Manipolazione dei modelli di colore nei ragni saltatori per l'uso negli esperimenti comportamentali

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di manipolare i modelli di colore dei ragni saltellanti e di altri artropodi molto piccoli con la vernice al fine di studiare le domande relative alla selezione sessuale, al cannibalismo sessuale, alla predazione, all'aposematismo o a qualsiasi altro campo di colorazione animale.

Abstract

Nel campo dell'ecologia comportamentale, molti esperimenti sono progettati per indagare gli scopi evoluzionari dei tratti colorati nel contesto della selezione sessuale e della predazione. I metodi sono vari, ma consistono principalmente nel modificare i modelli di colore di individui con diversi coloranti. Tali tecniche sono state utilizzate in molti taxa vertebrati, in particolare negli uccelli, ma sono rimasti sottosviluppati per gli invertebrati a causa della difficoltà di manipolare efficacemente il colore nei piccoli organismi. Invece, per manipolare l'aspetto degli invertebrati, gli scienziati hanno di solito modificato l'ambiente di illuminazione per filtrare alcune lunghezze d'onda. Tuttavia, tale metodo colpisce non solo il tratto fenotipico di interesse, ma l'intero aspetto dell'individuo e la sua circostante. Qui, ridimensionando le tecniche precedentemente utilizzate sugli uccelli colorati, presentiamo modi di manipolare i colori dei piccoli artropodi, utilizzando specie altrettanto emblematiche ma sottostudiate: i ragni colorati che saltano.

Introduzione

Gli animali spesso hanno elaborati schemi di colore che mostrano durante gli incontri sessuali, gli incontri agonistici o per scoraggiare la predazione. Questi tratti possono trasmettere informazioni a ricevitori come la qualità individuale del firmatista come un compagno¹, la capacità di combattimento come un concorrente², o palatabilità come un elemento preda³. Per comprendere gli scopi adattativi dei tratti colorati, i ricercatori hanno progettato esperimenti che coinvolgono la manipolazione dei colori in vari modi. Alcuni ricercatori hanno usato stimoli di esca colorati come i modelli^4,5,6,7,8, fotografie⁹o video^{10,11, 12} che vengono presentati ai ricevitori in esperimenti comportamentali. Altri, soprattutto quando si usano invertebrati, hanno manipolato l'ambiente di illuminazione per influenzare la comparsa di colori di individui vivi^{13,14,15,16, 17}. tutte queste manipolazioni, mentre ingegnose, hanno lo svantaggio di rimuovere il comportamento naturale potenzialmente importante e/o influenzare molto più del tratto di interesse. Nei grandi vertebrati, come gli uccelli, i ricercatori manipolano molto spesso il colore direttamente sugli animali vivi (recensiti in Hill e McGraw, 2006¹⁸). Le singole piume o i becchi sono stati colorati direttamente con i marcatori^{2,19,20,21,22,23,24}, coloranti contenenti perossido di idrogeno spesso utilizzati in lighteners per capelli^25,26,27, o varie vernici tra cui smalto²⁸. Negli invertebrati, tali studi che manipolano i modelli di colore direttamente sugli animali vivi sono relativamente rari, ma hanno ancora fornito una visione immensa della funzione e dell'evoluzione del colore^{29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39}. Anche gli studi sugli artropodi sembrano essere polarizzato verso taxa più grandi che possono essere più facilmente manipolati e verniciati, lasciando modelli di colore in specie molto piccole relativamente sottostudiate.

Qui, descriviamo una delicata tecnica di manipolazione del colore che è stata sviluppata per i taxa di animali molto piccoli. In particolare, questo metodo implica manipolare la colorazione facciale dei ragni maschi che saltano al microscopio al fine di indagare sull'importanza di tali tratti colorati nel contesto della scelta del compagno e del cannibalismo sessuale. In questo caso, abbiamo usato Habronattus pyrrithrix (raccolto da Phoenix, AZ, USA) come specie modello (Figura 1). Abbiamo pubblicato i risultati del lavoro sperimentale utilizzando alcune di queste tecniche altrove^38,39, ma qui descriviamo i metodi in modo più dettagliato di quanto non sia stato fatto in precedenza, in una maniera che dovrebbe renderli accessibili agli altri tentare di replicarli o adattarli per l'uso su altri taxa molto piccoli. Tali protocolli dovrebbero aprire opportunità sperimentali su animali che possono essere colorati come gli uccelli più emblematici, ma che di solito sono poco studiati.

Protocollo

1. preparazione dell'apparecchiatura

1. Selezionare le vernici appropriate.
   1. Per un'applicazione di successo, utilizzare vernici che sono ad asciugatura rapida e hanno una texture che è facilmente manipolata con diluente. I prodotti che sono stati utilizzati con successo includono occhielli non impermeabili che possono essere assottigliati con acqua, e vernici smaltate che possono essere diluiti con diluente smalto (tabella dei materiali).
   2. Quando dipingi i ragni, considera che il carapace della maggior parte delle specie ha un esoscheletro indurito mentre l'addome molle spesso si allunga e si confonde con l'alimentazione⁴⁰.
      1. Vernici smaltate producono un solido, rivestimento indurito sulla superficie verniciata; quindi applicarle su parti dure della cuticola (ad es. carapace, gambe, pedipalps). Tali rivestimenti smaltati sono meno efficaci per gli domati di ragno perché si staccano dal ragno mentre l'addome cambia forma con l'alimentazione.
      2. Al contrario, gli occhielli non producono un rivestimento indurito, ma piuttosto penetrare nelle scaglie del corpo colorato; come tali, usarli su parti del corpo duro e morbido (tra cui Spider domens).
         Nota: nei prossimi passi, viene presentata la tecnica più delicata che consiste nel dipingere il viso e i pedipalpi dei ragni; viene utilizzata la vernice smaltata, che è il metodo più generalizzabile a causa della diversità di colore della vernice smalto disponibile.
   3. Prima di testare vernici su animali vivi, se possibile, prima misurare le proprietà spettrali della vernice (semplicemente applicato su carta o un'altra superficie) utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS di riflettanza per garantire che non vi siano picchi UV indesiderati nello spettro che essere invisibili agli esseri umani, ma possibilmente visibili alle specie studiate.
2. Utilizzare un microscopio dissezione collegato a una fotocamera e un computer per più facilmente scattare foto del risultato della manipolazione per la documentazione e aumentando la replicabilità (tabella dei materiali).
   1. Accendere il microscopio, il computer e il software che elabora l'ingresso della fotocamera.
   2. Selezionare lo zoom pertinente al quale verrà scattata l'immagine finale.
   3. Attaccare un perno di montaggio insetto o un piccolo chiodo (con la testa puntata verso l'esterno) in una palla di argilla modellante non indurente (approssimativamente la dimensione di un vitigno). (Il ragno vivo da dipingere sarà temporaneamente montato alla testa di questo perno nel passo 3,1 sotto). Posizionare l'argilla modellante e perno sotto il microscopio per regolare gli obiettivi in modo che si concentrano approssimativamente sulla testa del perno (dove il ragno deve essere montato).
   4. Assicurarsi che gli obiettivi siano alla giusta distanza per gli occhi del pittore, e che la fotocamera non ostacoli il campo visivo durante la verniciatura (come nel caso se la fotocamera è montata in uno degli ocoli, ostacolando la percezione della profondità).
3. Trasferire il ragno in una fiala di plastica pulita tappo a scatto (circa 12 DRAMs, senza alcuna fettuccia o preda morta).
4. Preparare attrezzature di montaggio e verniciatura.
   1. Posizionare un perno di montaggio di insetto extra sottile in una palla di argilla modellante non indurente (oltre a quella utilizzata nel passaggio 1.2.3) e posizionarle sul lato sinistro del microscopio (per le persone destri). Questo perno sarà utilizzato per regolare delicatamente le posizioni delle gambe del ragno e pedipalpi (se necessario) durante la verniciatura.
   2. Ottenere un piccolo pezzo di carta assorbente (come un tovagliolo di carta), un pezzo di carta bianca stampante, le vernici da applicare (qui, vernice smalto), contenitori separati di diluente di vernice (uno per ogni colore più uno mantenuto trasparente e pulito), singoli micro spazzole per ogni colore (Vedi tabella dei materiali), e un micro pennello da utilizzare solo con diluente pulito, tutti posizionati in modo organizzato alla destra del microscopio (per le persone destri).
   3. Utilizzando uno stuzzicadenti, aggiungere una goccia di vernice in un piatto di plastica aperto (come una piccola capsula di Petri o un tappo del flaconcino) e aggiungere diluente per vernici, ad esempio con una piccola siringa. Mescolare i due con lo stuzzicadenti alla giusta consistenza (quando la vernice è completamente omogeneizzata, ma non troppo runny) testandolo sulla carta della stampante bianca con un micro pennello.
      Nota: in alcuni casi, se la vernice si asciuga rapidamente, prepararla con un po' più liquida di quanto desiderato per l'applicazione, e lasciare che le spazzole si immerga nel vaso di diluente di vernice fino a un uso successivo (passo 4).
   4. Mettere una goccia di pisello di colla a base acquosa (vedere tabella dei materiali) su un angolo della carta della stampante.
      Nota: questa deve essere l'ultima fase della preparazione e il passo successivo deve accadere immediatamente dopo questo, in modo che la colla non si asciughi.

2. anestetizzare il ragno

1. Con il ragno nel flaconcino e una mano a coppa sopra l'apertura per evitare la fuga, aggiungere lentamente CO₂ gas fino a quando il terzo paio di gambe del ragno si estende a 180 gradi.
2. Utilizzare un tempo di esposizione a CO₂ di circa 20 secondi a 1,5 minuti, a seconda della dimensione media della specie e sul singolo ragno. Abbiamo trovato l'estensione del terzo paio di gambe per essere un indicatore affidabile del corretto livello di anestesia in H. pyrrithrix, ma questo probabilmente varia tra le specie. Se si utilizzano queste tecniche con una specie diversa per la prima volta, testare prima l'anestesia su alcuni esemplari per valutarne la risposta.
3. Dare ragni come poco CO₂ possibile per raggiungere il livello necessario di anestesia. Mentre i brevi periodi di anestesia descritti qui non producevano mortalità (e nessuna differenza comportamentale evidente da ragni non anestetizzati), dare a tutti gli animali in un esperimento uguali livelli di anestesia (compresi i controlli fittizi).
4. Tenere il flaconcino chiuso dopo l'aggiunta di CO₂ per mantenere il ragno in anestesia; Pertanto, includere questo tempo nel calcolo di quanto tempo il ragno è esposto a CO₂.
5. Una volta che il ragno è stato rimosso dal flaconcino per iniziare la manipolazione del colore, sarà completamente anestetizzato per circa 1 a 2 minuti; Pertanto, effettuare le seguenti operazioni (sezioni 3-6) prontamente. A causa di questa finestra temporale limitata, tentare il seguente metodo di verniciatura con campioni morti prima (per la pratica) prima di tentare di dipingere ragni vivi.

3. montaggio del ragno sotto il microscopio

1. Aggiungere una piccola quantità di colla sulla testa del perno di montaggio o chiodo nell'argilla modellante preparata nel campo visivo del microscopio.
   Nota: utilizzare la più piccola quantità di colla che permette di mantenere il ragno in posizione per garantire che i) il ragno non scivolare fuori la testa del capocchia (se viene utilizzata troppa colla), e II) il ragno riesce a liberare se stesso dopo il risveglio.
2. Far scivolare delicatamente il ragno anestetizzato dalla sua fiala sul tavolo con il suo lato ventrale verso l'alto.
   Nota: poiché le domare dei ragni sono morbide, si deve prestare attenzione a non toccare o far cadere i ragni sul tavolo, in quanto ciò potrebbe causare lesioni.
3. Premere delicatamente il capocchia (con colla) sullo sterno del ragno (l'area centrale in cui le gambe del ragno si attaccano al corpo) in modo tale che il ragno rimbalzi leggermente ed estenderà le gambe sotto la piccola pressione applicata. Per un controllo supplementare della pressione applicata, tenere l'argilla modellante con entrambe le mani, avendo entrambe le mani stabilizzò saldamente contro il tavolo.
4. Riposizionare l'argilla modellante sotto il microscopio in modo che l'area da dipingere sia rivolta verso l'alto e a fuoco.

4. dipingere il ragno

1. Valutare la consistenza della vernice prima di toccare il pennello al ragno.
   1. Ritest la consistenza della vernice (utilizzare la carta assorbente per pulire le spazzole se sono state mantenute nel diluente), regolare nuovamente se necessario, e sempre prima provare applicando vernice sulla carta della stampante per controllare la quantità di vernice contenuta nei peli del pennello.
   2. Con la mano destra e guardando attraverso il microscopio, portare la punta del pennello nel campo visivo, e assicurarsi (una seconda volta) che i peli del pennello non contengono troppa vernice, nel qual caso pulirlo un po' di esso sulla carta della stampante.
2. Testare la consistenza della vernice sul ragno.
   1. Toccare il ragno con il pennello sulla zona più grande che dovrà essere dipinto sopra. Questo informerà il pittore se la consistenza e la quantità di vernice è giusto (cioè, quando la vernice si insinua leggermente e lentamente nei capelli/scaglie del ragno).
      1. Se non viene applicata alcuna vernice, immergere il pennello nella vernice e tornare al passo 4,1 per ripetere la procedura.
      2. Se la vernice assorbe rapidamente e fuoriuscito su un'area che non deve essere coperta da vernice, e supponendo che la fuoriuscita è minima e che l'individuo potrebbe ancora prendere parte all'esperimento, pulire il pennello sulla carta assorbente e tornare al passo 4,1 per ripetere la procedura.
         Nota: questo tipo di fuoriuscita di liquido non può essere fissato. Se la fuoriuscita raggiunge le cheliceri o gli occhi, o altre parti che potrebbero essere letali o tossiche per l'individuo, considerare di collocare il ragno immediatamente nel congelatore per eutanizzare prima che si svegli e escludendo il ragno dall'esperimento.
3. Dipingi tutte le aree che necessitano di colori seguendo i passaggi 4,1 e 4,2.
   1. Se dipingi la faccia del ragno, usa il perno extra sottile con la mano sinistra per tenere le zampe anteriori e pedipalpi (in modo che siano fuori dal modo del pennello). Questo è meglio fare mentre guardando attraverso il microscopio per evitare di danneggiare le appendici del ragno. Inoltre, se dipingi la faccia del ragno, e a seconda delle spazzole utilizzate per dipingere, considerare la verniciatura di entrambi i lati del viso prima di tentare di dipingere la parte centrale tra gli occhi-entrambe le aree verniciate possono essere unite tenendo il pennello parallelo alla faccia del ragno e inducendo l'azione capillare.
      Nota: quando si dipinge la faccia del ragno, è più facile dipingere prima il lato più vicino alla mano dominante, e poi ruotare la palla di argilla (con il ragno montato) intorno sotto il microscopio per dipingere l'altro lato, seguita dal centro.
   2. Quando si dipingono pedipalpi o gambe, assicurarsi di non toccare eventuali giunti se la vernice è un indurimento (come la vernice smalto), e fare in modo di non applicare la vernice agli organi di erogazione dello sperma del maschio (sul lato inferiore del segmento distale del pedipalpi).

5. scattare la foto del ragno

1. Commutare l'obiettivo nella modalità fotocamera.
2. Scattare una foto utilizzando il software del computer, assicurandosi che lo zoom scelto è quello selezionato al microscopio, in modo che una barra di scala può essere aggiunto.

6. rilasciando il ragno dal perno o dall'unghia

1. Quando il ragno inizia a muoversi, tieni il perno in modo che le zampe anteriori del ragno tocchino la fiala del ragno.
2. Lasciate che il ragno rilasciare se stesso, e se necessario, inclinare delicatamente il perno per aiutare il ragno tirare lontano dalla colla secca.
   1. Se il ragno si sveglia prima che il dipinto è completato, lasciare che il ragno almeno 15 minuti per recuperare prima di essere anestetizzato di nuovo. Se questo è fatto, assicurarsi che tutti i gruppi ottengono gli stessi livelli di anestesia (compresi gli individui trattati con Sham, se applicabile).
      Nota: i ragni sembrano riprendere il loro comportamento normale rapidamente dopo la manipolazione (< 15min), ma si consiglia di standardizzare il tempo di riposo di 12 ore prima di utilizzare il ragno in un test comportamentale.

7. analisi del comportamento dei ragni

1. Confrontare il comportamento di soggetti non manipolati, trattati con Sham e manipolati per valutare la potenziale tossicità dell'applicazione (che può variare in base a tipo di vernice specifico, colore, area di applicazione e specie di studio). Il comportamento pertinente da confrontare potrebbe includere il tasso di attività, il tipo di attività svolta, il successo nell'esecuzione di attività specifiche (ad esempio, catturare le prede), ecc.
   1. Utilizzare ragni trattati con Sham come parte del progetto sperimentale (ad esempio ricevendo l'applicazione di vernice su un'area non visibile o con vernici di colore neutro applicate alle stesse aree) al fine di modificare solo il colore dell'individuo durante il controllo per altri fattori (ad es. tempo di manipolazione, odore, consistenza superficiale, ecc.).
      Nota: se si dipingano gambe o pedipalps, considerare la possibilità che questo possa interferire con i peli sensoriali (prevalenti su zampe di ragno e pedipalps, vedere Foelix 2010⁴⁰) e, in questi casi, i maschi trattati con Sham devono avere vernici di colore neutro applicate al stesse aree di un controllo.
   2. Quando si sviluppano nuovi metodi, confrontare i ragni dipinti con ragni non manipolati per valutare se gli individui manipolati dal colore si comportano ancora normalmente.

8. misurazione delle proprietà di riflettanza della manipolazione del colore sul soggetto dipinto

1. Una volta eutanizzato (dopo che i ragni sono stati coinvolti in un esperimento o specificatamente eutanizzati per questo scopo, vedere nota sotto), misurare le proprietà spettrali della manipolazione del colore utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS portatile standard (tabella dei materiali ), specialmente per superfici di diametro superiore a 1 mm.
2. Per le aree più piccole, utilizzare un microspettrofotometro costruito su misura (uno spettrofotometro UV-VIS instradato attraverso un microscopio) per misurazioni più semplici e precise, anche se l'ottica del microscopio ha tagliato la luce UV, il che significa che le misurazioni sono limitate al lunghezze d'onda visibili all'uomo (vedere Taylor et al. 2011⁴¹).
3. Nei casi in cui le aree di manipolazione del colore sono estremamente piccole e i dati di riflettanza UV sono necessari, utilizzare i microspettrofotometri UV-VIS disponibili in commercio, anche se sono più costosi (Vedi Taylor et al. 2014⁴²).
   Nota: la fonte di luce degli spettrofotometri UV-VIS contiene luce UV e può essere pericolosa per gli occhi degli animali (compreso il nostro), quindi le misure spettrali devono essere fatte solo dopo che gli animali sono eutanizzati e non solo anestetizzati. Per i ragni verniciati con smalto, questo può essere fatto dopo che i ragni sono stati utilizzati negli esperimenti poiché la vernice non si consuma (vedere i risultati rappresentativi di seguito). Per la vernice a base acquosa che talvolta può svanire dopo giorni o settimane, un insieme di ragni potrebbe essere sacrificato per la misurazione nel momento in cui la loro controparte sarebbe coinvolta in un esperimento (per catturare dati che riflettono l'effettiva manipolazione del colore utilizzata nel esperimento). La segnalazione delle proprietà spettrali delle vernici consentirà la replica da parte di altri ricercatori che potrebbero voler replicare la manipolazione del colore, ma non hanno accesso agli stessi prodotti di verniciatura specifici.

Risultati

Efficacia della manipolazione del colore

Utilizzando queste tecniche, vari gradi di manipolazione del colore sono efficaci, tra cui nascondere completamente i colori o ridurre o migliorare la loro intensità. Ciò è evidente sia dalle fotografie che dalle misurazioni della riflettanza spettrale (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Qui mostriamo Habronattus pyrrithrix maschio manipolato a colori rispetto ai maschi con faccia rossa naturale. Le proprietà spettrali sono state misurate utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS (vedere tabella dei materiali) che può misurare con precisione le aree colorate di dimensioni ridotte di 1mm di diametro. Le misurazioni sono state effettuate rispetto a uno standard bianco riflettanza diffusa (vedere tabella dei materiali).

In rare occasioni (5 su 108 maschi dipinti con eyeliner nero 1 (Vedi tabella dei materiali) sul loro volto), l'eyeliner solubile in acqua ha cominciato a usurarsi i volti dei ragni dopo una settimana o due. Questo non è stato osservato per l'altra marca di eyeliner (eyeliner 2; vedere la tabella dei materiali). In entrambi i casi, le gabbie di ragno sono state spruzzate con acqua da tre a cinque volte a settimana. Diverse condizioni di manutenzione possono influire sull'usura della vernice a base acquosa. La vernice smaltata era ancora intatta per tutti i maschi manipolati (n = 221), anche per quelli ancora vivi dopo 6 mesi.

Potenziale tossicità della manipolazione del colore

Si dovrebbe evitare di ottenere vernice sugli occhi dei ragni in modo da non ostruire la loro visione, né sulle loro chelicerae, parti della bocca e altri orifii, e possibilmente altre parti del corpo morbido per prevenire possibili ingestione e avvelenamento. Si dovrebbe anche fare attenzione con la verniciatura di giunti o parti che contengono peli sensoriali (come le gambe e pedipalps) in modo da non limitare la loro mobilità o sistema sensoriale. Tuttavia, se tali manipolazioni del colore su queste regioni del corpo sono necessarie, o se c'è qualche dubbio circa la possibilità di effetti negativi sottili, è quindi meglio applicare vernici agli individui in tutte le categorie di trattamento. In questo modo, si eviterebbe involontariamente la manipolazione dei sistemi sensoriali degli individui in modi che potrebbero essere polarizzato contro uno solo dei trattamenti. Ad esempio, in un esperimento che utilizza maschi manipolati mostrati nella Figura 4, l'obiettivo era quello di aumentare e diminuire il numero di macchie rosse mostrate dai maschi durante il corteggiamento. Dal momento che alcuni maschi avrebbero ottenere le loro facce rosse naturali nascoste con vernice smaltata grigia (per diminuire la quantità di rosso visualizzato), gli altri maschi per i quali volevamo mantenere un viso rosso sono stati dipinti di rosso sul loro viso naturalmente rosso con lo stesso prodotto come il grigio-Face Maschi. Allo stesso modo, dal momento che volevamo aggiungere macchie rosse al pedipalp su alcuni maschi per aumentare la quantità di macchie di colore rosso visualizzato, vernice grigia è stata utilizzata per coprire il pedipalp di altri maschi in modo che tutti i maschi sarebbero stati verniciati su questa zona sensibile (Vedi Figura 4) . Anche se preferibile, questa strategia potrebbe non essere sempre fattibile. Ad esempio, in un altro esperimento, la colorazione rossa è stata rimossa utilizzando un eyeliner nero che dà la stessa proprietà spettrale della cuticola sottostante del maschio, lasciando gli altri colori maschili intatti e naturali (Figura 2). In questo caso, per i maschi dall'aspetto naturale, la stessa quantità di eyeliner è stata applicata all'area sulla parte superiore del loro carapace appena dietro gli occhi medi anteriori (un'area che non è chiaramente visibile alle femmine), per controllare il potenziale odore o la tossicità complessiva del prodotto. Tuttavia, la posizione in cui viene applicata la vernice può influenzare i ragni in modo diverso. Pertanto, per valutare sottili differenze nel modo o nella posizione in cui è stata applicata la vernice può avere sull'integrità del ragno, il comportamento di entrambi i tipi di maschi in un contesto che era rilevante per le nostre ipotesi (rispetto alla scelta di accoppiamento e cannibalismo sessuale) è stato confrontato. I maschi sono stati messi due-per-due in presenza di una femmina, e abbiamo confrontato il loro ritardo per diventare attivi, il loro ritardo al corteggiamento, e la durata totale hanno speso corteggiamento con modelli di effetto misto lineare generale (utilizzando la funzione lmer con il pacchetto R lme4⁴³ nella versione R 3.5.2⁴⁴ con l'identità femminile come effetto casuale, e utilizzando il criterio di massima probabilità per ottenere i valori p). In questo caso, tutti i confronti non rivelano differenze tra i trattamenti (cfr. tabella 1) ed è stato quindi concluso che non abbiamo introdotto un pregiudizio a favore di una o dell'altra categoria di trattamento.

In entrambi i casi, quando si hanno categorie di trattamento molto simili (Figura 4), o solo individui trattati fittizi (Figura 2 e Figura 3), i ricercatori dovrebbero valutare come le loro specie di modello siano influenzate dalla vernice che utilizzano e garantire che si comportano ancora in modo simile ed ecologicamente pertinente. Si potrebbe registrare i dati per valutare i possibili effetti della tossicità il più possibile, ad esempio confrontando i tassi di attività tra individui trattati e non manipolati. I nostri ragni dipinti con vernice smaltata come nella Figura 4 sono stati confrontati con maschi non manipolati in un contesto altrimenti identico. In particolare, i maschi sono stati introdotti singolarmente a una gabbia femminile e il loro ritardo di lasciare la fiala, ritardare il corteggiamento e il tasso di corteggiamento (prima della copulazione, e prima di essere attaccato o cannibalizzato) sono stati confrontati. Non sono state rilevate differenze (quando si utilizzano simili modelli di effetti misti lineari come sopra) e abbiamo quindi concluso che i nostri maschi verniciati si comportavano naturalmente (tabella 2).

Infine, è importante notare che tutti i ragni negli esperimenti (di solito le femmine) che i maschi manipolati a colori cannibalizzati non sembravano mai soffrire di effetti negativi. I ragni digeriscono la loro preda esternamente, di solito lasciando le aree dipinte della cuticola dietro. Tuttavia, se si adegua questo metodo per altri sistemi in cui saranno consumati animali manipolati dal colore, si dovrebbe valutare i potenziali rischi di tossicità.

Figura 1 . Habronattus pirrithrix maschio adulto illustrando quanto sono minuscole le loro regioni colorate del corpo. Fotografato da Lyle Buss. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2 . Manipolazione del colore sperimentale utilizzata per nascondere la colorazione rossa del viso in Habronattus pyrrithrix. (A) colorazione del viso rossa intatta prima della manipolazione del colore. (B) la colorazione facciale dello stesso maschio dopo aver occultamento la colorazione rossa naturale con eyeliner nero 1. (C) spettri di riflettanza rappresentativi per il viso rosso naturale, la cuticola nera sottostante naturale e la faccia rossa dipinta con eyeliner nero 2. Modificato da Taylor e McGraw 2013³⁹. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 3 . Manipolazione del colore sperimentale utilizzata per ridurre le dimensioni e il rossore del cerotto facciale rosso di Habronattus pyrrithrix maschio. (A) la colorazione del viso rossa intatta prima della manipolazione del colore. (B) la colorazione facciale dello stesso maschio dopo l'applicazione di eyeliner nero diluito (Urban Decay) alla parte anteriore del viso, e eyeliner nero non diluito lungo i bordi del cerotto facciale per ridurre le dimensioni della zona rossa. C) le curve spettrali dei maschi di controllo trattati con Sham (n = 21) e dei maschi manipolati a colori (n = 21), confrontate con la media di popolazione (n = 57) e i 10 migliori maschi di uno studio precedente⁴¹. Figura riprodotta da Taylor et al. 2014³⁸. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 4 . Manipolazione del colore sperimentale utilizzata per modificare il colore della macchia facciale rossa di maschio Di Habronattus pyrrithrix. Habronattus pyrrithrix maschi dipinti con (A) rosso, (B) rosso e grigio, e (C) vernice smaltata grigia sul loro viso rosso naturale e pedipalps naturalmente color crema. D) le curve spettrali per i maschi non manipolati (n = 9) e i maschi con il loro volto ricoperto di vernice smaltata rossa (n = 9). Applicando un rosso più luminoso sul viso del ragno, abbiamo efficacemente migliorato la sua colorazione rossa del viso. Poiché la vernice smaltata copre completamente le scale sottostanti, il colore potrebbe anche essere completamente modificato, come nel caso dello smalto grigio. (E) in questo esperimento, vernici Smalto rosso e grigio sono stati scelti per essere abbinato per la luminosità totale (riflettanza totale sulla gamma di lunghezze d'onda visibili a questi ragni). Le differenze nella scala degli assi Y in D ed e sono dovute a diverse tecniche (come la distanza dal campione e le dimensioni delle aree misurate) per la misurazione di campioni di colore su carta (e) vs. misurazioni dirette dei colori sulla faccia del ragno (d). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. 

N	Variabile dipendente	abbreviazione di "pence" o "penny"	T	Rosso-faccia	± SE	Nero-faccia	± SE	di nFID
202b	Ritardo maschio per lasciare piatto	0,35 a	-0,93	140,0 a	23,9 a	109,8 a	23,9 a	102 a
179c	Ritardo maschile in tribunale	0,74 a	0,33 a	983,4 a	127,1 a	1031,0 a	126,5 a	95 a
204a	Lavoro di corteggiamento maschile	0,52 a	0,63 a	181,2 a	24,4 a	203,0 a	24,4 a	102 a
204a	Lavoro di corteggiamento maschile prima di qualsiasi attacco	0,41 a	0,68 a	89,0 a	15,7 a	97,5 a	15,7 a	102 a

Tabella 1. Effetto della manipolazione del colore del viso maschile sul comportamento, quando verniciato con eyeliner nero contro sham trattato (Figura 2). La struttura di ogni modello è data, così come le stime medio in secondi (± SE) per ogni gruppo di trattamento. N = numero di maschi, p e t = valore p e valore t per il trattamento maschile, nFID = numero di livelli nell'identità femminile a effetto casuale. ^un Fuori dei 104 test maschili eseguiti, 102 sono stati registrati con successo, portando a 204 maschi unici osservati. ^b2 maschi sono stati cannibalizzati dalla femmina prima di uscire dalla capsula di Petri. ^c25 maschi sono stati cannibalizzati dalla femmina prima di corteggiamento mai la femmina.

N	Variabile dipendente	abbreviazione di "pence" o "penny"	T	Forniti	± SE	Dipinto	± SE
32a	Ritardo maschio per lasciare piatto	0,87 a	-0,17	380,8 a	143,1 a	345,4 a	152,4 a
31b	Ritardo maschile in tribunale	0,93 a	-0,09	502,6 a	105,8 a	488,1 a	116,6 a
31b	Lavoro di corteggiamento maschile	0,74 a	-0,33	2324,3 a	455,0 a	2102,1 a	484,4 a
31b	Lavoro di corteggiamento maschile prima di qualsiasi attacco	0,68 a	0,42 a	1495,1 a	450,8 a	1770,1 a	479,9 a

Tabella 2. Effetto della manipolazione del colore del viso maschile sul comportamento, quando verniciato con vernice smaltata rossa o grigia (n = 15, Figura 4) vs. maschi non manipolati (n = 17). La struttura di ogni modello è data, così come le stime medio in secondi (± SE) per ogni gruppo di trattamento. N = numero di maschi, p e t = valore p e valore t per il trattamento maschile. ^un17 maschi non manipolati sono stati confrontati con un sottoinsieme di tutti i maschi verniciati nel nostro esperimento (n = 221). In particolare, sono stati confrontati con 15 maschi verniciati (5 rosso (Figura 2a), 5 rosso e grigio (Figura 2B) e 5 grigio (Figura 2C)) testati nello stesso contesto (in presenza di una femmina) e nello stesso periodo di tempo specifico. Questo è importante perché i maschi non manipolati sono stati testati verso la fine dell'esperimento (in agosto e settembre 2018), che corrisponde alla fine della loro stagione riproduttiva naturale e dove i maschi sono generalmente meno attivi. Mantenere uguali tutte queste altre variabili ci permette di confrontare il trattamento di verniciatura senza introdurre altri pregiudizi. ^b Un maschio (tutto grigio) era cannibalizzato prima di corteggiamento mai la femmina.

Discussione

Qui, mostriamo che i colori delle piccole parti del corpo degli artropodi possono essere efficacemente manipolati usando coloranti come il trucco e le vernici smaltanti.

Il primo passo critico per ottenere una tale delicata manipolazione è quello di essere in grado di immobilizzare piccoli animali che di solito non possono essere trattenuti in mano. Qui, per essere in grado di dipingere aree sensibili come il volto di ragno salto, abbiamo anestetizzato gli individui con CO₂ e montato sulla testa di un perno. Questo permette di lavorare vicino agli occhi del ragno con meno stress che il ragno probabilmente sperimenterebbe se fosse sveglio (con la luce dal microscopio che splende nei loro volti durante il processo di verniciatura).

Il metodo richiede anche ottenere micro spazzole di buona qualità, e, più criticamente, sostanze coloranti appropriate. Il passo più difficile nell'applicare la vernice senza fuoriuscire ma con una buona copertura è quello di ottenere la giusta consistenza. Pertanto, le sostanze coloranti devono essere facilmente diluite con un diluente, e facilmente essiccati per ispessimento. Potrebbero essere utilizzati diversi tipi di vernici; qui, i risultati sono presentati con occhielli solubili in acqua (non impermeabili) e vernici smaltati. Gli occhielli non impermeabili hanno il vantaggio di essere facilmente liquefatti quando miscelati con acqua. Tuttavia, questo si scambia con la diluizione della pigmentazione (che può non o può essere auspicabile (vedere per esempio Figura 3)). Le vernici smaltate hanno una consistenza che può essere facilmente controllata aggiungendo uno smalto più sottile, pur continuando a fornire una copertura completa. Tuttavia, questa caratteristica commercia con la possibilità di mantenere i capelli o la struttura della scala della parte del corpo dipinta. Inoltre, vernici Smalto sono di lunga durata. Il rovescio della medaglia è che vernice smalto e diluente emettono odori forti durante l'applicazione e prima dell'essiccazione. Un'ulteriore difficoltà per quanto riguarda le sostanze coloranti può essere quella di trovare la giusta tonalità, con le giuste proprietà spettrali. È per esempio difficile ottenere eyeliner rosso da utilizzare in parallelo con eyeliner nero, come gli occhielli sono spesso più rosa che rosso. È anche difficile ottenere polvere di trucco (o pigmenti) che non contengono glitter (che a volte può essere visibile solo sotto il microscopio). Molti prodotti per il trucco riflettono anche la luce UV che, pur essendo invisibile agli sperimentatori, potrebbe essere cospicua per gli animali studiati.

Manipolare la colorazione degli artropodi applicando direttamente i coloranti sulle loro parti del corpo viene fornito con vantaggi e inconvenienti rispetto ad altri metodi. La sua principale limitazione è che non si può assolutamente ignorare la possibilità di alcuni effetti di tossicità sottili. Tuttavia, si può garantire di non introdurre pregiudizi contro un gruppo di trattamento applicando vernice a tutte le categorie di trattamento, e/o si può verificare se l'applicazione di vernice interferisce con comportamenti di interesse. Con i metodi presentati qui, abbiamo raccolto abbastanza prove per suggerire che l'applicazione di vernice ha portato a trascurabile a nessun effetto negativo (tabella 1 e tabella 2). Il vantaggio principale di questo metodo è che piccole macchie di colore possono essere mirati, il loro colore ' rimosso ' (Vedi Figura 2), reso più opaco (Figura 3) o più luminoso (Figura 4), in isolamento dal resto della colorazione del corpo e la persona di l'ambiente. Questo contrasta con il metodo alternativo più comune che consiste nel manipolare le condizioni di illuminazione, e quindi modificando l'aspetto visivo dell'intero individuo e dell'ambiente circostante. Infatti, anche quando non si manipolano in modo specifico le condizioni di illuminazione, si può manipolare con successo il colore e vedere limitati o nessun effetto di questa manipolazione se l'ambiente di illuminazione non è appropriato³⁹. Pertanto, è importante misurare e considerare l'ambiente luminoso in cui saranno condotti esperimenti (ad esempio, misurare l'irraggiamento) e assicurarsi di abbinarlo strettamente alle condizioni di luce naturale (ad esempio utilizzando lampadine a spettro completo che simulano luce naturale in cattività). Nel complesso, utilizzando micro spazzole e un microscopio, questo protocollo consente una manipolazione più precisa di piccole macchie di colore rispetto alla maggior parte degli altri metodi di colorazione diretta che sono stati utilizzati in precedenza sugli invertebrati. La maggior parte degli studi precedenti hanno usato animali con macchie di colore che sono relativamente grandi rispetto ai volti dei ragni saltellanti (ad esempio, la manipolazione dei colori delle ali di farfalla^29,34,35, i corpi di adulti hemipterans (' veri insetti ')^30,36 e cavallette³¹, o le gambe di relativamente grandi ragni lupo^32,33,37). I metodi presentati qui aprono opportunità per studiare la straordinaria diversità di macchie di colore su taxa che sono sottostudiate a causa delle loro piccole dimensioni.

Tecniche simili potrebbero essere applicate ad altri artropodi che possono essere immobilizzati o anestetizzati e per le aree in cui la vernice non influirebbe sulla mobilità o sulla salute dell'individuo (ad esempio, escludendo aree quali articolazioni, strutture come capelli o arolio che sono necessarie per la locomozione appropriata, le parti della bocca o altri orifii come le strutture respiratorie). Queste tecniche possono anche essere estese per includere una tavolozza più grande di coloranti, vernici, e trucchi che sono ampiamente disponibili.

Infine, queste tecniche delicate potrebbero essere utilizzate non solo per manipolare il colore su piccoli organismi, ma anche per manipolare modelli (come le strisce) in organismi relativamente più grandi. Questo dovrebbe essere vantaggioso per una vasta gamma di ricercatori che possono adattare i nostri metodi per i propri studi di selezione sessuale, comunicazione, segnali di preda nudibranchi, e altri contesti in cui gli animali utilizzano il colore.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CO2 tank	AirGas (Radnor, PA)	#CD 50	to anesthesize spiders
Enamel paint thinner	Testors (Vernon Hills, IL)	75611792569	to thin enamel paint
Flat enamel paint	Testors (Vernon Hills, IL)	red: 075611115009, black: 075611114903, white: 075611116808	can be thinned with enamel paint thinner
Light microscope	Zeiss (Jena, Germany)	stemi 508	to paint small areas with precision
Light microscope camera	Zeiss (Jena, Germany)	Axiocam 105 color	to take picture before and after manipulation for documentation
Light microscope camera software	Zeiss (Jena, Germany)	Zen 2 blue edition	to process pictures taken before and after manipulation
Liquid liner eyeliner, shade “Perversion”	Urban Decay (Costa Mesa, CA)	(discontinued)	non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 2
MegaLiner liquid eyeliner, black	WetnWild (Los Angeles, CA)	SKU# 871A	non-waterproof eyeliner which can be thinned with water; eyeliner 1
Micro brushes	MicroMark (Berkeley Heights, NJ)	#84648	to allow precise painting of small areas
Non-hardening modelling clay	Van Aken International Claytoon (North Charleston, SC)	18165	to stick small nail or insect pin in and flexily adjust their angles
Small nail or insect mounting pins	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#1208B7	to glue spiders on as well as moving away spider’s appendages in front of the area to paint
Small plastic containers such as the lids of snap-cap insect collection vials	BioQuip (Rancho Dominguez, CA)	#8912	to mix paint and thinner to the right consistency
Small syringe	Fisher Scientific	1482910F	to transfer small amount of enamel thinner
Spectralon white standard	Labsphere Inc. (North Sutton, NH)	WS-1-SL	to measure spectral properties of colors
UV-VIS spectrophotometer	Ocean Optics (Dunedin, FL)	USB 2000 (spectrophotometer) with PX-2 (light source)	to measure spectral properties of colors
Water soluble school glue	Elmer's (High Point, NC)	#E304	to mount the spiders onto a nail/pin
Wood toothpicks	Up&Up, Target Corporation (Minneapolis, MN)	#253-05-0125	to transfer drops of enamel paint