Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

Resumen

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Resumen

El intestino es el hogar del mayor número de células inmunitarias en el cuerpo. Los sistemas inmunitarios intestinales pequeños y grandes controlan la exposición a antígenos exógenos y modulan las respuestas a potentes estímulos inmunes derivados microbianamente. Por esta razón, el intestino es un sitio objetivo importante de la desregulación inmune y la inflamación en muchas enfermedades, incluyendo pero, no limitado a enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) después de hueso hueso trasplante de médula (BMT), y muchas afecciones alérgicas e infecciosas. Los modelos murinos de inflamación gastrointestinal y colitis se utilizan en gran medida para estudiar las complicaciones gastrointestinales y para optimizar previamente las estrategias para la prevención y el tratamiento. Los datos obtenidos de estos modelos a través del aislamiento y el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino son fundamentales para una mayor comprensión inmune que se puede aplicar para mejorar los trastornos inflamatorios gastrointestinales y sistémicos. Este informe describe un protocolo altamente eficaz para el aislamiento de células mononucleares (MNC) del colon utilizando una interfaz de gradiente de densidad basada en sílice mixta. Este método aísla reproduciblemente a un número significativo de leucocitos viables al tiempo que minimiza los desechos contaminantes, permitiendo el fenotipado inmune posterior por citometría de flujo u otros métodos.

Introducción

Aunque el tracto gastrointestinal (GI) se dedica principalmente al procesamiento y reabsorción de nutrientes de los alimentos, el tracto gastrointestinal también mantiene roles centrales en la integridad de los sistemas vascular, linfático y nervioso y de numerosos otros órganos a través de su sistema inmunológico mucoso y submucoso¹. El sistema inmunitario GASTROINTESTINAL tiene un papel influyente en la salud gastrointestinal y sistémica debido a su exposición constante a antígenos extraños de alimentos, bacterias comensales o patógenos invasores^1,2. Por lo tanto, el sistema inmunitario GI debe mantener un delicado equilibrio en el que tolera antígenos no patógenos, respondiendo adecuadamente a los antígenos patógenos^1,2. Cuando se interrumpe el equilibrio de tolerancia y defensa, se puede localizar o sistémicamente la desregulación inmune y la inflamación, lo que resulta en una miríada de enfermedades^1,2,3.

El intestino alberga al menos el 70% de todas las células linfoides del cuerpo⁴. La mayoría de las interacciones inmunológicas primarias involucran al menos una de las tres estaciones inmunitarias en el intestino: 1) Parches de Peyer, 2) linfocitos intraepiteliales (IEL) y 3) linfocitos de lamina propria (LPL). Cada uno de ellos se compone de una compleja red interconectada de células inmunitarias que responden rápidamente a los desafíos inmunes normales en el intestino^5. Restringida al estroma por encima de las mucosas musculares, la lámina propria de estructura suelta es el tejido conectivo de la mucosa intestinal e incluye andamios para la vellosidad, la vasculatura, el drenaje linfático y el sistema nervioso de la mucosa, así como muchos innatos y subconjuntos inmunes adaptativos^6,7,8,9. LPL se componen de células CD4⁺ y CD8⁺ T en una proporción aproximada de 2:1, células plasmáticas y células de linaje mieloides incluyendo, células dendríticas, células de mástil, eosinófilos y macrófagos⁶.

Hay un creciente interés en entender la desregulación inmune y la inflamación del intestino, ya que se refiere a varios estados de la enfermedad. Tales condiciones como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa todos manifiestan diferentes niveles de inflamación del colon^10,11,12. Además, los pacientes con trastornos malignos o no malignos de la médula o del sistema inmunitario que se someten a un trasplante alogénico de médula ósea (alo-BMT) pueden desarrollar diversas formas de colitis, incluyendo 1) toxicidad directa por regímenes de acondicionamiento antes de BMT, 2) infecciones causadas por inmunosupresión después de la Enfermedad contra huésped de injerto contra huésped (EICH) impulsadapor por células T de tipo donante reaccionando a los antígenos alógenos de donantes en los tejidos después de BMT^13,14,15. Todas estas complicaciones post-BMT resultan en alteraciones significativas en el ambiente inmune de los intestinos^16,17,18. El método propuesto permite una evaluación fiable de la acumulación de células inmunitarias en el colon del ratón y, cuando se aplica a los receptores murinos después de la BMT, facilita un ensayo eficiente de las células inmunitarias de los donantes y receptores implicadas en la tolerancia al trasplante^{19 ,20}. Otras causas de inflamación intestinal incluyen neoplasias malignas, alergias alimentarias o alteración del microbioma intestinal. Este protocolo permite el acceso de células mononucleares intestinales desde el colon y, con modificaciones, a leucocitos del intestino delgado en cualquiera de estos modelos murinos preclínicos.

Una búsqueda de PubMed utilizando los términos de búsqueda "intestino y aislamiento de células inmunitarias Y" revela más de 200 publicaciones que describen métodos para la digestión del intestino delgado para extraer células inmunitarias. Sin embargo, una búsqueda de literatura similar para el colon no produce protocolos bien delineados que especifican el aislamiento de las células inmunitarias del colon. Esto puede deberse a que el colon tiene más capas musculares e intersticiales, lo que hace más difícil digerir completamente que el intestino delgado. A diferencia de los protocolos existentes, este protocolo utiliza específicamente la colagenasa E de Clostridium histolyticum sin otras colagenasas bacterianas (Collagenasa D/Collagenasa I). Demostramos que, utilizando este protocolo, se puede lograr la digestión del tejido colonico preservando la calidad de las células inmunitarias mononucleares intestinales aisladas (MNC) sin la adición de reactivos anti-aglutinantes como el alfrente de sodio (EDTA), Dispase II, y desoxirribonuclea I (DNAse I)^21,22,23. Este protocolo está optimizado para permitir la extracción robusta reproducible de MNC viable del colon murino para estudios más dirigidos y debe prestarse al estudio de la inmunología del colon o (con modificaciones) del intestino delgado^{24, 25}.

Protocolo

Todos los estudios se llevaron a cabo bajo protocolos de investigación de roedores revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina Miller de la Universidad de Miami, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la Asociación Americana para Ciencias Animales de Laboratorio (AALAS).

1. Preparación de soluciones

1. Como se describe en la Tabla 1, prepare el búfer de colon, los medios de separación de densidad basados en sílice 100%, los medios de separación de densidad basados en sílice 66%, los medios de separación de densidad basados en sílice 44%, el búfer de digestión de colagenasa E y el búfer FACS.
   1. Preparar el búfer de colon el día anterior al procedimiento y conservar durante la noche a 4oC.
   2. Preparar los medios de separación de densidad 100% basados en sílice el día anterior al procedimiento y almacenarse durante la noche a 4 oC, colocando a temperatura ambiente la mañana del procedimiento para descongelar.
   3. Preparar medios de separación basados en sílice 66% y 44% en la mañana del aislamiento, utilizando la temperatura ambiente 100% Medios de Separación de Densidad Basados en Sílice y Tampón de Colon.
   4. Mida la cantidad adecuada de Colágenoasa E derivada de Clostridium histolyticumy guárdela a -20 oC durante la noche antes del procedimiento. A la mañana siguiente, disolver en el volumen adecuado de Tampón de Colon para derivar búfer de digestión de colagenasa. Para todas las incubaciones con búfer de digestión de la colagenasa el día del procedimiento, precaliente las soluciones a 37oC.
2. Para la totalidad de los pasos del protocolo, mantenga una centrífuga a 20oC y la velocidad de rotación de 859 x g,con frenos desactivados (0 desaceleración) para centrifugación de gradiente. Fije otro a 4 oC y velocidad de rotación de 859 x g,con la desaceleración estándar, para los pasos de lavado.

2. Cosecha del Colón

1. Euthanizar el ratón a través de la asfixia CO₂ seguido de método de confirmación aprobado por AALAC.
2. Coloque el ratón en posición supina y rocíe el pelaje con un 70% de etanol. Usando tijeras de tejido grandes, haga una incisión vertical de línea media y exponga el peritoneo intacto.
3. Con tijeras de disección fina, abra el peritoneo. Utilice fórceps para mover el intestino delgado hacia un lado y exponer el colon descendente. Tire ligeramente hacia arriba sobre el colon descendente para exponer al máximo la porción rectal del colon. Corta el recto distal profundo en la pelvis y disecciona y extrae todo el colon como una unidad, desde el recto distal hasta la tapa cecal.
4. Transfiera el colon en 20 ml de tampón de colon refrigerado en un tubo de polipropileno de 50 ml.

3. Limpieza del Colon

1. Coloque el colon sobre una toalla de papel humedecida y extraiga las heces sólidas aplicando una presión suave en la pared intestinal con el extremo romo de las tijeras o fórceps.
2. Coloque el colon en una placa De Petri y enjuague el intestino con 10 ml de tampón de colon refrigerado con una jeringa de 10 ml con aguja de relleno romo de 18 G.
3. Transfiera el colon a una toalla de papel humedecida de Colon Buffer y retire el mesentery y la grasa con el extremo afilado de las tijeras.
4. Coloque el colon en un plato de Petri lleno de 5-10 ml de tampón de colon refrigerado agitando manualmente para lavar el contenido colono restante. Repita 2-3 veces.
5. Cortar el colon longitudinalmente desde su extremo rectal más musculoso hasta el colon proximal (generando una sola pieza rectangular de colon abierto) en una placa De Petri llena de tampón de colon fresco frío. Deseche los medios existentes y rellene con el búfer de colon frío limpio.
6. Lave el intestino 3 veces arremolinando vigorosamente en el plato petri y reemplazando los 5-10 ml de tampón de colon refrigerado después de cada lavado.
7. Coloque el tejido rectangular del colon en una toalla de papel humedecida con Tampón de Colon y córtelo cortándolo horizontalmente y luego en pequeños fragmentos (secciones de 3 mm x 3 mm).
8. Recoja los fragmentos de colon cuidadosamente utilizando fórceps finos en 20 ml de tampón de colon refrigerado en un tubo cónico de polipropileno de 50ml.
9. Lavar los fragmentos de colon 3 veces, cada lavado en 20 ml Tampón Tampón, girando vigorosamente el tubo durante 30 s. Entre cada agitación, permitir que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo. Decantar o aspirar al vacío aspirar el sobrenadante mientras se evita la pérdida de fragmentos de tejido en el proceso de aspiración entre cada lavado.
   NOTA: No es necesario cambiar el tubo después de cada lavado.

4. Digestión de la colagenasa 1

1. Añadir 20 ml del búfer de digestión de la colagenasa a los fragmentos de colon lavados en el tubo cónico de polipropileno de 50 ml.
2. Colocar el tubo cerrado de 50 ml a 37 oC en un agitador orbital incubado con la velocidad de rotación fijada a 2 x g durante 60 minutos. Asegúrese de que los fragmentos de tejido estén en constante movimiento durante la agitación; si es necesario, aumente la tasa de rotación incrementalmente para asegurarse de que no hay fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.

5. Preparar gradientes de medios de separación basados en sílice

1. Preparar medios de separación de densidad basados en sílice de 66% y 44%, utilizando medios de separación de densidad 100% basados en sílice a 20 oC (temperatura ambiente) y tampón de colon.
2. Vierta 5 ml de 66% de medios de separación de densidad basados en sílice en cada uno de 3 tubos de polipropileno separados de 15 ml. Prepare 3 tubos por colon. Esto forma la base de mayor densidad del procedimiento de aislamiento de degradado, sobre la que se superpondrán los medios de separación de menor densidad para crear el degradado de separación.
3. Conservar a 20oC hasta su uso.

6. Colección de sobrenadant de la digestión 1

1. Recoger sólo el sobrenadante utilizando una pipeta serológica de 25 ml y filtrar el sobrenadante a través de un colador de células de tejido de filtración de poros de 40 m colocado en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 ml, después de que se complete la digestión de la colagenasa 1. Tenga cuidado de no aspirar ningún fragmento de tejido existente.
   NOTA: Conservar los fragmentos de tejido visible restantes en el tubo. Estos se someterán a una segunda digestión de la colagenasa (paso 8).

7. Tampón de digestión de colagenasa quebrado

1. Llene completamente el tubo de polipropileno de 50 ml con Tampón de colon refrigerado.
   NOTA: La colagenasa está activa a 37 oC; por lo tanto, el tampón refrigerado inactiva esta enzima.
2. Centrifugar el tubo a 4oC a 800 x g durante 5 min.
   1. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío. Lavar las células con 25 ml de tampón de colon fresco y centrífuga a 800 x g durante 5 min.
   2. Resuspenda el pellet en menos de 1 ml de tampón de colon recién refrigerado.
   3. Coloque el tubo cónico de polipropileno de 50 ml sobre hielo.

8. Digestión de la colagenasa 2

1. Repita el paso 4 (Digestion 1) con los fragmentos de tejido restantes retenidos del paso 6.1.

9. Desagregación de tejidos después de la digestión 2

1. Enjuague los fragmentos de tejido vigorosamente hacia adelante y hacia atrás entre el tubo y una jeringa de 10 ml a través de una aguja de extremo romo de 18 G.
2. Repita este lavado para un mínimo de 7-8 pasajes completos, continuando hasta que no haya fragmentos de tejido bruto o escombros visibles.

10. Filtrar células

1. Pasar la suspensión de desagregación de tejido a través de un colador de células de tejido de filtración de poros de 40 m en un tubo de polipropileno limpio de 50 ml.
2. Lave el colador de células de tejido de filtración con 10 ml de búfer de colon refrigerado para recuperar las células atrapadas en el filtro.

11. Quenching Collagenase Digestion

1. Llene el tubo cónico de polipropileno de 50 ml hasta la llanta con Trompa de colon refrigerado.
   NOTA: La temperatura del tampón de colon es fundamental para garantizar el enfriamiento de la actividad de la colagenasa.
2. Girar a 4 oC y 800 x g durante 5 min.
3. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío.
4. Lavar por resuspender en 25 ml de tampón de colon reciénrefrigerado, seguido de centrifugación a 4 oC, 800 x g durante 5 min.
5. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío.
6. Aunar el pellet resuspendido de la digestión de la colagenasa 1 (paso 7) a su tubo correspondiente del paso 11.4.
7. Repita el paso 11.4 (lavado y centrifugación).

12. Separación de Gradientes de Medios de Separación de Densidad basados en Sílice

NOTA: Realice los pasos 12-18 lo más rápido posible, para asegurar un enfriamiento rápido de la actividad de la colagenasa.

1. Siguiendo el paso 11.7, resuspende cada pellet en un total de 24 ml de medios de separación de densidad basados en sílice 44% por colon.
2. Capa lenta de 8 ml del medio del paso 12.1 en cada uno de los tres tubos preparados en el paso 5.2 (que contiene 66% de medios de separación de densidad basados en sílice), utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Mantenga un flujo constante y lento de los medios de separación de densidad del 44% mientras coloca en capas el gradiente para evitar la interrupción de la interfaz.
3. Equilibre cuidadosamente todos los tubos dentro de los cubos de centrífuga utilizando una báscula de pesaje o una balanza.
4. Girar los tubos 20 min a 859 x g en una centrífuga sin freno a 20 oC. Permita que los rotores vengan a descansar antes de retirar los tubos, teniendo cuidado de no interrumpir las células en la interfaz de gradiente.

13. Recoger células mononucleares de la interfaz de gradiente

1. Visualice la interfaz de gradiente (cerca de la marca de 5 ml), donde normalmente está presente una banda blanca de 1-2 mm de espesor (que contiene MNC).
   NOTA: Uno puede o no ver una banda blanca. Sin embargo, MNC estará en esta interfaz y debería nublar la claridad de la interfaz de gradiente.
2. Aspirar y descartar los 7 ml superiores del gradiente superior para facilitar el acceso de las pipetas a la interfaz.
3. Usando la succión manual continua y el movimiento constante de la muñeca giratoria, recoja la capa de interfaz de las células en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 ml. Recoja hasta que la interfaz entre los 2 gradientes sea clara y refractada (clara de celdas).
4. Llene el tubo de recogida con 50 ml de búfer FACS refrigerado. Girar a 4 oC, 800 x g durante 5 min.
5. Aspirar el sobrenadante a través de aspiración al vacío y resuspender el pellet en 1 ml de FACS Buffer.
6. Cuente las células en un hemocitómetro en una dilución 1:2 utilizando métodos de exclusión de células muertas apropiados.
7. Proceda a la tinción FACS u otros ensayos con MNC colónico recién aislado.

Resultados

Cuando se trabaja con modelos de enfermedad de colon murino, es útil ser capaz de cuantificar y evaluar cualitativamente, entre el MNC del colon, múltiples subconjuntos de células inmunitarias implicados en el proceso inflamatorio. La suspensión de una sola célula de MNC obtenida a través de la aplicación de este protocolo facilita dicha caracterización fenotípica de una manera robusta y reproducible. Como prueba de principio para la aplicación de este método de aislamiento baj...

Discusión

Este protocolo visual describe métodos bien tolerados para el aislamiento de células mononucleares colónicas, incluidos linfocitos de lamina propria (LPL). Dado que este protocolo se optimizó en la evaluación de modelos graves de colitis de ratón post-trasplante donde las citoquinas inflamatorias y las lesiones tisulares se prestan a la mala viabilidad de la MNC recuperada, anticipamos que estos métodos pueden traducirse a otros aplicaciones que requieren análisis fenotípicos del MNC colonico. Estos incluyen per...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri DIsh	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4100
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes	TruLine	TR2002
18 G Blunt Needle	Becton Dickinson	305180
25 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4250
40 μm pore size Cell Strainer	Corning	352340
50 mL Falcon Tube	Corning	21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503-1KG
Fixation Buffer	Biolegend	420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum	Sigma	C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution	Amresco	E177-500ML
Fetal Bovine Serum	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI Medium	Corning	17-105-CV
Sodium Azide	VWR Life Science Amresco	97064-646
Trypan Blue	Lonza BioWhittaker	17-942E