בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

Abstract

המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.

Introduction

למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal¹. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים^1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים^1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות^1,2,3.

המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף⁴. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן⁵. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית^6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים⁶.

יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס^10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt^13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים^16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה^{19 ,20}. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.

חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש "המעי והתא החיסונית ובידוד" חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)^21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק^24, . ^{עשרים וחמש}

Protocol

כל המחקרים נערכו תחת פרוטוקולי מחקר מכרסמים שנסקרו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי מילר בית הספר לרפואה, אשר עונה על הסטנדרטים הוטרינרים שנקבעו על ידי האגודה האמריקנית עבור מדע בעלי חיים במעבדה (AALAS).

1. הכנת פתרונות

1. כפי שמתואר בטבלה 1, להכין את מאגר המעי הגס, מבוסס סיליקה צפיפות ההפרדה מדיה 100%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 66%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 44%, כגון מאגר העיכול E, ו-FACS מאגר.
   1. הכן את מאגר המעי הגס ביום שלפני ההליך ואחסן לילה ב -4 ° c.
   2. להכין 100% סיליקה מבוסס צפיפות מדיה הפרדה ביום לפני ההליך ומאוחסן לילה ב 4 ° c, הצבת טמפרטורת החדר בבוקר של ההליך להפשיר.
   3. הכינו 66% ו-44% מדיית הפרדה מבוססת סיליקה בבוקר הבידוד, באמצעות טמפרטורת החדר 100% מבוסס על דחיסות סיליקה הפרדה מדיה ומאגר קולון.
   4. למדוד את הכמות המתאימה של היסטרידיוםהנגזרים-הנגזרת הקולגן וחנות ב-20 ° c לילה לפני ההליך. למחרת בבוקר, מתמוסס את הנפח המתאים של מאגר המעי הגס לגזור מאגר העיכול קולגן. עבור כל incubations עם מאגר העיכול קולגן ביום ההליך, לחמם מראש את הפתרונות 37 ° c.
2. עבור כל שלבי הפרוטוקול, לשמור צנטריפוגה אחת ב 20 ° צ' ואת מהירות הסיבוב של 859 x g, עם הבלמים מופעל (0 להאט) עבור הדרגתי צנטריפוגה. הגדר אחר ל -4 ° צ' ומהירות סיבוב של 859 x g, עם ההאטה הסטנדרטית, לשטיפת המדרגות.

2. קצירת המעי הגס

1. המתת חסד העכבר באמצעות שיתוף₂ חנק ואחריו aalac מאושר confirmatory שיטה.
2. מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הפרווה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים הרקמה הגדולה, לעשות חיתוך קו האמצע אנכית לחשוף את צפק שלם.
3. , שימוש במספריים לחיתוך משובח. פתח את הצפק מלקחיים להשתמש כדי להזיז את המעי הקטן בצד אחד ולחשוף את המעי הגס יורד. משוך מעט כלפי מעלה על המעי הגס יורד כדי לחשוף את החלק הרקטלי של המעי הגס. חותכים את הרקטום העמוק באגן ומנתחים ומסירים את המעי הגס כולו כיחידה אחת, מהרקטום המרוחק לכובע cecal.
4. העבר את המעי הגס ב 20 mL מקורר מאגר קולון בצינור פוליפרופילן 50 mL.

3. ניקוי המעי הגס

1. מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחלח לחלץ את הצואה מוצק על ידי החלת לחץ קל על קיר המעי עם קצה קהה של מספריים או מלקחיים.
2. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ומרוקן את הבטן עם 10 מ ל של מאגר קולון מקורר באמצעות מזרק 10 מ ל עם 18 גרם מילוי קהה.
3. העבר את המעי הגס למאגר של מאגר המעי הגס, והסר את המצע המעי והשומן עם הקצה החד של המספריים.
4. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 mL מקורר מאגר המעי הגס מאוד באופן ידני כדי לשטוף את השאר תוכן חוקן. חזור על 2-3 פעמים.
5. חותכים את longitudinally המעי הגס מן הקצה שלה שרירי יותר המעי הגס האבובית (יצירת פיסת המעי הגס בודד פתוח מלבני) בצלחת פטרי מלא עם מאגר המעי הגס טרי מקורר. התעלם ממדיה קיימת ומלא מילוי עם מאגר נקודתיים נקי ומקורר.
6. לשטוף את המעי 3 פעמים על ידי במרץ מתערבל אותו בצלחת פטרי והחלפת 5-10 mL של מאגר קולון מקורר לאחר עם כל כביסה.
7. מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר שלחלח מאגר המעי הגס וחותכים אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לרסיסים קטנים (3 מ"מ x 3 מ"מ סעיפים).
8. לאסוף את שברי המעי הגס בזהירות באמצעות מלקחיים עדין לתוך 20 מ"ל מקורר מאגר קולון בשפופרת פוליפרופילן 50 mL.
9. לשטוף את שברי המעי הגס 3 פעמים, כל לשטוף ב 20 מ"ל מאגר המעי הגס, על ידי מתערבל במרץ את הצינור עבור 30 s. בין כל עצבנות, לאפשר שברי הרקמה להתיישב בתחתית הצינור. Decant או ואקום משאוב את supernatant תוך מניעת אובדן של הרקמה בתהליך השאיפה בין כל כביסה.
   הערה: אין צורך לשנות את הצינור לאחר כל כביסה.

4. קולגן העיכול 1

1. הוסף 20 מ ל של מאגר העיכול קולגן כדי שברי המעי הגס שטוף בצינור 50 mL פוליפרופילן חרוט.
2. מניחים את הצינור הסגור 50 mL ב 37 ° c בתוך שייקר מסלולית מודחטת עם קצב הסיבוב להגדיר ב 2 x g עבור 60 דקות. להבטיח את שברי הרקמה בתנועה מתמדת במהלך עצבנות; במידת הצורך, הגדילו את קצב הסיבוב בהדרגה כדי להבטיח שרסיסי רקמות לא יתיישבו לתחתית הצינורית.

5. הכנת מעברי צבע סיליקה מבוססי מדיה הפרדה

1. הכינו 66% ו 44% מבוסס על דחיסות סיליקה מדיה הפרדה, באמצעות 100% מבוסס סיליקה צפיפות מדיה הפרדה ב 20 ° צ' (טמפרטורת החדר) ומאגר קולון.
2. יוצקים 5 מ ל של 66% מבוסס סיליקה דחיסות הפרדה מדיה לתוך כל אחד 3 שונים 15 מ ל צינורות פוליפרופילן. להכין 3 צינורות לכל המעי הגס. פעולה זו מהווה את בסיס הצפיפות הגבוהה יותר של פרוצדורת הבידוד של מעבר הצבע, שאליה מדיה הפרדה בצפיפות נמוכה יותר תהיה שכבתית כדי ליצור את מעבר הצבע של ההפרדה.
3. החנות ב -20 ° c עד השימוש.

6. אוסף של סופרנטאנט מעיכול 1

1. לאסוף רק את supernatant באמצעות צינורות 25 מ ל ולסנן את supernatant באמצעות הנקבוביות 40 יקרומטר מסננת תא בד הממוקם לתוך צינור נקי של פוליפרופילן 50 mL, לאחר העיכול מקולגן 1 הושלמה. להיזהר לא לאכול כל שברי רקמה קיימים.
   הערה: שמור את כל חלקי הרקמה הגלויים בצינור. אלה יעברו העיכול השני הקולגן (שלב 8).

7. קוצ'ינג מאגר העיכול

1. למלא את צינור פוליפרופילן 50 mL לחלוטין עם מאגר קולון מקורר.
   הערה: קולאגנאז פעיל ב 37 ° c; מכאן מאגר מקורר מפעיל את האנזים.
2. צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° צ' ב 800 x g עבור 5 דקות.
   1. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום. לשטוף תאים עם 25 מ ל של מאגר קולון טריים צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות.
   2. השהה מחדש את הגלולה בפחות מ-1 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר.
   3. מניחים את שפופרת פוליפרופילן 50 mL על קרח.

8. מיכל העיכול 2

1. חזור על שלב 4 (עיכול 1) עם שברי הרקמה הנותרים שנשמרו משלב 6.1.

9. מצבור רקמות לאחר העיכול 2

1. ריקון שברי הרקמה הלוך ושוב בין הצינור ומזרק 10 מ ל דרך מחט 18 G קהה-end.
2. חזור על רצף זה למינימום של 7-8 מעברים מלאים, והמשך עד שלא ניתן לראות שברי רקמה ברוטו או פסולת.

10. סנן תאים

1. להעביר את הבולם את הרקמה השעיה דרך מסננת מ40 μm-הנקבוביות תא בדים במרקם לתוך שפופרת נקי של פוליפרופילן 50 mL.
2. לשטוף את הסינון תא בד מסננת עם 10 mL מקורר מאגר קולון כדי לשחזר את כל התאים הנסנרות במסנן.

11. קוצ'ינג קולינג העיכול

1. ממלאים את צינור 50 mL פוליפרופילן חרוט לחישוק עם מאגר קולון מקורר.
   הערה: הטמפרטורה של מאגר המעי הגס הוא קריטי כדי להבטיח מקוצ'ינג של פעילות הקולגן.
2. ספין ב 4 ° צ' ו 800 x g עבור 5 דקות.
3. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
4. לשטוף על ידי השעיית מחדש 25 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר, ואחריו צנטריפוגה ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
5. השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
6. הבריכה את הגלולה מושעה מ העיכול הקולגן 1 (שלב 7) לצינור המקביל שלה משלב 11.4.
7. חזור על שלב 11.4 (שטוף וצנטריפוגה).

12. הפרדת מדיה בצפיפות סיליקה מבוססת הפרדה

הערה: בצע את שלבים 12-18 במהירות האפשרית, כדי להבטיח מהירות מהירה של פעילות הקולגן.

1. לאחר שלב 11.7, השהה מחדש כל גלולה ב-24 מיל סך של 44% מדיית הפרדה בדחיסות מבוססת סיליקה לכל נקודתיים.
2. שכבה איטית 8 מ ל של התקשורת משלב 12.1 על כל אחד משלושת הצינורות המוכנים בשלב 5.2 (המכיל 66% הפרדה בצפיפות ההפרדה מדיה), באמצעות צינורות 10 מ"ל. שמור על זרימה יציבה ואיטית של 44% מדיית הפרדת הצפיפות באמצעות שכבות המילוי על מנת למנוע הפרעה של הממשק.
3. איזון בזהירות כל הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות קנה מידה או שיווי משקל.
4. ספין את הצינורות 20 דקות ב 859 x g בצנטריפוגה ללא בלם ב 20 ° c. אפשר לרוטורי להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, ומטפלים לא לשבש את התאים בממשק מעבר הצבע.

13. לאסוף תאים מונמונומנט מתוך ממשק מעבר צבע

1. המחש את ממשק מעבר הצבע (קרוב ל-5 מ"ל), שם בדרך כלל להקה לבנה בעובי 1-2 מ"מ (המכילה MNC) קיימת.
   הערה: אחד יכול או לא יכול לראות להקה לבנה. עם זאת, MNC יהיה בממשק זה, צריך לענן את הבהירות של ממשק מעבר הצבע.
2. ואקום משאוב ולהשליך את העליון 7 מ ל של מעבר הצבע העליון כדי לאפשר הפיפטה קל גישה לממשק.
3. באמצעות יניקה ידני שאיבה רציפה תנועה יציבה מסתובבת, לאסוף את שכבת הממשק של תאים לתוך צינור נקי 50 mL פוליפרופילן חרוט. לאסוף עד הממשק בין 2 הדרגתיות הוא ברור ו שבירה (ניקוי של תאים).
4. ממלאים את צינור האוסף עם 50 mL של מאגר FACS מקורר. ספין ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
5. לשאוב את הסופר באמצעות שאיפה ואקום ולהשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר FACS.
6. לספור את התאים על הומוציטוטומטר בדילול 1:2 באמצעות שיטות אי הכללה של תא מת מתאים.
7. המשך לצביעת FACS או מספר אחר עם המעי הגס מבודד טרי MNC.

תוצאות

כאשר עובדים עם מחלת המעי הגס מודל מודלים, זה מועיל להיות מסוגל להעריך הן לכמת באיכות איכותית, בין MNC של המעי הגס, מספר קבוצות מערכות החיסון מעורב בתהליך דלקתי. השעיית תא יחיד של MNC שהושג באמצעות היישום של פרוטוקול זה מאפשר אפיון פנוסטילי כזה בצורה איתנה וללא שימוש. כהוכחה ל?...

Discussion

פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri DIsh	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4100
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes	TruLine	TR2002
18 G Blunt Needle	Becton Dickinson	305180
25 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4250
40 μm pore size Cell Strainer	Corning	352340
50 mL Falcon Tube	Corning	21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503-1KG
Fixation Buffer	Biolegend	420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum	Sigma	C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution	Amresco	E177-500ML
Fetal Bovine Serum	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI Medium	Corning	17-105-CV
Sodium Azide	VWR Life Science Amresco	97064-646
Trypan Blue	Lonza BioWhittaker	17-942E