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요약

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

초록

교모 세포종은 광범위한 세포 이질성과 hGCs의 이동 특성으로 인해 가장 공격적인 인간 암 중 하나입니다. 신경교종 세포 이동의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 종양 미세 환경 내의 hGCs와 축사 간의 상호 작용을 연구하는 능력이 필수적입니다. 이 세포 상호 작용을 모델링하기 위해, 우리는 hGCs와 등쪽 뿌리 중추 (DRG) 축 - 올리고 덴드로 시트 공동 배양으로 구성된 혼합 배양 시스템을 개발했습니다. DRG 배양은 효율적으로 격리될 수 있고 이러한 특성의 마이그레이션 연구에 이상적인 길고 광범위한 프로젝션을 형성할 수 있기 때문에 선택되었습니다. 정제된 래트 올리고덴드로시테는 정제된 래트 DRG 축삭에 첨가하고 myelinate로 유도하였다. 컴팩트 한 myelin의 형성을 확인한 후, hGCs는 마침내 공동 배양에 추가되었고 DRG 축삭 및 올리고덴드로시트와의 상호 작용은 타임랩스 현미경을 사용하여 실시간으로 모니터링되었습니다. 이러한 조건하에서 hGCs는 GFAP 및 Ki67을 발현하는 종양과 같은 골집합 구조를 형성하고, 골수 및 비 골수성 축사 트랙을 따라 이동하고 의사 포디아의 형성을 통해 이러한 축색과 상호 작용합니다. 우리의 생체 내 공동 배양 시스템은 hGC 이동의 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있으며 잠재적으로 시험관 내 약물 효능 테스트에 사용될 수 있습니다.

서문

아교 모세포종은 인간의 뇌의 가장 공격적이고 치명적인 종양 중 하나입니다. 치료의 현재 표준은 방사선 에 이어 종양의 외과절제술을 포함 1 플러스 temozolomide의 보조 및 보조 투여2. 이 다중 치료 접근법으로도 종양 재발은불가피합니다 3. 이것은 부분적으로 종양 세포의 광대한 철새 특성 때문입니다, 이는 뇌 의 여러 손가락 같은 프로젝션을 만드는 뇌 의 실조를 침략4 그 가능성이 완전한 절제.

최근 몇 년 동안, 교모세포종의 공격성은 부분적으로 종양 질량5,6,높은 철새 전위 7,8,화학 요법 및방사선에대한 저항성 및 이차 종양을 형성하는능력(11)내의 암 줄기 세포의 집단의 존재에 기인한다는 것이 명백해지고 있다. GSCs는 누드 마우스5에이종이식할 때 원래의 다각형 종양을 되풀이할 수 있다.

교모 세포종의 유전 적 배경에 관한 풍부한 지식에도 불구하고, 신경교종 세포 (GC) 이동에 대한 연구는 현재 시험관 내 또는 생체 내 이동 모델의 효율적인 부족에 의해 방해된다. 특히, 세포-축색상호작용이 세포및 환경적 요인에 의해 변조되는 동안 신경교종 침입의 핵심 구성 요소는 있지만, 우리의 지식에는 현재 이러한 상호작용12,13,14를모델링할 수 있는 실험 시스템이 없다. 이 결핍을 해결하기 위하여, 우리는 분화한 종양 마커의 높은 표현 귀착되는 정제된 DRG 축삭-oligodendrocytes를 가진 1 차적인 hGCs의 생체 배양 시스템을 개발했습니다 뿐만 아니라 myelined 및 비 골수성 섬유와 hGCs의 광범위한 이동 그리고 상호 작용 귀착됩니다. 구획화 된 레이아웃으로 인해이 생체 내 플랫폼은 hGC 마이그레이션 패턴에 대한 새로운 치료법의 효과를 테스트하는 데 적합합니다.,

프로토콜

환자 유래 인간 신경교종 세포의 수집, 격리 및 전파에 대한 프로토콜은 로드 아일랜드 병원의 IRB 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 유지되었습니다. 모든 동물 사용 프로토콜은 로드 아일랜드 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 미디어 및 버퍼 준비

  1. 신경구 배지 50 mL 준비: 1x 뉴런 기저 배지 와 비타민 A, 1x 혈청 무료 보충제 와 비타민 A, 2mML 글루타민, 20 ng/mL 표피 성장 인자 (EGF), 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 2 μg/mL 헤파린, 1x 항생제 항미성 항미제(항균제).
  2. 준비 50 보충 된 신경 기초 매체의 mL: 1 x 신경 기초 매체, 1 x 혈 청 무료 보충, 4 g/L D-포도 당, 2 mM L-글루타민, 그리고 50 ng/mL 신경 성장 인자 (NGF).
  3. N2B2 배지 500 mL 준비: 1:1 덜베코의 수정된 독수리 미디엄 햄의 F12 영양소 혼합물(DMEM-F12), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS-G), 66 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 0.1 mg/mL 트랜스트랜스린, 0.01 mg/mL 비오틴, 6.29 mg/mL 프로게스테론, 5 μg/mL N-아세틸-L-시스틴 (NAC), 및 1 mM의 퍼트리신. 알리쿼트 및 -20°C에서 동결.
  4. C-Medium 500 mL: 1x 최소 필수 매체(MEM), D-글루코스(최종 4 g/L), 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민을 준비합니다. 알리쿼트 및 -20°C에서 동결. 신경 성장 인자 (NGF)를 사용하기 전에 신선하게 추가하십시오 (50 ng / mL).
  5. 파파인 버퍼 200 mL 준비: 1x 얼의 균형 잡힌 소금 용액 (EBSS), 100 mM Mg2SO4,30% 포도당, 0.25 M EGTA, 1 M NaHCO3.
  6. DMEM-ITS-G 미디엄 10mL 준비: 1x DMEM, 0.5% BSA 및 1x ITS-G.
  7. PB 버퍼 200 mL 준비: Ca2+ 및 Mg2+ 및 0.5% BSA없이 1x 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS). 사용하기 전에 버퍼를 탈기하고 얼음을 유지하십시오.

2. 신경교종 줄기 세포 신경구의 격리 및 배양

  1. 신경구의 격리
    1. IRB를 승인하고 환자가 수술실에서 신선한 인간 교모세포종(GBM) 조직을 승인한 것을 수집한다. BL2 인증 생물학적 안전 캐비닛에 2x 안티를 포함하는 DPBS의 얼음에 GBM 샘플을 전송합니다.
    2. 최소한의 괴사 또는 적혈구 오염으로 1 cm3 GBM 샘플을 60mm 플레이트로 옮기고 1mm3 조각으로 잘라냅니다. 여분의 DPBS를 제거하십시오.
    3. 37°C에서 30분 동안 콜라게나제/디스파스(1 mg/mL)의 5 mL로 조직을 소화하고 5-10분마다 접시를 부드럽게 소용돌이치세요.
    4. 소화된 단편을 50 mL 튜브로 옮기고 조직을 해리하기 위해 10 mL 파이펫으로 여러 번 파이펫팅하여 삼중화한다.
    5. 신경 구액 매체의 동등한 양을 추가하고 다시 조직을 삼중화; 큰 조각이 정착할 수 있도록 합니다.
    6. 조직 단편없이 매체를 제거하고 신선한 50 mL 튜브 위에 놓인 70 μM 세포 스트레이너를 천천히 통과합니다.
    7. 모든 조직이 해리 될 때까지 2.1.5-2.1.6 단계를 반복하여 필요에 따라 세포 여과기를 변경합니다.
    8. 셀 서스펜션을 110 x g에서 10분 동안 회전시면 됩니다.
    9. 상판액을 제거하고 적혈구 오염을 제거하기 위해 ACK 라싱 버퍼의 10 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
    10. 셀 서스펜션을 110 x g에서 5분 동안 회전시면 됩니다.
    11. 신경구 미디어의 10 mL에서 상류층을 제거하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 100 mm 서스펜션 배양 플레이트에서 3 x 106 세포의 밀도로 신경구 배지의 10 mL에서 자동 세포 카운터 또는 혈세포계 및 플레이트를 사용하여 세포 현탁액의 10 μL을 계산한다.
    12. 일주일에 2-3회 신선한 신경구 배지 2 mL를 배양합니다.
      참고: 신경구는 3-4주 이내에 현탁액으로 형성됩니다. 2-4회 동안 배양한 후, 앞서 설명한 바와같이 면역손상마우스에서 의외로 이식을 통한 제한적인 희석 분석 및 종양 재캡을 통해 줄기를 확인한다.
  2. 하위 배양 신경구
    1. 구체가 200-500 μm 사이의 직경을 형성하고 도달하면 신경 구를 15 mL 튜브로 옮기고 110 x g에서 5 분 동안 회전합니다.
    2. 미리 데운 세포 분리 용액의 1 mL에서 신경 구를 다시 중단하십시오.
    3. 1.5 mL 튜브로 옮기고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    4. P200 파이펫을 150 μL로 설정하고 신경구를 해리하기 위해 위아래로 파이펫팅하여 삼중화합니다.
    5. 해리된 세포를 15 mL 튜브로 옮김을 전달합니다. 신경구 미디어 4mL를 추가하고 5분 동안 300 x g으로 돌릴 수 있습니다.
    6. 신경구 미디어의 5 mL에서 상류층을 제거하고 세포를 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 4 mL의 최종 부피에서 1 x 106 셀 / 60mm 접시의 밀도로 자동 셀 카운터 또는 혈세포 계 및 플레이트를 사용하여 셀 현탁액의 10 μL을 계산합니다.
    7. 필요에 따라 주 2회 배지와 하위 배양 세포를 새로 고칩니다. 10% DMSO로 보충된 비타민 A와 함께 뉴런 기저 매체에서 원하는 경우 전체 신경구를 동결시. 신경구는 P4 후 실험에 사용될 수 있다.

3. 쥐 등쪽 뿌리 간경 (DRGs), 올리고덴드로시테스 (OPC) 및 hGCs의 구획 문화

  1. 구획 문화 요리의 준비
    참고: DRG의 계획된 수확 전날에 다음 단계를 수행합니다.
    1. 구획 된 문화 요리를 조립합니다.
    2. 멸균 된H2O에서 500 μg / mL에 콜라겐 스톡 용액을 희석; 철저히 혼합하십시오.
    3. 멸균 전달 파이펫으로 35mm 배양 접시에 2 mL의 콜라겐 용액을 채웁니다. 용액을 제거하고 콜라겐의 얇은 막을 뒤에 두고 다음 35mm 접시에 넣습니다. 모든 요리가 코팅될 때까지 필요에 따라 콜라겐 용액을 더 추가하여 이 과정을 반복하십시오.
    4. 모든 플레이트가 코팅되면 플레이트를 245mm x 245mm 배양 트레이에 놓고 트레이 중앙에 1mm x 1mm 거즈 패드 3개를 놓습니다.
    5. 콜라겐을 중합하기 위해 농축 된 암모늄 수산화 암모늄 1 mL로 젖은 거즈 패드를 15 분 동안 트레이를 덮습니다.
    6. 거즈 패드를 제거하고 35mm 접시가 층류 후드에서 건조되도록 하십시오.
    7. 접시가 건조되는 동안 주사기 그리스 어플리케이터의 배럴을 고진공 그리스로 적재하십시오. 구획 된 챔버를 증류수로 채워진 큰 입 매체 병에 놓습니다. 오토클레이브를 사용하여 둘 다 살균하고 식힙니다.
    8. 무딘 팁을 만들기 위해 18-G 의 지점에서 파일. 70% 에탄올로 살균하십시오. 바늘을 그리스 주사기에 부착합니다.
    9. 70% 에탄올에 담가 핀 레이크를 살균; 층류 후드에서 공기 건조할 수 있습니다.
    10. 건조하고 콜라겐 코팅 된 35mm 접시에서 뚜껑을 제거합니다. 엄지손가락과 포인터 손가락 사이에 접시를 잡습니다. 다른 손으로 핀 레이크를 잡습니다. 단단한 압력을 가하여 접시 중앙에 200 μM 의 넓은 스크래치도 만듭니다.
    11. 목초지 파이펫을 사용하여, 스크래치의 중앙에 보충 신경 기저 매체의 두 방울을 배치합니다.
    12. 모든 요리가 긁히때까지 3.1.10-3.11 단계를 반복합니다.
    13. 층류 후드에 구획 된 챔버를 건조.
    14. 멸균 지혈 집게로 중앙 칸막이에 의해 하나의 구획 챔버를 잡습니다. 지혈성 집게를 뒤집어 챔버의 바닥이 위를 향하도록 합니다.
    15. 실리콘 그리스를 구획 된 챔버에 적용하여 상단부터 시작하십시오. 그리스가 깔끔하게 배치되고 모든 모서리에 겹치는지 확인하십시오.
    16. 35mm 접시에서 뚜껑을 분리합니다. 접시를 뒤집어 챔버 위에 긁힌 자국을 놓습니다. 한 쌍의 집게로 플레이트 바닥을 부드럽게 누릅니다.
    17. 지혈식 집게를 사용하여 플레이트를 부드럽게 뒤집습니다. 집게를 놓습니다.
    18. 중앙 구획의 바닥에 기름 더미를 놓습니다. 각 챔버에 보충된 신경 기저 미수(NB)를 채우고 누출여부를 확인합니다. 필요에 따라 실리콘 그리스로 누출을 밀봉합니다.
    19. 모든 문화 요리를 계속 조립하고 37 °, 5 %CO2에서하룻밤 보관하십시오.
  2. 구획 된 챔버에서 쥐 DRG 뉴런과 문화의 격리
    1. CO2 질식 또는 화학 적 과다 복용으로 시간 적 임신 한 E16 Sprague-Dawley 쥐를 희생하십시오.
    2. 동물을 깨끗한 표면에 척추 위치에 놓는다. 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오.
    3. 집게로 하복부의 피부를 잡고 부드럽게 들어 올립니다.
    4. 가위를 사용하여 동물의 중간선을 따라 "I"절개를하고 복벽의 근육에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오.
    5. 깨끗한 집게 한 쌍으로 근육 벽을 잡고 자궁이나 내장에 구멍을 뚫지 않도록주의를 기울여 깨끗한 가위로 가로 절개를하십시오.
    6. 무딘 집게 한 쌍으로 자궁을 잡고 복막 강에서 부드럽게 들어 올립니다.
    7. 신선한 멸균 가위를 사용하여 각 자궁 경적의 바닥에 결합 조직을 끼우습니다.
    8. 자궁 전체를 멸균 된 100mm 조직 배양 접시에 놓습니다.
    9. 해부를 위한 층류 후드에 자궁을 운반하십시오.
    10. 자궁에서 배아를 제거, 한 번에 하나씩, 양수 낭을 통해 클리핑하고 부드럽게 배아를 괴롭히고 1 x 펜 스트렙으로 L-15의 5 mL을 포함하는 60mm 접시로.
    11. 미세 한 집게로, 1 x 펜 스트렙과 L-15의 5 mL을 포함하는 60mm 접시에 3-4 배아를 배치합니다.
    12. 해부 현미경으로 한 번에 하나의 배아로 작업, 참수에 의해 안락사.
    13. 배아 복부 쪽을 위로 눕고 사지와 꼬리를 제거하십시오.
    14. 미세 집게로 동물의 중간 절개를하십시오.
    15. 등뼈 구조, 특히 완료 시 볼 수 있어야 척수를 노출하는 내부 장기와 조직을 제거합니다.
    16. 척추통과 척추관 사이에 미세 해부 가위 한 잎을 놓고 척추를 조심스럽게 잘라 척수를 노출시다. 척수를 잘라내지 않도록 주의하십시오.
    17. 미세 한 집게로 척수의 장밋끝을 가볍게 잡고 배아에서 천천히 들어 올립니다. DRG는 척수에 부착됩니다.
    18. 척수와 부착된 DRG를 1x 펜 스트렙으로 L-15 2 ml가 들어있는 35mm 접시에 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 담습니다. 얼음 위에 놓습니다.
    19. 모든 척수를 분리한 후에는 미세 한 집게를 사용하여 척수에서 DRG를 개별적으로 뽑습니다. DRG를 신선한 35mm 접시에 넣습니다.
    20. DRGs에 신경 뿌리가 있는 경우, 신경 뿌리를 잘라냅니다.
    21. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 제조된 35 mm 접시를 제거한다. 전날의 미디어를 제거합니다. 80 μL의 보충된 신경 기저 부(NBF)를 중앙 구획에 10 μM 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)을 함유하고 각 외부 구획에 250 μL의 용지를 놓습니다.
    22. 각 중앙 칸에 2개의 중추를 놓습니다. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 되돌려 보라고 합니다.
    23. 다음 날 NBF의 2.5 mL를 추가합니다.
    24. 표 1의일정에 따라 문화권에 피드를 공급하여 DRG 준비를 시작하도록 선택한 날에 따라 일정을 변경합니다.
    25. 21일(또는 축삭이 말단 구획의 끝에 도달할 때), GBM 신경구를 가진 종자 배양(단계 3.2.26)을 가진 종자 배양및 살아있는 이미지 또는 올리고델로시테스 문화를 가진 배양을 myelinate (단계 3.3로 진행) 다음 GBM 신경구로 종자 myelination 후.
    26. 10% FBS를 함유하는 보충 된 NB 배지와 GBM 신경구로 시드 될 각 말단 구획 챔버에서 보충 된 NB 배지를 대체하십시오.
    27. P20 파이펫을 10 μL로 설정하면 배양 접시에서 GBM 신경구 1개를 제거합니다. GBM 신경구는 약 200 미크론의 크기를 측정해야합니다.
    28. 피펫의 끝을 말단 챔버에 놓고 GBM 신경구를 천천히 추방하여 중앙 챔버에 가장 가까운 말단 챔버 부분의 축삭에 부드럽게 떨어지도록 하십시오. 파이펫 팁이 축색을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    29. GBM 신경구가 부착될 수 있도록 실온에서 1시간 동안 생물안전성 캐비닛에 배양합니다.
    30. 신경구가 부착되면, 매우 신중하게 보충 NB 매체와 말단 구획의 미디어를 교체.
    31. 필요에 따라 미디어를 추가하여 3-7일 동안 라이브 이미지 문화. 이 경우, 현미경에 부착된 제어된CO2 라이브 셀 인클로저(예를 들어, 자이스 액시오버트)를 사용하여 7일 동안 광시야를 사용하여 세포 이동을 지속적으로 모니터링하는 데 사용되었다. 관련 소프트웨어를 사용하여 10분마다 이미지를 수집했습니다. GFP를 발현하기 위해 안정적으로 형질감염된 hGCs를 사용하여 동일한 프로토콜을 반복하고 이미지는 브라이트필드와 488 nm 레이저의 조합을 사용하여 캡처되었습니다.
      참고: 신경구는 렌티바이러스로 변환되거나 플라스미드 또는 siRNAs로 형질전환될 수 있습니다. 구획은 또한 이동을 연구하기 위해 원하는 소분자 억제물로 치료될 수 있다.
  3. 올리고덴드로시테를 함유한 DRG 축삭의 수초화
    1. 올리고덴드로시테 격리 전날, DRG의 NB 배지를 C-Medium으로 대체합니다.
    2. 해부하기 전에, 파파인 버퍼 10 mL을 인큐베이터에 60mm 접시에 넣고 평형화하십시오.
    3. 라미나 흐름 후드에 100mm 접시 와 얼음 차가운 HBSS로 60mm 접시 하나를 채웁니다. 얼음 위에 놓습니다.
    4. 참수에 의해 P2 쥐 새끼를 희생. 가위를 사용하여 피부를 제거합니다. 피부가 제거된 후, 한 쌍의 미세 한 가위로 중간선을 따라 두개골을 자른다.
    5. 미세한 집게로 두개골을 부드럽게 제거합니다. 주걱을 사용하여 두개골 바닥에서 뇌를 부드럽게 떠서 뒤집힌 조직 배양 판 뚜껑으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다.
    6. 소뇌를 제거하고 두 개의 대뇌 반구로 뇌를 분할. 각 반구의 대뇌 피질 아래 후각 전구, 해마 및 기저 중추를 제거합니다. HBSS를 포함하는 100 mm 접시에 대뇌 피질을 놓습니다. 나머지 동물에 대해 3.3.4-3.6 단계를 반복합니다.
    7. 한 번에 하나의 피질로 작업, 미세 듀몬트 집게와 수막을 제거. 모든 수막이 없는 코르티를 HBSS로 신선한 60mm 요리에 넣습니다.
    8. 피질 조직을 1mm3 개로 주사위하십시오. 얼음 위에 놓습니다.
    9. 15 mL 튜브에 평형 파파인 버퍼를 넣습니다. 추가 200 파파인 의 단위 와 2 mg L-시스테인. 필터 살균 및 멸균 DNase I의 200 μL을 추가합니다.
    10. 다진 뇌 조직에서 HBSS를 제거하고 3.3.2에서 파파인 버퍼로 대체하십시오. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 80분 동안 놓고 15분마다 부드럽게 흔들어 주세요.
    11. 소화된 조직을 50 mL 튜브로 옮기고 C-배지 2 mL를 추가합니다.
    12. 조직을 해리하는 5 mL 혈청학적 피펫과 삼투염; 더 큰 조직 조각이 정착할 수 있도록 하십시오. 상급을 제거하고 멸균 된 15 mL 튜브에 넣습니다.
    13. C-미디엄 2mL를 추가하고 5 mL의 세월학적 파이펫으로 삼조를 다시 한 번 반복합니다. 1 mL 파이펫 팁으로 전환하고 조직이 완전히 해리 될 때까지 삼중화. 15 mL 튜브로 옮김.
    14. 삼중 조직을 300 x g에서 15 분 동안 돌리십시오. 조심스럽게 상류를 제거하고 DMEM-ITS-G 매체의 8 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
    15. 멸균 된 30 μM 세포 스트레이너를 2 mL의 PB 버퍼로 미리 적시다. 50 mL 튜브 위에 세포 스트레이너를 놓고 한 번에 셀 현탁액 1 mL을 필터링합니다. PB 버퍼의 5 mL로 필터를 헹구는 다.
    16. 세포 현탁액을 100 mm 세균성 판으로 옮기고; 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 15분 동안 배양하여 마이크로글리아가 부착될 수 있도록 하였다.
    17. 용지를 제거하고 15mL 튜브에 넣습니다. DMEM-ITS-G 배지 2mL로 플레이트를 부드럽게 헹구고 15 mL 튜브로 옮긴다.
    18. 셀 서스펜션을 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 셀 현탁액의 10 μL을 취하고 10 μl의 트리판 블루로 희석하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 현탁액의 10 μl을 계산합니다.
    19. 셀 서스펜션을 300 x g에서 10분 동안 회전시다.
    20. 흡위제는 1 x 107 셀마다 PB 버퍼의 70 μL에서 세포를 완전히 재중단시된다. 잘 섞고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    21. 1 x 10x 7 셀마다 항 A2B5 마이크로 비드 20 μl을 추가하십시오. 잘 섞고 4 °C에서 배양하십시오.
    22. 4°C 원심분리기에서 10분 동안 1 x 10x 7 셀및 원심분리기마다 1-2 mL의 PB 버퍼를 넣고 300 x g에 원심분리기를 넣습니다.
    23. 완전히 흡인 상피. PB 버퍼의 500 μL에서 총 10개의 8 셀까지 재중단하십시오. 얼음에 보관하십시오.
    24. 분리기의 자기장에 자기 비드 컬럼을 배치합니다.
    25. PB 버퍼의 500 μL로 헹구어 컬럼을 준비합니다. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 폐기물 용기에서 흐름을 통해 폐기합니다(레이블이 지정되지 않은 셀이 포함됨).
    26. PB 버퍼의 500 μL로 컬럼을 3회 세척합니다. 흐름을 통해 폐기합니다.
    27. 마그네틱 분리기에서 컬럼을 제거하고 수집 튜브에 놓습니다.
    28. 열에 PB 버퍼의 피펫 1 mL. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 자기 라벨이 부착된 셀을 플러시합니다.
    29. 셀 분수에 C-Medium 4 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 회전하십시오.
    30. N2B2 미디엄 의 5 mL에서 상류를 제거하고 다시 일시 중단하십시오. 셀 현탁액 의 10 μL을 가지고 10 μL의 트리판 블루로 희석하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 현탁액의 10 μL을 계산합니다.
    31. 완전히 확장된 축삭을 가진 DRG를 포함하는 구획된 챔버 당 150,000개의 세포의 농도에서 플레이트 올리고덴드로시테.
    32. 다음날 구획된 챔버내의 미디어를 N2B2로 변경하여 수분화할 수 있도록 한다. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 14일 만에 완료됩니다.
    33. 14일째에, GBM 신경구를 가진 종자 배양은 3.2.26-3.2.32에서와 같이. 임의의 실험 기간 동안 N2B2 배지에서 골수배양체를 유지한다.
      참고: 프로토콜은 그림 1의순서도 회로도로 표시됩니다.

결과

축축과 hGCs의 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 앞서 설명한 대로 정제 된 DRG 축을 생성15,16,17,18. 이 정제된 DRG 축색은 hGCs로 시드되었고, 이는 축축네트워크 내에 통합된 GFAP+/Ki67+ 종양유사 구조를 형성하고, 개별 hGCs는 연관 또는 축사 사이를 이동하였다(그림2). hGCs가 myelinated 축삭과 상...

토론

hGCs에 대한 마이그레이션 연구는 Boyden 챔버 시스템 또는 스크래치 검정을 사용하여 수행 될 수있다. 그러나, 이러한 실험은 다른 주변 조직과 종양 세포의 상호 작용에 관한 어떠한 정보도 제공하지 못하는 반면, 본 시스템은 골수및 비골수제 섬유와의 GC 상호작용을 재현할 수 있다. 더욱이, 종양 형성 및 종점 이동을 연구하기 위해, 설치류 뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양또는 설치류 뇌 또는 측?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 신경 외과의 부서의 내부 기금에 의해 지원되었다, N.T에 브라운 대학.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Suspension Culture DishCorning430591
2.5S NGFENVIGOB.5025
60 mm Suspension Culture DishCorning430589
ACK Lysing BufferThermo FisherA1049201
Ammonium Hydroxide SolutionFisher ScientificA669-500Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)PeprotechAF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, ratMiltenyi Biotec130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo Fisher15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)Miltenyi Biotec130-091-222
B27 SupplementThermo Fisher17504044
B27 Supplement, minus vitamin AThermo Fisher12587001
Bacteriological PlateBD Falcon351029
BiotinSigmaB4639
BSASigmaA9418
Campenot ChamberTyler ResearchCAMP-10
Cell Culture DishCorning43016535mm X 10mm
Cell StrainerBD Falcon35235070 uM, Nylon
Cell StrainerBD Falcon35234030 uM, Nylon
Collagenase/DispaseRoche11097113001
Cultrex Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
D-GlucoseSigmaG5146
DMEMThermo Fisher10313021
DNase ISigmaD7291
Dow Corning High-Vacuum GreaseFisher Scientific14-635-5D
Dumont #5 ForcepsRobozRS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSSSigmaE7510
EGTASigmaE3889
FBSHycloneSH30070.02
FUDRSigmaF0503
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher11765054
HBSSThermo Fisher14175095
Hemostatic ForcepsRobozRS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBSStem Cell Technologies07980
Hypodermic Needle, 18GBD511097
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher41400045
L-CysteineSigmaC7477
L-GlutamineThermo Fisher25030081
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MEMThermo Fisher1190081
Mg2SO4SigmaM2643
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS Columns plus tubesMiltenyi Biotec130-041-301
NACSigmaA8199
NaHCO3SigmaS5761
Neurobasal MediumThermo Fisher21103049
Neurobasal-A MediumThermo Fisher10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140148
Pin RakeTyler ResearchCAMP-PR
ProgesteroneSigmaP8783
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo FisherA1110501
Syrine Grease ApplicatorTyler ResearchCAMP-GLSS
TransferrinSigmaT2036
UridineSigmaU3003

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