跳跃蜘蛛颜色模式的处理及其在行为实验中的应用

摘要

本协议的目的是操纵跳跃蜘蛛和其他带有油漆的非常小的节肢动物的颜色模式, 以研究与性选择、性食人鱼、捕食、先验或任何其他动物着色领域有关的问题。

摘要

在行为生态学领域, 许多实验都是为了研究在性别选择和捕食的背景下, 五颜六色的性状的进化目的而设计的。方法是多种多样的, 但主要包括修改不同着色剂的个体的颜色模式。这种技术已被用于许多脊椎动物分类群, 特别是鸟类, 但由于难以有效地控制小生物的颜色, 无脊椎动物仍然不发达。相反, 为了操纵无脊椎动物的外观, 科学家们通常会修改照明环境, 以过滤掉某些波长。然而, 这种方法不仅影响到所关注的表型特征, 而且影响个体及其周围的整个外观。在这里, 缩小以前在五颜六色的鸟类上使用的技术, 我们提出了操纵小节肢动物的颜色的方法, 使用同样的象征, 但研究不足的物种: 五颜六色的跳跃蜘蛛。

引言

动物通常有复杂的颜色图案 , 他们在会 , 痛苦的遭遇 , 或阻止捕食显示。这些特征可能会传递信息给接收者, 比如信号员^{作为伴侣 1}的个人素质、作为选手2的战斗能力, 或者作为猎物^项目3的适口性。为了理解五颜六色的性状的适应性目的, 研究人员设计了一些实验, 包括以各种方式操纵颜色。一些研究人员使用了彩色诱饵刺激, 如^{模型 4,5,}6^,7, 8, 照片⁹, 或视频^{10, 11, 12}在行为实验中呈现给接收者。其他人, 特别是在使用无脊椎动物时, 操纵照明环境, 影响活人的颜色出现 13,^14,15,16,17. 所有这些操纵虽然巧妙, 但其缺点是消除了潜在的重要自然行为, 或影响的远不止是感兴趣的特点。在鸟类等大型脊椎动物中, 研究人员经常直接在活体动物身上操纵颜色 (在 Hill 和 McGraw 中评论,^{2006年 18})。个别羽毛或嘴已被直接着色标记^{2,19,20,21,22, 23,24},含有过氧化氢的染料^常用于头发^{打火机25、26、27}或各种油漆, 包括指甲油²⁸。在无脊椎动物中, 这种直接在活体动物身上操纵颜色图案的研究比较少见, 但仍然提供了对^{颜色 29、30、31的}功能和演变的巨大洞察 ^{, 32,33,34,35, 36},^37,38,^39.即使是节肢动物的研究似乎也偏向于更大的分类群, 这些分类群可以更容易地处理和绘制, 使非常小的物种的颜色模式相对研究不足。

在这里, 我们描述了一种微妙的颜色操作技术, 这是为非常小的动物分类群开发的。具体而言, 这种方法包括在显微镜下操纵雄性跳跃蜘蛛的面部着色, 以探讨这种丰富多彩的特征在配偶选择和性食人鱼的背景下的重要性。在这种情况下, 我们使用哈布罗纳特斯·吡咯烷黄 (从美国 az 凤凰城收集) 作为模型物种 (图 1)。我们已经在其他地方公布了使用其中一些技术的实验工作的结果, 但在这里, 我们比以前更详细地描述了这些方法, 应该可以让其他人能够使用这些方法试图复制它们或调整它们, 以便在其他非常小的分类群上使用。这样的协议应该为动物提供实验机会, 这些实验机会可以像最具代表性的鸟类一样丰富多彩, 但通常研究不足。

研究方案

1. 设备准备

1. 选择适当的油漆。
   1. 要成功应用, 请使用快干的涂料, 并具有易于用稀释剂操作的纹理。已成功使用的产品包括可用水稀释的非防水眼线, 以及可用搪瓷稀释剂稀释的搪瓷涂料 (材料表)。
   2. 在画蜘蛛时, 要考虑到大多数物种的甲壳体都有硬化的外骨骼, 而柔软的腹部则经常伸展和收缩, 喂养⁴⁰。
      1. 搪瓷涂料在涂漆表面产生固体硬化涂层;因此, 将它们应用于角质层的硬部分 (如甲壳、腿、指状)。这种牙釉质涂层是无效的蜘蛛腹部, 因为他们剥落的蜘蛛作为腹部改变形状与喂养。
      2. 相反, 眼线不会产生硬化涂层, 而是渗入有色的身体鳞片;因此, 在硬体和软体部位 (包括蜘蛛腹部) 上都使用它们。
         注: 在即将到来的步骤中, 最精细的技术是画蜘蛛的脸和足底;采用搪瓷涂料, 这是最通用的方法, 由于颜色的多样性, 可以使用搪瓷涂料。
   3. 在对活体动物进行油漆测试之前, 如果可能, 首先使用 UV-VIS 反射光光度计测量涂料的光谱特性 (简单地应用于纸张或其他表面), 以确保光谱中没有任何不需要的紫外线峰。人类是看不见的, 但被研究的物种可能是可见的。
2. 使用连接到相机和计算机的解剖显微镜, 更轻松地拍摄操作结果的结果, 以获取文档和提高可复制性 (材料表)。
   1. 打开处理相机输入的显微镜、计算机和软件。
   2. 选择将在其上拍摄最终图片的相关缩放。
   3. 将昆虫安装别针或小钉子 (头部向外指向) 插入一个非硬化模型粘土球 (大约是葡萄大小)。(在下面的步骤3.1 中, 要涂漆的活蜘蛛将被临时安装到此引脚的头部)。将模拟粘土和引脚置于显微镜下, 以调整目标, 使其大致聚焦在针脚的头部 (将安装蜘蛛的位置)。
   4. 确保目标在画家眼睛的正确距离, 并且相机在绘画过程中不会阻碍视野 (如果相机安装在其中一个望远镜中, 阻碍深度感知, 就会出现这种情况)。
3. 将蜘蛛转移到一个干净的塑料卡扣小瓶 (约12德拉姆, 没有任何织带或死猎物)。
4. 准备安装和涂装设备。
   1. 将一个额外的薄昆虫安装别针放入一个非硬化建模粘土球 (除了步进1.2.3 中使用的一个), 并将它们放在显微镜的左侧 (对于右手的人)。这个别针将用于轻轻调整蜘蛛的腿和指骨 (根据需要) 在绘画过程中的位置。
   2. 获取一小张吸水纸 (如纸巾)、一张白色打印机纸、要涂的油漆 (这里, 搪瓷涂料)、单独的油漆稀释剂容器 (每个颜色一个, 再加上一个保持透明和干净), 每个颜色的单独微刷(见材料表), 和一个微型刷子只能与清洁稀释剂使用, 所有定位在显微镜的右侧有组织的方式 (对于右手的人)。
   3. 使用牙签, 在打开的塑料盘 (如小培养皿或小瓶帽) 中添加一滴油漆, 并添加油漆稀释剂, 例如用一个小注射器。通过在白色打印机纸上使用微刷对其进行测试, 将两者与牙签混合到正确的一致性 (当油漆完全均匀, 但不会太流式)。
      注: 在某些情况下, 如果油漆干燥迅速, 准备它与稍微多液体超过预期的应用, 并让刷子浸泡在油漆稀释剂锅, 直到以后使用 (步骤 4)。
   4. 将豌豆大小的水基胶 (见材料表) 放在打印机纸张的一角。
      注: 这必须是准备工作的最后阶段, 下一步需要在这之后立即进行, 这样胶水就不会干涸。

2. 对蜘蛛进行麻醉

1. 与蜘蛛在小瓶和一只手在开口, 以防止逃逸, 慢慢添加二氧化碳_气体,直到蜘蛛的第三对腿延伸到180度。
2. 根据物种的平均大小和单个蜘蛛的不同, 使用接触二氧化碳的时间约为20秒至1.5 分钟。我们发现第三对腿的伸长是 h . pyrrithrix麻醉水平适当的可靠指标, 但这可能因物种而异。如果第一次将这些技术与不同的物种结合使用, 首先在几个标本上测试麻醉, 以评估它们的反应。
3. 给蜘蛛尽可能少的二氧化碳_,以达到所需的麻醉水平。虽然这里描述的短时间麻醉没有产生死亡 (也没有明显的行为差异从非麻醉蜘蛛), 给所有动物在实验中相同水平的麻醉 (包括假控制)。
4. 加入 CO2 后保持小瓶闭合, 使蜘蛛在麻醉下保持不动;因此, 在计算蜘蛛接触二氧化碳_的时间时, 请包括这段时间。
5. 一旦蜘蛛从小瓶中取出开始颜色操作, 它将保持完全麻醉约 1至2分钟;因此, 请及时执行以下步骤 (第3-6 节)。由于这个有限的时间窗口, 在尝试画活蜘蛛之前, 先尝试用以下绘画方法与死去的标本 (用于实践)。

3. 将蜘蛛安装在显微镜下

1. 在显微镜视野中制备的模型粘土中, 在安装销或钉的头部添加少量胶水。
   注: 使用最小数量的胶水, 允许保持蜘蛛的位置, 以确保 i) 蜘蛛不会滑落的针头 (如果使用太多胶水), 和 ii) 蜘蛛设法释放自己后醒来。
2. 轻轻地将麻醉后的蜘蛛从小瓶滑落到桌子上, 其腹侧向上。
   注: 由于蜘蛛的腹部是软的, 应注意不要点击或下降到桌子上的蜘蛛, 因为这可能会造成伤害。
3. 轻轻按下蜘蛛胸骨上的针头 (用胶水) (蜘蛛腿附着在身体上的中心区域), 这样蜘蛛就会在施加的小压力下轻微弹跳并伸展腿。为了额外控制所施加的压力, 用双手握住模拟粘土, 双手牢牢地固定在桌子上。
4. 在显微镜下重新定位模拟粘土, 使油漆区域面向上和聚焦。

4. 画蜘蛛

1. 在接触画笔与蜘蛛接触之前, 请评估油漆的一致性。
   1. 重新测试油漆的一致性 (如果刷子保持在稀释剂中, 请使用吸水纸擦拭刷子), 如有必要, 请再次调整, 并始终尝试在打印机纸张上使用油漆, 以控制画笔头发中包含的油漆量。
   2. 用右手和透过显微镜观察时, 将刷子的尖端带到视野中, 并确保 (第二次) 刷子毛不会含有过多的油漆, 在这种情况下, 将其中的一些油漆擦到打印机的纸张上。
2. 测试蜘蛛上的油漆一致性。
   1. 触摸蜘蛛与刷子上的最大区域, 将需要绘制。这将通知画家油漆的一致性和数量是否正确 (即, 当油漆稍微和慢慢地浸入蜘蛛的毛鳞片时)。
      1. 如果未涂上油漆, 请将画笔浸泡到油漆中, 然后返回到步骤4.1 以重复该过程。
      2. 如果油漆迅速浸入并溢出到不应该被油漆覆盖的区域, 并假设溢出的情况是最小的, 而且个人仍然可以参加实验, 则将刷子擦到吸水纸上, 回到4.1 步重复 程序。
         注: 这种类型的液体溢漏不能修复。如果溢出物到达 chulicerae 或眼睛, 或其他可能对个人致命或有毒的部位, 请考虑将蜘蛛立即放在冰柜中, 以便在它醒来之前对其进行安乐死, 并将蜘蛛排除在实验之外。
3. 按照步骤4.1 和4.2 绘制需要颜色的所有区域。
   1. 如果画蜘蛛的脸, 用左手用多余的细针按住前腿和抓头 (这样它们就会被画笔挡在外面)。最好在通过显微镜观察的同时做到这一点, 以避免损坏蜘蛛的附属物。此外, 如果画蜘蛛的脸, 并根据使用的画笔, 考虑画的脸的两侧, 然后试图画眼睛之间的中央部分-两个涂装区域可以通过持有与蜘蛛脸平行的刷子连接和诱导毛细血管的作用。
      注: 当绘制蜘蛛的脸, 它是最简单的首先绘制的一侧最近的优势手, 然后旋转粘土球周围 (与安装的蜘蛛) 周围的显微镜下油漆另一侧, 其次是中间。
   2. 在油漆指骨或腿时, 如果油漆是硬化的, 请确保不要接触任何关节 (如搪瓷油漆), 并确保不要将油漆涂在男性的精子分娩器官上 (在头皮远端部分的底部)。

5. 拍摄蜘蛛的照片

1. 将目标切换到相机模式。
2. 使用计算机软件拍摄照片, 确保选取的缩放是显微镜上选定的缩放, 以便添加刻度条。

6. 从针脚或钉子释放蜘蛛

1. 当蜘蛛开始移动时, 按住别针, 使蜘蛛的前腿接触到蜘蛛的小瓶。
2. 让蜘蛛自己释放, 如果需要, 轻轻倾斜的别针, 以帮助蜘蛛把自己从干胶水。
   1. 如果蜘蛛在绘画完成前醒来, 让蜘蛛至少 1 5分钟恢复, 然后再被麻醉。如果这样做, 确保所有群体获得相同水平的麻醉 (包括洗发水治疗的个人, 如果适用)。
      注: 蜘蛛在操作后似乎会迅速恢复正常行为 (< 15分钟), 但我们建议在行为测试中使用蜘蛛之前的12小时内进行标准化的停留时间。

7. 蜘蛛行为分析

1. 比较未经操纵、洗发水处理和操纵的受试者的行为, 以评估应用的潜在毒性 (可能因特定油漆类型、颜色、应用领域和研究物种而异)。要比较的相关行为可能包括活动率、所从事的活动类型、成功开展具体活动 (例如捕捉猎物) 等。
   1. 使用经过述述的蜘蛛作为实验设计的一部分 (例如, 在不可见的区域接受油漆应用或将中度油漆应用于同一区域), 以便只改变个人的颜色, 同时控制其他因素 (如处理时间、气味、表面纹理等)。
      注: 如果画腿或指掌, 考虑这可能会干扰感觉毛 (流行在蜘蛛腿和指掌, 见 Foelix^sham-treated), 在这些情况下, 任何处理过的男性应具有中性颜色的油漆应用于与控件相同的区域。
   2. 在开发新方法时 , 将彩绘蜘蛛与未经操纵的蜘蛛进行比较 , 以评估色彩纵的个体是否仍然正常行为。

8. 测量涂装主体的颜色操作的反射率特性

1. 一旦安乐死 (在蜘蛛参与实验或为此目的专门安乐死之后, 见下文注), 使用标准的便携式 UV-VIS 分光光度计 (材料表) 测量颜色操作的光谱特性), 特别是对于直径大于1毫米的区域。
2. 对于较小的区域, 使用定制的微分光光度计 (通过显微镜路由的 UV-VIS 分光光度计), 以便更容易、更精确地进行测量, 尽管显微镜的光学切割出了紫外光, 这意味着测量仅限于人可见波长 (见 Taylor 等人, 2011年⁴¹)。
3. 在颜色操作面积极小、需要紫外线反射率数据的情况下, 使用市售的 UV-VIS 微光分光光度计, 尽管它们的价格较高 (见 Taylor 等人, 2014年⁴²⁾。
   注: UV-VIS 分光光度计的光源含有紫外光, 可能对动物的眼睛 (包括我们的眼睛) 有危险, 因此只有在动物被安乐死而不仅仅是麻醉之后, 才应采取光谱措施。对于涂漆的蜘蛛来说, 这可以在蜘蛛被用于实验后完成, 因为油漆不会磨损 (见下面的代表性结果)。对于有时可能在数日或数周后褪色的水性涂料, 在同行参与实验时, 可以牺牲一组蜘蛛进行测量 (以捕捉反映实际色彩操作的数据)。实验)。报告涂料的光谱特性将允许其他研究人员复制, 他们可能希望复制颜色操作, 但无法访问相同的特定涂料产品。

结果

色彩操纵的有效性

使用这些技术, 不同程度的颜色操作是有效的, 包括完全隐藏颜色或减少或提高其强度。这一点从照片和光谱反射率的测量中都可以明显看出 (图 2,图 3和图 4)。在这里, 我们展示了颜色操纵的男性哈布罗纳图斯吡咯烷酮相比, 自然红脸男性。使用 UV-VIS 分光光度计 (见材料表) 测量光谱特性, 该分光光度计可以精确测量直径小于1mm 的有色区域。测量相对于漫反射白色标准 (见材料表)。

在罕见的情况下 (108名男性中有5次在脸上涂上黑色眼线笔 (见材料表)), 水溶性眼线笔在一两个星期后开始磨损蜘蛛的脸。另一个品牌的眼线笔 (眼线笔 2; 见材料表) 没有观察到这一点。在这两种情况下, 蜘蛛的笼子每周喷水三到五次。不同的维护条件可能会影响水性涂料的磨损。对于所有纵的雄性 ( nncy221 ) , 即使是那些 6 个月后还活着的人 , 搪瓷油漆仍然是完整的。

颜色操作的潜在毒性

要避免在蜘蛛的眼睛上涂上油漆, 以免阻碍它们的视力, 也不要在蜘蛛的眼睛上涂上、口腔部位和其他孔, 可能还有其他软性身体部位, 以防止可能的摄入和中毒。你也应该小心画关节或部分包含感觉毛 (如腿和足部), 以免限制他们的行动能力或感官系统。然而, 如果这种颜色操作对这些身体区域是必要的, 或者如果有任何疑问的微妙的负面影响的可能性, 那么最好是适用于个人在所有治疗类别。这样, 人们就可以避免无意中操纵个体的感官系统, 其方式可能只对其中一种治疗方法有偏见。例如, 在图 4所示的一项使用男性操纵的实验中, 目的是增加和减少男性在求爱过程中显示的红色斑块数量。由于有些雄性会用灰色的搪瓷油漆隐藏自然的红脸 (以减少显示的红色量), 所以我们想保持红脸的其他雄性则被涂成红色, 与灰脸的产品相同男性。同样, 由于我们想在某些雄性身上的包层添加红色补丁, 以增加所显示的红色补丁的数量, 所以用灰色油漆覆盖其他雄性的花底, 这样所有的雄性都会被涂在这个敏感区域上 (见图 4).虽然可取, 但这一战略可能并不总是可行的。例如, 在另一个实验中, 红色的颜色被删除使用黑色眼线笔给出相同的光谱属性的男性的底层角质层, 而保持其他男性的颜色完整和自然 (图 2)。在这种情况下, 对于长相自然的男性, 同样数量的眼线笔被应用到其前中位眼后面的甲壳顶部区域 (女性看不到的区域), 以控制其潜在的气味或整体毒性。产品。但是, 应用油漆的位置可能会对蜘蛛产生不同的影响。因此, 为了评估涂油漆的方式或位置上的细微差异可能对蜘蛛的完整性有影响, 这两种类型的雄性在与我们的假设相关的背景下的行为 (相对于配偶的选择和性食人鱼)进行了比较。男性被放在女性面前, 他们被放在两个二的情况下, 我们比较了她们的延迟变得活跃, 他们的延迟去求爱, 以及他们用一般线性混合效应模型求爱的总时间 (使用函数 lmer 和 R 包 lme4⁴³在 R 版本中 3.5.2⁴⁴以女性身份为随机效应, 并使用最大似然标准获取 p 值)。在这种情况下, 所有比较都显示治疗之间没有区别 (见表 1), 因此得出的结论是, 我们没有引入有利于一种或另一种治疗类别的偏见。

在这两种情况下, 当治疗类别非常相似 (图 4), 或只对受过虚假处理的个体 (图 2和图 3) 时, 研究人员应评估其模型物种如何受到其使用的油漆的影响, 并确保他们仍然以类似的和与生态相关的方式行事。人们可以记录数据, 尽可能评估毒性可能产生的影响, 例如通过比较经处理和不操纵的个人之间的活动率。我们的蜘蛛涂上了搪瓷漆, 如图 4所示, 在一个相同的背景下, 被比作未经操纵的雄性。具体而言, 男性被单独引入女性笼子, 并比较了它们离开小瓶的延迟、求爱和求爱率的延迟 (在交配之前, 以及在遭到攻击或被拆散之前)。没有发现差异 (在使用类似的线性混合效应模型, 如上所示), 因此, 我们的结论是, 我们的彩绘男性表现自然 (表 2)。

最后, 需要注意的是, 实验中的任何蜘蛛 (通常是雌性蜘蛛), 被蚕食的色彩操纵的雄性似乎从未受到负面影响。蜘蛛从外部消化猎物, 通常会留下角质层的彩绘区域。然而, 如果将这种方法适用于其他将消耗颜色操纵的动物的系统, 则应评估潜在的毒性风险。

图 1.成年雄性哈布罗纳特斯,说明他们的彩色身体区域是多么微小.由 Lyle Buss 拍摄。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2.实验色彩操作用于隐藏红面部着色的金银花.(A) 彩色操作前的完整红色面部着色。(B) 同一男性在用黑色眼线笔隐藏自然红色后的面部着色。(C) 代表反射光谱为自然红脸, 自然底层黑色角质层, 和红色面涂上黑色眼线笔2。2013年修改自泰勒和麦格劳39。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3.实验色彩操作用于减少雄性金银花红色面部斑块的大小和发红.(A) 彩色操作前的完整红色面部着色。(B) 同一男性在面部前部涂上稀释的黑色眼线 (城市衰变) 后的面部着色, 并沿面部贴片边缘涂上非稀释的黑色眼线, 以减小红区的大小。(C) 与人口平均数 (ntac 57) 和先前研究41中的10名龙数男性相比, 假处理对照雄性 (n = 21) 和颜色操纵的男性 (n = 21) 的平均光谱曲线^.图转载于泰勒等人, 2014年³⁸。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4.用于修改男性红色面部贴片颜色的实验色彩操作哈布罗纳特斯·皮里特里克斯.被涂成(a) 红色、(b) 红色和灰色的金银花雄性, 以及 (c) 灰色的搪瓷漆在它们天然的红色脸和自然奶油色的身上。(D) 未操作男性 (n = 9) 和脸上覆盖着红色搪瓷油漆的男性的平均光谱曲线 (n = 9)。通过在蜘蛛的脸上涂上更明亮的红色, 我们有效地增强了它的红色面部颜色。因为搪瓷漆完全覆盖了底层的鳞片, 颜色也可以完全改变, 就像灰色搪瓷的情况一样。(E) 在本实验中, 选择了红色和灰色的搪瓷涂料, 使其与总亮度相匹配 (在这些蜘蛛可见的波长范围内的总反射率)。D 和 E 中 y 轴的比例不同, 原因是测量纸张颜色样本 (e) 的不同技术 (如与样品的距离和测量区域的大小), 而不是直接测量蜘蛛表面的颜色 (d)。请点击这里查看此图的较大版本. 

N	相关变量	P	t	红脸	± SE	黑脸	± SE	nFID
202b	男性延迟离开菜	0.35	-0.93	140。0	23。9	109。8	23。9	102
179c	男性推迟出庭	0.74	0.33	983。4	127。1	1031。0	126。5	95
204a	男性求爱努力	0.52	0.63	181。2	24。4	203。0	24。4	102
204a	男性求爱的努力之前, 任何攻击	0.41	0.68	89。0	15。7	97。5	15。7	102

表 1.男性面部颜色操作对行为的影响, 当油漆与黑色眼线与假处理 (图 2)。给出了每个模型的结构, 以及每个治疗组的平均估计 (以秒为单位)。N = 男性的数量, p 和 t = p 值和 t 值为男性治疗, nFID = 水平的数量在随机作用女性身分。^a在所进行的104次男性测试中, 有102项被成功记录, 结果观察到204名独特的男性。^在离开培养皿之前, 有2名男性被雌性咬灭。^c25名男性在向女性求爱之前被女性拆散。

N	相关变量	P	t	未经操纵	± SE	画	± SE
32a	男性延迟离开菜	0.87	-0.17	380。8	143。1	345。4	152。4
31b	男性推迟出庭	0.93	-0.09	502。6	105。8	488。1	1116
31b	男性求爱努力	0.74	-0.33	2324。3	455。0	2102。1	484。4
31b	男性求爱的努力之前, 任何攻击	0.68	0.42	1495。1	450。8	1770。1	479。9

表 2.男性面部颜色操作对行为的影响, 当油漆为红色或灰色的搪瓷漆 (n = 15,图 4)与未经操纵的男性 (n = 17)。给出了每个模型的结构, 以及每个治疗组的平均估计 (以秒为单位)。N = 男性的数量, p 和 t = p 值和 t 值为男性治疗。在我们的实验中 , 17 个没有纵的雄性与所有彩绘雄性的一个子集进行了比较 ( n = 221 ) 。具体而言, 将其与15名彩绘男性 (5 例红色 (图 2a)、5例红色和灰色 (图 2b) 和5种灰色 (图 2A)) 进行了比较, 在同一背景下 (在有女性在场的情况下) 和在同一特定时期进行了测试。这一点很重要, 因为在实验快结束时 (2018年8月和 9月), 对未经操纵的雄性进行了测试, 这与它们自然繁殖季节的结束相对应, 雄性一般不太活跃。保持所有其他变量相等, 使我们能够在不引入其他偏差的情况下比较绘画处理。^b在向女性求爱之前, 有一名男性 (均为灰色) 被拆散。

讨论

在这里, 我们表明, 节肢动物的微小身体部位的颜色可以有效地操纵使用着色剂, 如化妆和搪瓷油漆。

实现这种微妙操纵的第一个关键步骤是能够固定小动物, 而这些小动物通常不能被限制在手上。在这里, 为了能够绘制敏感的区域, 如跳跃蜘蛛的脸, 我们麻醉个人与二氧化碳, 并把他们安装在一个针的头。这使得接近蜘蛛眼睛的工作比蜘蛛在醒着的情况下可能经历的压力更小 (在绘画过程中, 显微镜下的光线照到他们的脸上)。

该方法还需要获得高质量的微刷子, 最关键的是, 适当的着色物质。在不溢漏的情况下应用油漆最困难的一步, 但覆盖面良好, 就是要获得正确的一致性。因此, 着色物质需要用稀释剂很容易稀释, 容易干燥以增厚。可使用不同类型的涂料;在这里, 结果提出了水溶性 (非防水) 眼线和搪瓷涂料。非防水眼线器的优点是在与水混合时易于液化。但是, 这与色素沉着的稀释 (这可能是不可取的, 也可能是可取的 (例如图 3))。搪瓷涂料具有一致性, 可以很容易地通过添加搪瓷稀释剂来控制, 同时仍然提供全面的覆盖。然而 , 这一特点与保持头发或身体部分的比例结构的可能换。此外, 搪瓷涂料经久耐用。这样做的缺点是, 搪瓷油漆和稀释剂在应用过程中和干燥前都会发出强烈的气味。着色物质的另一个困难可能是找到合适的阴影, 具有正确的光谱特性。例如, 它是很难得到红色眼线笔与黑色眼线笔平行使用, 因为眼线笔往往是粉红色的, 而不是红色。它也很难得到不含任何闪光的化妆粉 (或颜料) (有时只能在显微镜下看到)。许多化妆产品也反射紫外线, 虽然不可见的实验者, 可能是明显的动物被研究。

与其他方法相比, 通过在其身体部位直接使用着色剂来操纵节肢动物的着色带来了好处和不便。它的主要局限性是, 不能绝对否定一些微妙的毒性影响的可能性。然而, 可以通过将涂料应用于所有处理类别来确保不对一个治疗组引入偏差, 或者可以测试涂料应用是否干扰了感兴趣的行为。通过这里介绍的方法, 我们收集了足够的证据, 表明涂料的应用导致了微不足道的负面影响 (表 1和表 2)。这种方法的主要优点是, 微小的颜色补丁可以有针对性, 它们的颜色可以 "去除" (见图 2), 使更沉闷 (图 3) 或更亮 (图 4), 与身体的其他颜色和个人的环境。这与最常见的替代方法形成鲜明对比, 这种方法包括操纵照明条件, 从而改变整个个人及其周围地区的视觉外观。事实上, 即使不是专门操作照明条件, 如果照明环境不合适, 也可以成功地操作颜色, 并看到这种操作的有限或没有影响^.因此, 重要的是要测量和考虑将进行任何实验的光线环境 (即测量辐射), 并确保将其与自然照明条件密切匹配 (例如, 使用模拟的全光谱灯泡)在圈养时的自然光)。总体而言, 通过使用微刷子和显微镜, 该协议允许更精确地操作微小的颜色斑块比大多数其他直接着色方法, 以前已经在无脊椎动物身上使用。此前的大多数研究都使用了与跳跃蜘蛛的面部相比颜色斑块相对较大的动物 (例如, 操纵蝴蝶翅膀颜色^{29、34、35, 成虫}的身体)半鱼 ("真正的虫子")^{30, 36}和蝗虫³¹, 或相对较大的狼蜘蛛 32, 33^,37) 的腿。这里介绍的方法为研究分类群上的颜色斑块的惊人多样性提供了机会, 分类群由于体积小而研究不足。

类似的技术也可应用于其他可固定或麻醉的节肢动物, 也可以应用于油漆不会影响个人行动能力或健康的地区 (即不包括所需的关节、关节等结构或芳香症等区域)用于适当的运动、口腔部分或其他孔 (如呼吸结构)。这些技术还可以扩展到包括广泛提供的更大的染料、油漆和化妆品调色板。

最后, 这些微妙的技术不仅可以用来操纵小生物的颜色, 还可以用来操纵相对较大的生物的图案 (如条纹)。这应该对各种各样的研究人员都有好处, 他们可以让我们的方法适应他们自己对性选择、交流、对位猎物信号以及动物使用颜色的其他背景的研究。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CO2 tank	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	to anesthesize spiders
Enamel paint thinner	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	to thin enamel paint
Flat enamel paint	Testors (Vernon Hills, IL)	red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808	can be thinned with enamel paint thinner
Light microscope	Zeiss (Jena, Germany)	stemi 508	to paint small areas with precision
Light microscope camera	Zeiss (Jena, Germany)	Axiocam 105 color	to take picture before and after manipulation for documentation
Light microscope camera software	Zeiss (Jena, Germany)	Zen 2 blue edition	to process pictures taken before and after manipulation
Liquid liner eyeliner, shade “Perversion”	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(discontinued)	non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2
MegaLiner liquid eyeliner, black	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871A	non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1
Micro brushes	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	to allow precise painting of small areas
Non-hardening modelling clay	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles
Small nail or insect mounting pins	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint
Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912	to mix paint and thinner to the right consistency
Small syringe	Fisher Scientific	1482910F	to transfer small amount of enamel thinner
Spectralon white standard	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	to measure spectral properties of colors
UV-VIS spectrophotometer	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source)	to measure spectral properties of colors
Water soluble school glue	Elmer's (High Point, NC)	#E304	to mount the spiders onto a nail/pin
Wood toothpicks	Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN)	#253-05-0125	to transfer drops of enamel paint