使用胶原酶E从毛里结肠分离拉米纳普里亚单核细胞

摘要

该协议的目标是通过使用胶原酶对组织进行酶消化，分离位于结肠层状的单核细胞。该协议允许对单核细胞进行有效分离，从而产生单个细胞悬浮液，进而可用于强健的免疫分体。

摘要

肠道是体内免疫细胞数量最多的家庭。小型和大型肠道免疫系统可调节外源抗原，并调节对强效微生物衍生的免疫刺激的反应。因此，肠道是许多疾病中免疫调节和炎症的主要靶点，包括但不限于炎症性肠病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎、骨后移植物与宿主疾病 （GVHD）骨髓移植（BMT），和许多过敏和传染性疾病。胃肠道炎症和结肠炎的Murine模型被大量用于研究胃肠道并发症和临床前优化预防和治疗策略。通过对肠道免疫细胞的分离和型板分析从这些模型中收集的数据对于进一步了解可应用于改善胃肠道和全身炎症疾病的免疫理解至关重要。本报告描述了使用混合硅基密度梯度界面将单核细胞（MNC）从结肠分离的高效方案。该方法可重复分离大量可行的白细胞，同时最大限度地减少污染碎片，从而允许随后通过流式细胞仪或其他方法进行免疫型型。

引言

虽然胃肠道 （GI） 主要致力于处理和重新吸收来自食物的营养物质，但胃肠道也保持在血管、淋巴和神经系统以及许多其他器官的完整性中的核心作用。其粘膜和亚粘膜^{免疫系统1。}GI免疫系统在胃肠道和全身健康中都具有影响作用，因为它经常接触来自食物、共体细菌或入侵^{病原体1、2}的外来抗原。因此，GI免疫系统必须保持一个微妙的平衡，在其中它容忍非致病性抗原，同时适当响应致病性^{抗原1，2。}当耐受性和防御的平衡被打乱时，局部或全身免疫失调和炎症可能导致无数的疾病1，2，3。

肠中至少有70%的淋巴细胞在^体内4。大多数初级免疫学相互作用涉及肠道中三个免疫站中的至少一个:1）佩耶尔的贴片，2）皮内淋巴细胞（IEL）和3）拉米纳表体淋巴细胞（LPL）。其中每一个都由一个复杂的免疫细胞互联网络组成，对^肠道5的正常免疫挑战作出快速反应。限于肌肉粘膜上方的频闪，松散的层状膜是肠道粘膜的结缔组织，包括软体、血管、淋巴排水和粘膜神经系统的脚手架，以及许多与生俱来和自适应免疫子集^{6，7，8，9}。LPL^由CD4+和CD8+T细胞组成，近似比例为2:1，血浆细胞和骨髓体细胞包括，树突状细胞、乳腺细胞、嗜酸性细胞和巨噬^细胞6。

人们越来越有兴趣了解肠道的免疫调节和炎症，因为它涉及到各种疾病状态。克罗恩病和溃疡性结肠炎等疾病都表现出不同程度的结肠炎10，11，12。此外，接受异体骨髓移植（Allo-BMT）的骨髓或免疫系统的恶性或非恶性疾病患者可以发展各种形式的结肠炎，包括1）从调理方案直接毒性在BMT之前，2）由BMT和3）移植-宿主疾病（GVHD）后由供体型T细胞驱动，在BMT^13、14、15之后对组织中的供体异抗原作出反应，由免疫抑制引起的感染。所有这些后BMT并发症导致肠道的免疫环境显著改变16，17，18。该方法允许对小鼠结肠中的免疫细胞积累进行可靠的评估，在BMT之后应用于小鼠受体时，有助于对参与移植耐受性中的供体和受体免疫细胞进行有效^{检测19 ，20}.肠道炎症的其他原因包括恶性肿瘤、食物过敏或肠道微生物群的中断。该协议允许从结肠进入肠道单核细胞，并经修改后，在临床前小鼠模型中访问小肠的白细胞。

使用搜索词"肠道和免疫细胞和分离"的PubMed搜索揭示了200多个出版物，描述了小肠消化提取免疫细胞的方法。然而，对结肠的类似文献搜索没有产生指定免疫细胞与结肠分离的精心划定的协议。这可能是因为结肠有更肌肉和间质层，使其更难完全消化比小肠。与现有协议不同，该协议专门使用不含其他细菌胶原酶（胶原酶 D/胶原酶 I）的胶原酶 E。我们证明，使用该协议，可以在保持分离的肠道单核免疫细胞（MNC）质量的同时，实现结肠组织的消化，而无需添加抗结块试剂，如醋酸钠（EDTA）、Dispase II和脱氧核糖核酸I（脱氧核糖核酸I）21，22，23 。该协议经过优化，允许从鼠结肠中可重复的强健提取可存活的MNC，以便进一步定向研究，并应有助于研究结肠的免疫学或（有修改）小^肠24，25.

研究方案

所有研究均根据迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的啮齿动物研究规程进行，该委员会符合美国协会制定的兽医标准实验室动物科学（AALAS）。

1. 准备解决方案

1. 如表1所述，制备结肠缓冲液、硅基密度分离介质100%、硅基密度分离介质66%、硅基密度分离介质44%、胶原酶E消化缓冲液和FACS缓冲液。
   1. 在手术前一天准备结肠缓冲液，并在4°C储存过夜。
   2. 在手术前一天准备100%硅基密度分离介质，在4°C下储存过夜，在程序解冻的早晨置于室温下。
   3. 在隔离的早晨，使用室温100%硅基密度分离介质和结肠缓冲液，制备66%和44%硅基分离介质。
   4. 测量适当量的梭菌性溶酶-衍生的胶原酶E，并在手术前一夜之间储存在-20°C。第二天早上，溶解在适当的结肠缓冲液体积中，以派生胶原酶消化缓冲液。对于在手术当天使用胶原酶消化缓冲液进行的所有孵育，将溶液预热至37°C。
2. 对于整个协议步骤，将一台离心机保持在20°C，旋转速度为859 x g，制动器灭活（0减速），用于梯度离心。将另一个设置为 4 °C，旋转速度为 859 x g，标准减速，用于洗涤步骤。

2. 收获结肠

1. _通过CO2窒息使小鼠安乐死，然后采用AALAC批准的确认方法。
2. 将鼠标置于一个苏皮的位置，用 70% 乙醇喷洒毛皮。使用大型组织剪刀，做一个垂直的中线切口，并暴露完整的围肠。
3. 使用精细解剖剪刀，打开围肠。使用钳子将小肠移到一侧，并露出降序。在降序上稍微向上拉，以最大程度地暴露结肠的直肠部分。切离骨盆深处的远端直肠，解剖并切除整个结肠作为一个单元，从远端直肠到头盖。
4. 在 50 mL 聚丙烯管中将结肠在 20 mL 冷冻结肠缓冲液中转移。

3. 清洁结肠

1. 将结肠放在湿润的纸巾上，用剪刀或钳子的钝端对肠壁施加温和压力，提取固体粪便。
2. 将结肠放入培养皿中，使用 10 mL 的注射器用 18 G 钝填充针冲洗肠道，并冲洗 10 mL 的冷冻结肠缓冲液。
3. 转移结肠到结肠缓冲湿纸巾，并删除与剪刀的锋利端的吸血和脂肪。
4. 将结肠放入装有 5-10 mL 冷冻结肠缓冲液的培养皿中，手动搅拌以清洗剩余的结肠内容物。重复2-3次。
5. 在充满新鲜冷冻结肠缓冲液的培养皿中纵向切割结肠，从其更肌肉的直肠末端到近端结肠（生成单个矩形开放结肠片）。丢弃现有介质，用清洁的冷冻结肠缓冲液重新填充。
6. 洗肠3次，在培养皿中大力旋转，每次洗涤后更换5-10 mL的冷冻结肠缓冲液。
7. 将矩形结肠组织放在用结肠缓冲液湿润的纸巾上，然后水平切片，然后切成小碎片（3 毫米 x 3 毫米部分）。）。
8. 在50mL聚丙烯锥形管中小心地用细钳子将结肠碎片收集到20mL的冷冻结肠缓冲液中。
9. 洗3次结肠碎片，每次洗在20mL结肠缓冲液中，通过大力旋转管30s。每次搅拌之间，让组织碎片沉降到管的底部。脱脂或真空吸出上清液，同时防止每次洗涤之间的吸入过程中组织片段丢失。
   注:每次清洗后无需更换管子。

4. 胶原酶消化 1

1. 在 50 mL 聚丙烯锥形管中洗涤的结肠碎片中加入 20 mL 的胶原酶消化缓冲液。
2. 将封闭的50 mL管置于37°C的孵育轨道摇床中，旋转速率设定在2 x g60分钟。确保组织碎片在搅拌过程中保持恒定运动;如有必要，逐步提高旋转速率，以确保没有组织碎片沉降到管底部。

5. 准备基于硅的分离介质梯度

1. 在 20°C（室温）和结肠缓冲液下使用 100% 硅基密度分离介质制备 66% 和 44% 硅基密度分离介质。
2. 将 5 mL 的 66% 硅基密度分离介质倒入 3 个独立的 15 mL 聚丙烯管中。每结肠准备3管。这构成了梯度隔离过程的高密度基础，将低密度分离介质分层以创建分离梯度。
3. 储存在20°C，直到使用。

6. 从消化1收集上清液

1. 在胶原酶消化1完成后，仅使用25 mL血清学移液器收集上清液，并通过40μm孔过滤织物细胞滤网过滤液过滤液，放入干净的50 mL聚丙烯锥管中过滤上清液。小心不要吸出任何现有的组织碎片。
   注:保留管中剩余的可见组织片段。这些将经历第二胶原酶消化（步骤8）。

7. 淬火胶原酶消化缓冲液

1. 用冷冻结肠缓冲液完全填充 50 mL 聚丙烯管。
   注:胶原酶在37°C时活性;因此，冷冻缓冲液使这种酶失去活性。
2. 在 4°C 下将管在 800 x g下离心 5 分钟。
   1. 通过真空吸气丢弃上清液。用25 mL的新鲜结肠缓冲液和800 x g的离心机清洗细胞5分钟。
   2. 在1mL以下的新鲜冷冻结肠缓冲液中重新悬浮颗粒。
   3. 将 50 mL 聚丙烯锥形管放在冰上。

8. 胶原酶消化 2

1. 重复步骤 4（消化 1），从步骤 6.1 保留剩余的组织片段。

9. 消化后组织分解 2

1. 通过18 G钝端针头在管子和10 mL注射器之间剧烈地冲洗组织碎片。
2. 重复此刷新至少 7-8 个完整的通道，直到看不到毛组织碎片或碎片为止。

10. 过滤单元格

1. 将组织分解悬浮液通过40μm孔过滤织物细胞过滤器放入清洁的50 mL聚丙烯管中。
2. 用 10 mL 冷冻结肠缓冲液清洗过滤织物细胞过滤器，以回收过滤器中任何包裹的细胞。

11. 淬火胶原酶消化

1. 用冷冻结肠缓冲液将 50 mL 聚丙烯锥形管填充到边缘。
   注:结肠缓冲液的温度对于确保胶原酶活性的淬火至关重要。
2. 在 4 °C 和 800 x g下旋转 5 分钟。
3. 通过真空吸气丢弃上清液。
4. 在25 mL的新鲜冷冻结肠缓冲液中重新悬浮洗涤，随后在4°C下离心，800 x g，5分钟。
5. 通过真空吸气丢弃上清液。
6. 从步骤 11.4 将从胶原酶消化 1（步骤 7）的重新悬浮颗粒汇集到相应的管中。
7. 重复步骤 11.4（洗涤和离心）。

12. 硅基密度分离介质梯度分离

注:尽快执行步骤12-18，以确保胶原酶活性的快速淬火。

1. 按照步骤11.7，将每粒颗粒重新悬浮在24 mL中，每结肠的硅基密度分离介质为44%。
2. 使用 10 mL 血清移液器将介质从步骤 12.1 缓慢地分层到步骤 5.2 中制备的三根管中每个管（包含 66% 硅基密度分离介质）。保持 44% 密度分离介质的稳定缓慢流动，同时对渐变进行分层，以避免接口中断。
3. 使用称重秤或天平仔细平衡离心机铲斗内的所有管。
4. 在离心机中，在 859 x g下旋转管 20 分钟，在 20°C 下不制动。在拆卸管子之前，让转子完全休息，注意不要破坏梯度界面上的细胞。

13. 从梯度界面收集单核细胞

1. 可视化渐变界面（靠近 5 mL 标记），其中通常存在 1-2 mm 厚的白色带（包含 MNC）。
   注:一个人可能看到也可能看不到白色带。但是，MNC 将位于此接口中，并且应云化渐变接口的清晰度。
2. 真空吸气并丢弃顶部渐变的顶部 7 mL，以便更容易地将移液器访问接口。
3. 使用连续手动吸力和稳定的手腕旋转运动，将细胞的界面层收集到干净的 50 ml 聚丙烯锥形管中。收集，直到两个梯度之间的界面是清晰和折射（清除细胞）。
4. 在收集管中填充 50 mL 的冷冻 FACS 缓冲液。在 4 °C 下旋转，800 x g旋转 5 分钟。
5. 通过真空吸气吸气吸气上清液，在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒。
6. 使用适当的死细胞排除方法，以1:2稀释计算血细胞仪上的细胞。
7. 使用新鲜分离的结肠MNC进行FACS染色或其他检测。

结果

当使用鼠结肠疾病模型时，能够量化和定性评估结肠的MNC中涉及炎症过程的多个免疫细胞子集是有帮助的。通过应用该协议获得的MNC的单细胞悬浮液，有助于以稳健且可重复的方式进行表型表征。作为在各种实验环境下应用这种分离方法的原理证明，我们使用这种方法检索了结肠MNC，并在从小鼠身上分离的细胞上进行了多参数流细胞测定（图1?...

讨论

此视觉协议描述了用于分离结肠单核细胞（包括拉米那体淋巴细胞 （LPL）的耐受性好的方法。鉴于此方案在评估严重的移植后小鼠结肠炎模型时进行了优化，其中炎症细胞因子和组织损伤导致恢复的MNC生存能力较差，我们预计这些方法可以转化为其他需要结肠MNC的型态分析的应用程序。这些包括，但不限于评估炎症性肠病小鼠模型中的结肠炎症，研究结肠炎靶向治疗的免疫反应，以及传染性病原...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri DIsh	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4100
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes	TruLine	TR2002
18 G Blunt Needle	Becton Dickinson	305180
25 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4250
40 μm pore size Cell Strainer	Corning	352340
50 mL Falcon Tube	Corning	21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503-1KG
Fixation Buffer	Biolegend	420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum	Sigma	C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution	Amresco	E177-500ML
Fetal Bovine Serum	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI Medium	Corning	17-105-CV
Sodium Azide	VWR Life Science Amresco	97064-646
Trypan Blue	Lonza BioWhittaker	17-942E