行种子。
   27. 将 P20 移液器设置为 10 μL 时，从培养皿中取出一个 GBM 神经球。GBM 神经球的大小应约为 200 微米。
   28. 将移液器的尖端放在远端室中，缓慢地排出 GBM 神经球圈，使其轻轻地落在离中心室最近的远端室部分的斧头上，越过中心室附近的斧头。小心不要让移液器尖端打乱斧头。
   29. 在室温下将培养层留在生物安全柜中 1 小时，以便 GBM 神经球连接。
   30. 一旦神经球连接，非常小心地用补充NB介质替换远端隔间中的介质。
   31. 实时图像培养 3-7 天，根据需要添加媒体。在这种情况下，一个受控的_CO2活细胞外壳连接到显微镜（例如，蔡司Axiovert）使用明场连续监测细胞迁移7天。使用相关软件每 10 分钟获取一次图像。使用经过稳定转染以表达 GFP 的 hG 重复相同的协议，并使用亮场和 488 nm 激光的组合捕获图像。
       注:神经球可能用慢病毒转导，或转染质粒或siRNA。隔间也可以用所需的小分子抑制剂处理，以研究迁移。
3. DRG 阿克森与奥利戈多德罗基特的骨髓
   1. 在寡核苷酸分离的前一天，用C-介质替换DRG中的NB介质。
   2. 解剖前，将 10 mL 的 Papain 缓冲液放入培养箱中的 60 mm 盘中以进行平衡。
   3. 在层流罩中，用冰冷的 HBSS 填充一个 100 mm 的盘子和一个 60 mm 的盘子。放在冰上。
   4. 通过斩首牺牲一只P2鼠崽。用剪刀去除皮肤。去除皮肤后，用一把细剪刀沿着中线切割头骨。
   5. 用细钳轻轻取出头骨。使用铲子，轻轻地从头骨底部铲脑，并转移到一个倒置的组织培养板盖。
   6. 取出小脑，将大脑分成两个脑半球。去除每个半球大脑皮层以下的嗅球、海马和基底神经节。将大脑皮层放在含有 HBSS 的 100 mm 盘中。对其余动物重复步骤 3.3.4-3.3.6。
   7. 一次使用一个皮层，用精细的杜蒙特钳子去除脑膜炎。使用 HBSS 将所有无护月皮放入新鲜的 60 mm 菜肴中。
   8. 将皮质组织切成 1 毫米³片。放在冰上。
   9. 将平衡的 Papain 缓冲液放入 15 mL 管中。加入200单位的木瓜和2毫克L-半胱氨酸。过滤消毒并加入200 μL无菌DNase I。
   10. 从切碎的脑组织中取出 HBSS，从 3.3.2 中更换使用 Papain 缓冲液。将菜放在37°C，5%CO₂孵化器80分钟，每15分钟轻轻摇动一次。
   11. 将消化的组织转移到50 mL管中，加入2 mL的C-培养基。
   12. 用5mL血清学移液器进行三聚，以分离组织;允许较大的组织块沉降。去除上清液，放入无菌的15 mL管中。
   13. 再次添加 2 mL 的 C-Media，再使用 5 mL 血清移液器重复三次三聚。切换到 1 mL 移液器尖端并三聚，直到组织完全分离。转移到 15 mL 管。
   14. 在 300 x g下旋转三聚体 15 分钟。小心地去除上清液，并在 8 mL 的 DMEM-ITS-G 介质中重新悬浮颗粒。
   15. 预湿无菌 30 μM 细胞过滤器，带 2 mL PB 缓冲液。将细胞过滤器置于 50 mL 管上，并一次过滤细胞悬浮液 1 mL。用 5 mL 的 PB 缓冲液冲洗过滤器。
   16. 将细胞悬浮液转移到100毫米细菌板;在37°C，5%CO2培养箱中孵育15分钟，使微胶合附着。
   17. 取出介质并放入 15 mL 管中。用 2 mL 的 DMEM-ITS-G 介质轻轻冲洗板，并转移到 15 mL 管中。
   18. 轻轻重新悬挂细胞悬浮液。取10μL的细胞悬浮液，用10μl的试青稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计对细胞悬浮液进行10μl计数。
   19. 将细胞悬架旋转 300 x g 10 分钟。
   20. 完全吸升上清液，每1 x10⁷个细胞在70μL的PB缓冲液中重新悬浮细胞。混合良好，在4°C下孵育10分钟。
   21. 每1 x10⁷细胞加入20μl抗A2B5微珠。混合良好，在4°C下孵育。
   22. 每1 x 10⁷个细胞加入1-2 mL的PB缓冲液，在4°C离心机中以300 x g离心10分钟。
   23. 完全吸气上清。在 500 μL 的 PB 缓冲液中重新悬浮最多 10⁸个细胞。保持冰上。
   24. 在分离器的磁场中放置磁珠柱。
   25. 使用 500 μL 的 PB 缓冲液进行浸干，准备列。将单元格挂起应用于列。丢弃废物容器中的流过（其中包含未标记的单元）。
   26. 用 500 μL 的 PB 缓冲液清洗柱 3 次。丢弃流通过。
   27. 从磁性分离器中取出柱并放置在收集管中。
   28. 将 PB 缓冲液的 1 mL 移液到柱上。将柱塞牢固推入柱塞，将磁性标记的电池冲洗。
   29. 将 4 mL 的 C-Media 添加到细胞分数中，以 300 x g旋转 10 分钟。
   30. 去除上清液，并在 N2B2 介质的 5 mL 中重新悬浮。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计对细胞悬浮液进行计数10 μL。
   31. 每个隔间室的浓度为150，000个细胞的板寡核苷酸，其中含有具有完全扩展的斧突的DRG。
   32. 第二天，将分舱室中的介质更改为 N2B2，以允许骨髓。每 2-3 天更换一次介质。骨髓将在14天内完成。
   33. 第14天，具有GBM神经球的种子培养，如3.2.26-3.2.32。在任何实验期间，在N2B2介质中保持骨髓培养。
       注:该协议如图1中的流程图原理图所示。

结果

为了研究hGCs与斧子的相互作用，我们产生了纯化的DRG斧子，如前面描述的15，16，17，18。这些纯化的DRG斧子然后用hG进行种子，形成GFAP+/Ki67+肿瘤状结构，这些结构集成在斧网中，而单个hGCs在联结或斧子之间迁移（图2）。为了确定hGCs如何与髓化的斧子相互作用，我们用纯化的大鼠寡核苷?...

讨论

可以使用博伊登腔室系统或划痕检测来执行 hGC 的迁移研究。然而，虽然这些实验未能提供有关肿瘤细胞与其他周围组织相互作用的任何信息，但目前的系统可以重述GC与骨髓和非骨髓化纤维的相互作用。此外，为了研究肿瘤的形成和端点迁移，啮齿动物大脑的器官切片培养物或胶质瘤细胞在体内植入啮齿动物大脑或侧翼之前已被利用23、24、25。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Suspension Culture Dish	Corning	430591
2.5S NGF	ENVIGO	B.5025
60 mm Suspension Culture Dish	Corning	430589
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher	A1049201
Ammonium Hydroxide Solution	Fisher Scientific	A669-500	Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)	Peprotech	AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat	Miltenyi Biotec	130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Thermo Fisher	15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)	Miltenyi Biotec	130-091-222
B27 Supplement	Thermo Fisher	17504044
B27 Supplement, minus vitamin A	Thermo Fisher	12587001
Bacteriological Plate	BD Falcon	351029
Biotin	Sigma	B4639
BSA	Sigma	A9418
Campenot Chamber	Tyler Research	CAMP-10
Cell Culture Dish	Corning	430165	35mm X 10mm
Cell Strainer	BD Falcon	352350	70 uM, Nylon
Cell Strainer	BD Falcon	352340	30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase	Roche	11097113001
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
D-Glucose	Sigma	G5146
DMEM	Thermo Fisher	10313021
DNase I	Sigma	D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS	Sigma	E7510
EGTA	Sigma	E3889
FBS	Hyclone	SH30070.02
FUDR	Sigma	F0503
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11765054
HBSS	Thermo Fisher	14175095
Hemostatic Forceps	Roboz	RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS	Stem Cell Technologies	07980
Hypodermic Needle, 18G	BD	511097
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher	41400045
L-Cysteine	Sigma	C7477
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Fisher	11415064
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
MEM	Thermo Fisher	1190081
Mg2SO4	Sigma	M2643
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns plus tubes	Miltenyi Biotec	130-041-301
NAC	Sigma	A8199
NaHCO3	Sigma	S5761
Neurobasal Medium	Thermo Fisher	21103049
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher	10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140148
Pin Rake	Tyler Research	CAMP-PR
Progesterone	Sigma	P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	A1110501
Syrine Grease Applicator	Tyler Research	CAMP-GLSS
Transferrin	Sigma	T2036
Uridine	Sigma	U3003