JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Özet

Glioblastom, yoğun hücresel heterojenlik ve hGC'lerin göç özellikleri nedeniyle en agresif insan kanserlerinden biridir. Glioma hücre göçünaltında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için tümör mikroortamında hGC'ler ve aksonlar arasındaki etkileşimi inceleme yeteneği esastır. Bu hücresel etkileşimi modellemek için hGC'ler ve dorsal kök gangliyonu (DRG) akson-oligodendrocyte ortak kültürlerden oluşan karma bir kültür sistemi geliştirdik. DRG kültürleri, verimli bir şekilde izole edilebildikleri ve bu tür göç çalışmaları için ideal olan uzun ve kapsamlı projeksiyonları oluşturabildikleri için seçilmiştir. Saflaştırılmış sıçan oligodendrocytes sonra saflaştırılmış sıçan DRG aksonlar eklendi ve miyelin indüklenen. Kompakt miyelin oluşumunu doğruladıktan sonra, hGC'ler nihayet co-kültüre eklendi ve DRG akson ve oligodendrositler ile etkileşimleri zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. Bu koşullar altında, HGC'ler GFAP ve Ki67'yi ifade eden tümör benzeri agrega yapıları oluştururlar, hem miyelinli hem de miyelinsiz aksonal izler boyunca göç eder ve psödopodi oluşumu yoluyla bu aksonlarla etkileşime girilir. Ex vivo co-kültür sistemimiz hGC göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir.

Giriş

Glioblastom insan beyninin en agresif ve ölümcül tümörlerinden biridir. Mevcut bakım standardı, tümörün cerrahi rezeksiyonu ve ardından radyasyon1 artı eşlik eden ve temozolomide2'ninadjuvan uygulamasıdır. Bu multi-terapötik yaklaşım la bile, tümör nüks kaçınılmazdır3. Bu kısmen tümör hücrelerinin geniş göç doğası nedeniyle, beyin parankim istila beyin içinde birden fazla parmak benzeri projeksiyonlar oluşturarak4 tam rezeksiyon olası hale.

Son yıllarda, bu glioblastoma saldırganlık nedeniyle olduğu ortaya çıkmıştır, kısmen, tümör kitle içinde kanser kök hücrelerinin bir popülasyonvarlığı nabağlı5,6, yüksek göç potansiyeli sergileyen7,8, kemoterapi ve radyasyona direnç9,10 ve ikincil tümörler oluşturmak için yeteneği11. GSC'ler çıplak farelere xenografted zaman orijinal poliklonal tümörler recapitulating yeteneğine sahiptir5.

Glioblastomların genetik geçmişi ile ilgili bilgi zenginliğine rağmen, glioma hücreli (GC) göçü üzerine yapılan çalışmalar şu anda etkin in vitro veya in vivo göç modellerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Özellikle, glioma hücre-aksonal etkileşimleri hücresel ve çevresel faktörler tarafından modüle glioma invazyonunun temel bileşeni olmakla birlikte, bizim bilgimize göre şu anda bu etkileşimleri modelleme yeteneği ile hiçbir deneysel sistem yoktur12,13,14. Bu eksikliği gidermek için, farklılaştırılmış tümör belirteçlerinin yüksek ekspresyonunun yanı sıra hGC'lerin miyelinatlı ve miyelinatlı olmayan liflerle etkileşiminin yanı sıra, saflaştırılmış DRG akson-oligodendrositlerle birlikte kültürlenen primer hGC'lerden oluşan bir ex vivo kültür sistemi geliştirdik. Bu ex vivo platformu, bölümlere ayrılmış düzeni nedeniyle, hGC göç desenleri üzerinde yeni terapötik etkilerini test etmek için uygundur.,

Protokol

Hasta kaynaklı insan glioma hücrelerinin toplanması, izole edilmesi ve yayılması na yönelik protokoller Rhode Island Hastanesi'nin IRB komitesi tarafından onaylandı. Tüm hayvanlar, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre muhafaza edilmiştir. Tüm hayvan kullanım protokolleri Rhode Island Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Medya ve tampon preparatları

  1. Prepare 50 mL of Neurosphere Media: 1x Neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum free supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 20 ng/mL basic-fibroblast growth factor (FGF), 2 μg/mL heparin, and 1x antibiotic-antimycotic (anti-anti).
  2. Hazırlayın 50 mL takviye Nöronal Bazal Orta: 1x Nöronal bazal orta, 1x serum serbest takviyesi, 4 g /L D-glukoz, 2 mM L-glutamin, ve 50 ng / mL sinir büyüme faktörü (NGF).
  3. Hazırlamak 500 N2B2 Orta: 1:1 Dulbecco Modifiye Eagle Medium-Ham's F12 Besin Karışımı (DMEM-F12), 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS-G), 66 mg/mL büyükbaş serum albumin (BSA), 0.1 mg/mL transferrin, 0.01 mg/mL biotin, 6.29 mg/mL progesteron, 5 g/mL N-Asetil-L-sisin (NAC) ve 1 mM putriscine. Aliquot ve -20 °C'de dondurun.
  4. 500 mL C-Medium hazırlayın: 1x Minimum Esansiyel Orta (MEM), D-glukoz (son 4 g/L), %10 fetal büyükbaş serum (FBS) ve 2 mM L-glutamin. Aliquot ve -20 °C'de dondurun. Kullanmadan önce sinir büyüme faktörü (NGF) taze ekleyin (50 ng/mL).
  5. Hazırlayın 200 papain tampon mL: 1x Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% Glikoz, 0.25 M EGTA, ve 1 M NaHCO3.
  6. 10 mL DMEM-ITS-G Orta: 1x DMEM, %0.5 BSA ve 1x ITS-G hazırlayın.
  7. 200 mL PB Tampon hazırlayın: 1x Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) Ca2+ ve Mg2+ ve %0.5 BSA olmadan. Kullanmadan önce tampon degas ve buz üzerinde tutmak.

2. Glioma Kök Hücre Nörosferlerinin İzolasyon ve Kültürü

  1. Nörosferlerin İzolasyon
    1. Ameliyathaneden IRB onaylı ve hasta onaylı taze insan glioblastom (GBM) dokusunu toplayın. 2x anti-anti içeren DPBS'de buz üzerinde GBM numunelerini BL2 sertifikalı biyolojik güvenlik kabine aktarın.
    2. Minimal nekroz veya kırmızı kan hücresi kontaminasyonu ile bir 1 cm3 GBM numuneyi 60 mm'lik bir tabağa aktarın ve 1 mm3 parçaya bölünün; fazla DPBS'yi kaldırın.
    3. 37 °C'de 30 dakika boyunca 5 mL kollajenaz/dispas (1 mg/mL) ile dokuyu sindirin ve her 5-10 dakikada bir yavaşça çevirin.
    4. Sindirilmiş parçaları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu ayrıştırmak için 10 mL'lik pipetle birkaç kez pipetleme yaparak triturate.
    5. Neurosphere Media eşit hacimli ekleyin ve tekrar doku triturate; büyük parçaların yerleşmesine izin verir.
    6. Doku parçaları olmadan ortamı çıkarın ve taze bir 50 mL tüp üzerine yerleştirilen 70 μM hücreli süzgeçten yavaşça geçirin.
    7. Tüm doku ayrıştırılmış olana kadar 2.1.5-2.1.6 adımlarını tekrarlayın, gerektiğinde hücre süzgeci değiştirin.
    8. Hücre süspansiyonuna 10 dakika boyunca 110 x g'de döndürün.
    9. Süpernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi kontaminasyonu kaldırmak için ACK lysing tampon 10 mL pelet resuspend. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    10. Hücre süspansiyonuna 110 x g'de 5 dk çevirin.
    11. Nörosfer Media'nın 10 mL'lik süpernatant ve resuspend hücrelerini çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. 100 mm süspansiyon kültür plakalarında 3 x 106 hücre yoğunluğunda Neurosphere Media'nın 10 mL'sinde otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ve plaka kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μL'sini sayın.
    12. Kültüre haftada 2-3 kez 2 mL taze Nörosfer Medya ekleyin.
      NOT: Nörosferler 3-4 hafta içinde süspansiyon içinde oluşacaktır. 2-4 kez subculturing sonra, daha önce açıklandığı gibi bağışıklık azlamış farelerde ksenografik transplantasyon yoluyla sınırlayıcı seyreltme tözve tümör recapitulation ile kök doğrulamak 22.
  2. Alt-culturing Nörosferler
    1. Küreler 200-500 μm arasında bir çapa ulaştığında, nörosferleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dk boyunca 110 x g'de döndürün.
    2. Önceden ısıtılmış hücre ayırma çözeltisinin 1 mL'sinde nörosferleri yeniden askıya alın.
    3. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Bir P200 pipetini 150°L'ye ayarlayın ve nörosferleri ayrıştırmak için yukarı ve aşağı borular oluşturarak üçleme ayarlayın.
    5. Ayrık hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Nörosfer Medya 4 mL ekleyin ve 5 dakika için 300 x g spin.
    6. Nörosfer Medya 5 mL supernatant ve resuspend hücreleri çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. 4 mL son hacminde 1 x 106 hücre/60 mm çanak yoğunlukta otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ve plaka kullanarak hücre süspansiyon 10 μL saymak.
    7. Medyayı haftada 2 kez ve gerektiğinde alt kültür hücrelerini yenileyin. Nöronal bazal ortamda istendiğinde tüm nörosferleri dondurun w /o vitamin A %10 DMSO ile desteklendi. Nörosferler P4'ten sonra deneyler için kullanılabilir.

3. Sıçan Dorsal Kök Ganglia (DRGs), Oligodendrositler (OPCs) ve hGCs bölmeli kültür

  1. Bölmeli kültür yemeklerinin hazırlanması
    NOT: DrG'lerin planlanan hasat gününden önceki günlerde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Bölmeli kültür yemeklerini bir araya getirin.
    2. Steril distile H2O 500 μg/mL kolajen stok çözeltisi seyreltin; iyice karıştırın.
    3. Steril transfer pipeti ile 35 mm'lik bir kültür kabını 2 mL kollajen çözeltisi ile doldurun; arkada kollajen ince bir film bırakarak, çözeltiyi çıkarın ve sonraki 35 mm çanak içine yerleştirin. Tüm yemekler kaplanana kadar gerektiğinde daha fazla kollajen çözeltisi ekleyerek bu işlemi tekrarlayın.
    4. Tüm plakalar kaplandıktan sonra, plakaları 245 mm x 245 mm kültür tepsisi içine yerleştirin ve tepsinin ortasına üç 1 mm x 1 mm gazlı bez ped yerleştirin.
    5. Kollajen polimerize etmek için, konsantre amonyum hidroksit 1 mL ile ıslak gazlı bez pedleri ve 15 dakika boyunca tepsileri kaplayın.
    6. Gazlı bez pedleri çıkarın ve 35 mm'lik yemeklerin laminar akış kaputunda kurumasını bekleyin.
    7. Yemekler kururken, şırınga gres aplikatörünün namlusu yüksek vakum yağı ile yükleyin. Bölmeli odaları distile su yla dolu büyük bir ağız lı ortam şişesine yerleştirin. Hem otoklavlama ile sterilize ve soğumasını bekleyin.
    8. Künt bir ipucu vermek için 18-G'lik bir ihtiyaç duyulduğu noktayı dosyala. %70 etanol ile sterilize edin. İğneyi yağ şırıngasına takın.
    9. % 70 etanol ıslatarak pin tırmık sterilize; laminar akış kaputunda hava-kurumasını bekleyin.
    10. Kapağı kuru, kollajen kaplı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Başparmağıve işaretparmağı arasında çanak tutun. Pimtırobunu diğer elinizle tutun. Yemeğin merkezinde 200 μM genişliğinde çizikler oluşturmak için sağlam bir basınç uygulayın.
    11. Bir mera pipet kullanarak, çiziklerin merkezine Takviye Nöronal bazal Orta iki damla yerleştirin.
    12. Tüm yemekler çizilene kadar 3.1.10-3.1.11 adımlarını tekrarlayın.
    13. Bölmeli odaları laminar akış başlığında kurulayın.
    14. Steril hemostatik forceps ile, merkezi bölücü tarafından bir bölmeli oda kavramak. Hemostatik forceps çevirin böylece odanın alt yukarı bakacak.
    15. Silikon gresi bölmeli hazneye, üstten başlayarak uygulayın. Gresin düzgün cerendildiğinden ve her köşeye çakışdığından emin olun.
    16. Kapağı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Çanak ters ve oda üzerinde çizikler yerleştirin. Bir çift forceps ile yavaşça plakanın altına dokunun.
    17. Hemostatik forceps kullanarak plakayı yavaşça ters çevirin. Forcep'leri serbest bırak.
    18. Orta bölmenin tabanına bir yağ yığını yerleştirin. Takviye Nöronal Bazal Orta (NB) ile her oda doldurun ve sızıntıları kontrol edin. Gerektiğinde silikon gres ile sızdırmazlık.
    19. Tüm kültür yemeklerini montajına devam edin ve bir gecede 37°, %5 CO2'desaklayın.
  2. Bölmeli Odada Fare DRG Nöronların ve Kültürünün İzolasyon
    1. Zamanlanmış hamile E16 Sprague-Dawley sıçanı CO2 boğulması veya kimyasal doz aşımı ile kurban edin.
    2. Temiz bir yüzeye supine pozisyonda hayvan yerleştirin; % 70 etanol ile karın dezenfekte.
    3. Forseps ile alt karın deri kavramak ve hafifçe kaldırın.
    4. Makas kullanarak, karın duvarının kaslarını delmemeye dikkat edin, hayvanın orta hattı boyunca bir "I" kesi yapın.
    5. Forceps temiz bir çift ile, kas duvarı kavramak ve rahim veya bağırsak delmek için dikkatli kullanarak makas temiz bir çift ile bir enine kesi yapmak.
    6. Künt forseps bir çift ile, rahim kavramak ve yavaşça periton boşluğundan düz yukarı kaldırın.
    7. Taze, steril makas kullanarak, her rahim boynuzu tabanında bağ dokusu klip.
    8. Steril bir 100 mm doku kültürü çanak tüm rahim yerleştirin.
    9. Diseksiyon için rahim bir laminar akış kaputuna taşıyın.
    10. Embriyoları birer birer amniyotik keseden geçirerek ve embriyoyu hafifçe dışarı çıkararak ve 5 mL L-15 içeren 60 mm'lik bir tabağa 1x kalem-strep ile çıkararak rahimden çıkarın.
    11. İnce büşreler ile 3-4 embriyoları 1x kalem strep ile 5 mL L-15 içeren 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin.
    12. Bir diseksiyon mikroskobu altında ve her seferinde bir embriyo ile çalışmak, decapitation tarafından ötenazi.
    13. Yalan embriyo ventral tarafı yukarı ve bacaklar ve kuyruk kaldırın.
    14. İnce bütüller ile, hayvan bir orta hat kesi yapmak.
    15. Dorsal yapıları ortaya çıkarmak için iç organları ve doku çıkarın, tamamlandığında görünür olmalıdır özellikle omurilik.
    16. Vertebral kolon ve spinal kanal arasında mikro-diseksiyon makas bir bıçak yerleştirin ve dikkatle omurilik ortaya çıkarmak için vertebral sütun ile kesti. Omuriliği kesmemeye dikkat edin.
    17. İnce forsepsile, omuriliğin rostral ucunu hafifçe kavrayın ve yavaşça embriyodan kaldırın. DrG'ler omurilik ve omuriliğine bağlı olacak.
    18. Omurilik ve bağlı DRG'leri 1x kalem-strep ile 2 ml L-15 içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın. Buzun üzerine yerleştirin.
    19. Tüm omurilik izole edildikten sonra, tek tek omurilik DRGs koparmak için ince forceps kullanın. DrG'leri 35 mm'lik taze bir tabağa yerleştirin.
    20. DrG'lerde sinir kökleri varsa, onları kırpın.
    21. 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinden hazırlanmış 35 mm tabakları çıkarın. Ortamı önceki günden kaldırın. Orta bölmeye 10 μM 5-Floro-2'-deoksiürin (FUDR) içeren 80 μL'lik Takviye Nöronal Bazal Medya (NBF) ve her dış bölmeye 250°L ortam yerleştirin.
    22. Her orta bölmeye 2 ganglia yerleştirin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine geri döndürün.
    23. Ertesi gün 2,5 mL NBF ekleyin.
    24. Tablo 1'dekiprogramı izleyen kültürleri besleyin , DRG hazırlığına başlamak için seçilen güne göre programı değiştirin.
    25. 21. günde (veya aksonlar distal bölmelerin sonuna ulaştığında), ya GBM nörosfere sahip tohum kültürleri (Adım 3.2.26'ya geçin) ve canlı görüntü veya oligodendrosit kültürleri ile kültürleri yenilince (Adım 3.3'e geçin) ve gbm nörosferli tohum miyelinasyondan sonra.
    26. %10 FBS içeren Tamamlayıcı NB Medium ile bir GBM nörosfer ile tohumlanacak her distal bölmeli haznede Takviye NB Orta değiştirin.
    27. P20 pipet10 μL'ye ayarlanmış bir ile kültür çanamından bir GBM nörosferi çıkarın. GBM nörosfer boyutu yaklaşık 200 mikron ölçmek gerekir.
    28. Pipetin ucunu distal hazneye yerleştirin ve GBM nörosferini yavaşça dışarı at, böylece orta hazneye en yakın distal odanın orta haznesine en yakın kısmındaki aksonların üzerine, merkez hazneye yakın aksonların üzerine yavaşça düşer. Pipet ucunun aksonları bozmasına dikkat edin.
    29. GBM nörosferin intremiiçin izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat için biyogüvenlik kabininde kültür bırakın.
    30. Nörosfer bağlandıktan sonra, distal bölmedeki ortamı takviye li NB Medium ile çok dikkatli bir şekilde değiştirin.
    31. 3-7 gün boyunca canlı görüntü kültürleri, gerektiğinde medya ekleyerek. Bu durumda, brightfield kullanarak hücre geçişini 7 gün boyunca sürekli olarak izlemek için mikroskoba bağlı kontrollü bir CO2 canlı hücre muhafazası (örneğin, Zeiss Axiovert) kullanılmıştır. Görüntüler ilişkili yazılım kullanılarak her 10 dakikada bir elde edildi. GFP'yi ifade etmek için uygun şekilde transfeced olan hGC'ler kullanılarak aynı protokolü tekrarlayın ve görüntüler brightfield ve 488 nm lazer kombinasyonu kullanılarak yakalandı.
      NOT: Nörosferler lentivirüs ile transdükmedilebilir veya plazmidler veya siRNA'larla transfekte olabilir. Bölmeler de göç çalışma için istenen küçük molekül inhibitörleri ile tedavi edilebilir.
  3. Oligodendrocytes ile DRG Akson Miyelinasyonu
    1. Oligodendrocyte izolasyonundan bir gün önce, DRG'lerde NB Medium'u C-Medium ile değiştirin.
    2. Diseksiyondan önce, 10 mL'lik Papain Tampon'u kuvözdeki 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin.
    3. Laminar akış kaputunda, bir adet 100 mm çanak ve bir adet 60 mm'lik çanak ile buz gibi HBSS doldurun. Buzun üzerine yerleştirin.
    4. Bir P2 fare yavrusunun kafasını keserek kurban edin. Bir makas kullanarak deriyi çıkarın. Deri çıkarıldıktan sonra, ince makas bir çift ile orta hat boyunca kafatası kesti.
    5. Kafatasını ince ponplarla hafifçe çıkarın. Bir spatula kullanarak, yavaşça kafatasının altından beyin kepçe ve ters doku kültürü plaka kapağına transfer.
    6. Beyincik çıkarın ve iki serebral hemisfer içine serebrum bölün. Koku ampulleri kaldırın, hipokampus, ve bazal ganglia her yarımkürenin serebral korteks altında. Serebral korteksini HBSS içeren 100 mm'lik tabağa yerleştirin. Kalan hayvanlar için 3.3.4-3.3.6 adımlarını tekrarlayın.
    7. Bir seferde bir korteks ile çalışma, ince Dumont forceps ile menenjler çıkarın. Tüm menenjitsiz korteksleri HBSS ile 60 mm'lik taze yemeklere yerleştirin.
    8. Kortikal dokuyu 1 mm3 parçaya bölün. Buzun üzerine yerleştirin.
    9. 15 mL tüp içine dengede Papain Tampon yerleştirin. Papain 200 adet ve 2 mg L-sistein ekleyin. Filtre sterilize ve steril DNase I 200 μL ekleyin.
    10. Doğranmış beyin dokusundan HBSS çıkarın ve Papain Tampon ile değiştirin 3.3.2. Çanak 37 °C, % 5 CO2 kuluçka 80 dakika, yavaşça her 15 dakika sallayarak yerleştirin.
    11. Sindirilen dokuyu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 2 mL C-medium ekleyin.
    12. Dokuyu ayrıştırmak için 5 mL serolojik pipet ile trituat; daha büyük doku parçalarının yerleşmesine izin verir. Supernatant'ı çıkarın ve steril 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    13. 2 mL C-Medium ekleyin ve 5 mL serolojik pipet ile bir kez daha triturasyonu tekrarlayın. 1 mL pipet ucuna geçin ve doku tamamen ayrışına kadar triturate. 15 mL tüpe aktarın.
    14. Triturated dokuyu 15 dk için 300 x g'da döndürün.
    15. Önceden ıslak steril 30 μM hücreli süzgeç ile 2 mL PB Tampon. Hücre süzgecini 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve hücre süspansiyonuna bir seferde 1 mL filtre uygulayın. Filtreyi 5 mL PB Arabellek ile durula.
    16. Hücre süspansiyonunun 100 mm bakteriyolojik plakaya aktarılması; mikroglia eklemek için izin vermek için 37 °C,% 5 CO2 kuluçka için 15 dakika kuluçka.
    17. Ortamı çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Plakayı 2 mL DMEM-ITS-G orta sıyla hafifçe durulayın ve 15 mL'lik tüpe aktarın.
    18. Hücre süspansiyonuna nazikçe geri alın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μl trypan mavisi ile seyreltin. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μl'ını sayın.
    19. Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 10 dakika döndürün.
    20. Her 1 x 107 hücre için 70 μL PB Tampon'da hücreleri tamamen aspire edin ve yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
    21. Her 1 x 107 hücre için 20 μl anti-A2B5 mikroboncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    22. Her 1 x 107 hücre için 1-2 mL PB Tampon ve 4 °C santrifüjde 10 dk için 300 x g'de santrifüj ekleyin.
    23. Aspire süpernatant tamamen. 500 μL PB Tampon'da toplam 108 hücreye kadar yeniden askıya alın. Buzda kal.
    24. Bir ayırıcının manyetik alanına manyetik boncuk sütunu yerleştirin.
    25. 500 μL PB Arabellek ile durulayarak sütunu hazırlayın. Hücre süspansiyonu sütuna uygulayın. Akış akışını bir atık kabına atın (bu etiketlenmemiş hücreler içerir).
    26. Kolonu 500 μL PB Arabellek ile 3 kez yıkayın. Akış tan atın.
    27. Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve toplama tüpüne yerleştirin.
    28. Sütunüzerine PB Tampon Pipet 1 mL. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri, pistonu sütuna sıkıca iterek temizle.
    29. Hücre fraksiyonuna 4 mL C-Medium ekleyin ve 10 dk için 300 x g'de döndürün.
    30. 5 mL N2B2 Medium'da süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μL'sini sayın.
    31. Plaka oligodendrocytes 150.000 hücre konsantrasyonu tam genişletilmiş akson ile bir DRG içeren bölmeli oda başına.
    32. Ertesi gün bölme odasındaki ortamı n2B2 olarak değiştirilerek miyelinasyona izin verin. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Miyelin14 gün içinde tamamlanacak.
    33. Gün 14, 3.2.26-3.2.32 gibi bir GBM nörosfer ile tohum kültürü. Herhangi bir deney süresince N2B2 Medium'da miyelinlenmiş kültürleri koruyun.
      NOT: Protokol Şekil 1'deakış şeması şeması olarak sunulmuştur.

Sonuçlar

Aksonlarla hGC'lerin etkileşimini incelemek için, daha önce açıklandığı gibi saflaştırılmış DRG aksonları üretti15,16,17,18. Bu saflaştırılmış DRG aksonlar daha sonra aksonal ağ içinde entegre GFAP +/Ki67+ tümör benzeri yapılar oluşturan hGC'ler ile tohumlanırken, tek tek hGC'ler aksonlar arasında birlikte veya arasında göç ettiler (Şekil 2). HGC...

Tartışmalar

HGC'ler için göç çalışmaları Boyden oda sistemleri veya çizik tahlilleri kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu deneyler diğer çevre dokuları ile tümör hücrelerinin etkileşimleri ile ilgili herhangi bir bilgi vermek için başarısız olsa da, mevcut sistem miyelinatlı ve non-miyelinated lifleri ile GC etkileşimleri özetleyebilir. Ayrıca, tümör oluşumu ve son nokta göç çalışma, kemirgen beyin veya kemirgen beyin veya kanadı içine glioma hücrelerinin in vivo implantasyon organotipik dilim kül...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Brown Üniversitesi'nden N.T.'ye nöroşirürji bölümü dahili fonları tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Suspension Culture DishCorning430591
2.5S NGFENVIGOB.5025
60 mm Suspension Culture DishCorning430589
ACK Lysing BufferThermo FisherA1049201
Ammonium Hydroxide SolutionFisher ScientificA669-500Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)PeprotechAF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, ratMiltenyi Biotec130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo Fisher15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)Miltenyi Biotec130-091-222
B27 SupplementThermo Fisher17504044
B27 Supplement, minus vitamin AThermo Fisher12587001
Bacteriological PlateBD Falcon351029
BiotinSigmaB4639
BSASigmaA9418
Campenot ChamberTyler ResearchCAMP-10
Cell Culture DishCorning43016535mm X 10mm
Cell StrainerBD Falcon35235070 uM, Nylon
Cell StrainerBD Falcon35234030 uM, Nylon
Collagenase/DispaseRoche11097113001
Cultrex Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
D-GlucoseSigmaG5146
DMEMThermo Fisher10313021
DNase ISigmaD7291
Dow Corning High-Vacuum GreaseFisher Scientific14-635-5D
Dumont #5 ForcepsRobozRS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSSSigmaE7510
EGTASigmaE3889
FBSHycloneSH30070.02
FUDRSigmaF0503
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher11765054
HBSSThermo Fisher14175095
Hemostatic ForcepsRobozRS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBSStem Cell Technologies07980
Hypodermic Needle, 18GBD511097
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher41400045
L-CysteineSigmaC7477
L-GlutamineThermo Fisher25030081
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MEMThermo Fisher1190081
Mg2SO4SigmaM2643
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS Columns plus tubesMiltenyi Biotec130-041-301
NACSigmaA8199
NaHCO3SigmaS5761
Neurobasal MediumThermo Fisher21103049
Neurobasal-A MediumThermo Fisher10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140148
Pin RakeTyler ResearchCAMP-PR
ProgesteroneSigmaP8783
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo FisherA1110501
Syrine Grease ApplicatorTyler ResearchCAMP-GLSS
TransferrinSigmaT2036
UridineSigmaU3003

Referanslar

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. . Glioblastoma. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 154Glioma k k h crelerigex vivo modelico k lt rDRG aksonmiyelin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır