零售食品样品中丁酸二氮的浓缩和检测

摘要

该协议的目的是检测当地购买食品中不同的梭菌毒素毒素，特别是产生B型和D型的乙酸毒素，而无需使用厌氧室。

摘要

梭菌（C.perfringens）是一种多产的毒素生产商，在各种宿主中引起多种疾病。C. perfringes根据四个主要毒素基因的传递，分为五种不同的毒素类型，A 到 E。这些各种技术类型的流行和分布研究不足，尤其是它们在美国零售食品中的普遍性。我们特别感兴趣的是B型和D型菌株，它们产生epsilon毒素，一种极其致命的毒素，被认为是人类多发性硬化症的环境诱因。为了评估各种食物样本中是否存在不同的C.perfringens至上型，我们开发了一种简单的方法，可以选择性地培养这些细菌，而无需使用厌氧容器系统，只涉及三个培养步骤。食品从当地杂货店购买，并在环境条件下运送到实验室。样品被切碎，接种到经过修饰的快速渗透介质（RPM）中，在37°C的密封、气密锥形管中孵育过夜。隔夜培养物接种到固体胰子酶素（TSC）琼脂素（TSC）琼脂素（TSC）的底层，然后覆盖在熔融TSC琼脂的顶层，形成"夹心层"的厌氧环境。Agar板在37°C下孵育过夜，然后评估黑色、亚硫酸盐减少菌落的外观。C. Perfringens- 怀疑菌落使用无菌眼滴器从TSC琼脂中取出，并在37°C的气密锥形管中接种到RPM和亚培养中过夜。从RPM亚培养中提取DNA，然后通过聚合酶链反应（PCR）分析C.perfringens毒素基因是否存在。根据所取样的食物类型，通常有15-20%的样本对C.perfringens检测呈阳性。

引言

克氏菌（C.perfringens）是一种在环境中随处可见的克拉姆阳性、厌氧、孢子形成、棒状细菌。这种细菌携带基因编码超过17种毒素，历史上，根据四种不同的毒素基因的存在，被定性为五种毒素类型（A-E）:α、β、epsilon和iota毒素（表1）1。最近，有人建议，这种打字方案需要扩大，包括类型F和G，其中分别含有C.perfringens肠毒素（CPE）和NetB^{毒素，分别为2。}然而，在正式接受这一阴谋系统之前，还需要进行更多的研究。虽然α毒素基因是严格地染色体定位，CPE基因可以在染色体和质粒上找到。相比之下，剩余的毒素基因发现于各种大小不同的质粒上。我们特别感兴趣的是B型和D型的C.perfringens的流行，因为这些菌株产生一种非常有效的孔隙毒素，一种非常有效的孔隙形成毒素，有人建议在人类中触发多发性硬化症（MS）^{的作用3 ，4，5，6，7}.人们如何被这些菌株感染或殖民是未知的。一个可能的解释是食用受污染的食品。为了帮助回答这个问题，我们试图确定美国食品样本中不同C.perfringes的雄基类型的流行程度。

美国食品样品中存在C.perfringens至氧化剂，研究不足，往往需要使用厌氧容器系统和大量亚培养步骤8、9、10、11.虽然需要许多亚培养步骤来获得纯化的分离物，但这种方法可能导致质粒在12、13、14段时间内流失，从而可能影响质粒传播毒素基因的检测包括西隆毒素基因我们寻求开发一种简单的方法，用更少的亚培养步骤，有选择地培养C. perfringes，而无需使用厌氧室、罐子或袋子。简单地说，食物样本在一夜之间接种到快速Perfringens介质（RPM）中（ON），然后"夹"入TSC琼脂并孵化。被怀疑为C.perfringes的菌落随后被亚培养到RPM中，并再次孵育。脱氧核糖核酸提取和PCR执行以确定基因型（图1）。我们选择使用RPM，因为它已被证明，以增加从食品样品中C.perfringens菌株的回收量相比，其他更标准的^介质15。此外，RPM还成功地用于从MS^患者4中分离出产生B型菌株的Epsilon毒素。我们使用经过修改的 RPM 版本而不是原始版本，以便轻松提取 DNA。虽然这种方法允许在样本中轻松识别毒素基因，但单个样本可能含有多个C. perfringes毒素类型。由于我们的方法不使用多轮纯化分离纯化菌株，因此无法从一个样品中识别多个毒体型。然而，标准纯化技术（通常条纹到TSC板或血琼脂板）可以在我们的协议结束时应用，以实现纯化培养。

研究方案

注: C. perfringes被认为是生物安全危害级别 2 （BSL2） 生物体。虽然并非所有食物样本都含有C.perfringens，但所有培养的样本都应作为处理。应始终佩戴所有适当的预防措施和人员防护设备 （PPE）。在处置前清除所有材料。

1. 准备修改的 RPM^4，15

1. 结合 30 g/L 液体硫化醇介质、60 g/L 明胶、5 g/L 肽、5 g/L 葡萄糖、5 g/L 磷酸二基钾、3 g/L 酵母提取物、1.5 g/L 氯化钠、0.5 g/L 硫酸铁，直到均匀分散。我们通常生产 1 L 批次。
2. 在121°C下高压灭菌15分钟。
3. 冷却至约40°C。
4. 一旦RPM冷却，将D-环色剂添加到440mg/L的最终浓度中。
   注:溶解在无菌水中的D-环素浓度在50mg/mL下可储存在-20°C，供日后使用。
5. 无菌地将 10 mL 的 RPM 转移到 15 mL 锥形管。RPM 可分批制备，并在 4°C 下存储长达一个月。
6. 使用前，将转速加热到 37°C。

2. 样品收集和RPM孵育

1. 在1小时内将食物在环境温度下运送到实验室。食品可采用原包装或无菌容器运输。如果不立即测试，食物可储存在-20°C，直到使用。根据包装标签（如有）以及任何其他相关信息，记下食品的类型和原产国。
2. 取出约1.0~2.0克的食物，转移到无菌培养皿或等量物中。用无菌剃刀刀片或手术刀细切。
3. 在15 mL锥形管中接种成10 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。混合好。
   1. 要选择植物细胞，将5 mL的PBS-食物混合物转移到含有10 mL转速的15 mL锥形管中。将盖子紧紧固定。
   2. 要选择孢子，请在 85°C 加热剩余的 5 mL PBS 食品混合物 15 分钟，然后转移到含有 10 mL 转速的 15 mL 锥形管中。将盖子紧紧固定。
4. 涡旋和反转食物-RPM培养物，以确保完全混合。
5. 用石蜡薄膜或塑料包装紧紧密封锥形管和盖盖，以确保厌氧环境。
6. 在37°C下孵育过夜（开）。
7. 第二天早上注意 RPM 管中的任何浊度或发酵。

3. TSC"三明治"电镀

1. 使用"三明治"技术（图2）将RPM培养物接种到TSC琼脂中（图2）。如下所述。
2. 按照制造商的说明准备 TSC 琼脂。
   1. 通过将 10 mL 的熔融 TSC 琼脂转移到无菌培养皿中，并允许凝固，准备 TSC 板的底层。这些可以提前制备，并储存在4°C。在使用前，确保板加热到室温。
   2. 对于 TSC 板的顶层，将剩余的熔融 TSC 琼脂保持在 40°C。
      注:虽然琼脂的熔点高于85°C，但熔融琼脂在32~45°C左右凝固。
3. 仔细检索 ON RPM 培养物，并将 100 μL 传输到 TSC 琼脂基。由于发酵，一些培养物可能面临压力。确保佩戴所有合适的个人防护装备。
4. 使用灭菌玻璃珠或细胞扩张器传播 RPM 接种。
5. 在室温下，允许 RPM"吸收"到 TSC 琼脂中 5-10 分钟。
6. 小心地将 20 mL 的熔融、40°C TSC 琼脂转移到板中，使用血清学移液器。
7. 更换培养皿盖，让 TSC 琼脂在室温下完全凝固。
8. 反转培养皿，在 37°C 打开时孵育。
9. 如果需要连续稀释，在接种到 TSC 琼脂之前，将 ON RPM 培养物稀释到新鲜、预热的 RPM 中。

4. 亚培养亚化亚硫化物减少菌落

1. 第二天早上，从培养箱中取出板，检查细菌生长。琼脂上可能存在有氧细菌。厌氧细菌将被发现生长在琼脂内。降硫酸盐的细菌会使周围的琼脂变黑。可能的C.perfringes菌落将是黑色的，并嵌入在琼脂。
2. C. 怀疑的菌落对亚硫酸盐的减少呈阳性反应，并且会出现黑色，嵌入在琼脂内。使用无菌的一次性滴管，从琼脂"挖出"黑色菌落，并在15 mL锥形管中转移到10 mL的新鲜RPM。在刺穿琼脂之前，排出滴注物中的空气是很重要的。
3. 如果板表面有氧细菌生长量很大，请使用无菌细胞刮刀从选定区域去除菌落。可以从同一TSC板将多个C.perfringes疑似菌落取样到单独的RPM培养物中。
4. 牢牢固定锥形管盖，并包裹在石蜡薄膜或塑料包装。在 37°C 下孵育。

5. DNA提取

1. 去除 RPM 培养物，检查生长迹象，包括浊度和发酵。
2. 轻轻反转 RPM 培养，以分散任何沉淀的细菌并小心打开。将培养层1 mL转移到微离心管中。
3. 以最高速度（约15，000 x g）离心10分钟，以颗粒细菌。
4. 用1 mL无菌PBS清洗颗粒。
   1. 在某些情况下，未消化的明胶会沉淀在颗粒细菌之上。要去除明胶，使用微移液器轻轻搅拌 PBS，"蓬松"脱落明胶。这将"蓬松"明胶，同时保持细菌颗粒完好无损。
   2. 用柔和的吸入去除PBS-明胶混合物。用 1 mL 的新鲜 PBS 重新悬浮剩余的细菌颗粒。
5. 以最高速度将重新悬浮的细菌颗粒离心 10 分钟，并小心地吸出上清液。
6. 立即使用DNA提取试剂盒和专门为从革兰氏阳性细菌中提取DNA而创建的协议进行DNA提取（见材料表）。
7. 立即使用提取的DNA或储存在-20°C，直到PCR分析。

6. 通过PCR基因分型检测C. perfringeins

1. 为了确定培养物对C.perfringes毒素类型是否呈阳性，通过PCR检查提取的DNA是否具有不同的毒素基因。
   注:因为我们对产生B型和D型的乙类毒素最感兴趣，我们评估α、β和epsilon毒素基因的存在。引注列于表2。16s核糖体DNA的引源用作DNA提取控制。额外的引种可用于测试至G的至A型，可在已发表的^{文献2、12、13}中找到。
2. 使用先前提取的C.perfringens DNA作为阳性对照。此控制可确保 PCR 反应的所有组件都正常工作。我们使用从B型C.perfringens（ATCC 3626）中提取的DNA作为我们的阳性对照。在 37°C 转速下在 RPM 中生长 ATCC 3636 ON，并使用步骤 5.1_5.7 中所述的相同方法提取 DNA。将提取的DNA储存在-20°C，直到使用。
3. 设置 PCR 条件如下:94.0 °C 3 分钟;94.0 °C，30 s;47.9 °C，30 秒，72.0 °C 1 分钟（35 个循环重复步骤 2⁄4）;72.0 °C 10 分钟
4. 为了确认PCR产品，使用标准技术在1.8 g/100 mL胶凝胶上运行PCR反应。表2列出了预期的PCR产品尺寸。典型的PCR结果如图3所示。

结果

使用这种方法，我们15-20%的抽样食品对C.perfringens检测呈阳性。虽然大多数菌株对毒体A呈阳性，但我们在食品样品中成功检测出B型和D型。在先前发表的一篇论文中，我们测试了从纽约零^{售商店16（}表3）购买的216个食品样本。这些样本包括各种肉类样品（牛肉、羊肉、猪肉和羊肉）、家禽样本（鸡肉和火鸡）和海鲜样品（鳕鱼、鲑鱼、贝类、鱼翅、比目鱼、鱿鱼、罗非鱼、金枪鱼和各种其他鱼类）。还测试了农产品和乳制品样品。在 216 个样本中，34 个 （16%）对C.perfringens是积极的。在34个C.Perfringens阳性样本中，31个样本（91.2%）含有α毒素，一个样本（2.9%）含有α、β和epsilon毒素，以及两个样本（5.9%）含有α和麻黄素毒素。

有趣的是，我们还发现，与孢子相比，C.perfringes作为植物细胞更为普遍。对25个样本进行了比较，比较了植物性C. perfringees细胞或孢子的存在。孢子在85°C下被热冲击样品选择15分钟。在测试的25个样本中，16%对植物性C.perfringees菌株呈阳性反应，而孢子为4%。这表明，只测试植物细胞而不是两者，可能更具成本效益。

图 1:过程概述。
食物样品被切碎并稀释成无菌PBS。PBS-食物样本的一半接种到RPM中，以选择植物细胞。其余PBS-食品样品在85°C下热休克15分钟，在RPM中接种前选择孢子。培养物在37°C下孵育，然后镀入TSC琼脂。TSC琼脂在37°C时孵育，黑色、亚硫酸盐培养物亚培养成新的RPM。亚培养的RPM培养物在37°C下孵育，DNA被提取，通过PCR进行基因分型。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:TSC琼脂三明治技术的原理图。
含有C.perfringens细菌的RPM介质在TSC琼脂的两层之间镀层，以促进厌氧环境。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:选定的 PCR 结果。
来自七种不同类型食物的C.perfringens的基因分型结果示例图像，以及C.perfringens类型B的正对照。 分子量阶梯（每个凝胶的第一道）用于近似于碱基对（bp）中的PCR结果的大小。请点击此处查看此图的较大版本。

Toxinotype		阿 尔 法	试用版	小量	丝毫	Cpe	净B
建立	A	+	-	-	-	-	-
	B	+	+	+	-	-	-
	C	+	+	-	-	+	-
	D	+	-	+	-	+	-
	E	+	-	-	+	+	-
提出	F	+	-	-	-	+	-
	G	+	-	-	-	-	+
• 存在 - 不存在 */- 可能存在，也可能不存在

表1:C.perfringens基因型概述。每个C. perfringes toxinotype产生的毒素组合图。

目标	底漆对	预期 PCR 产品（bp）
阿 尔 法	F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG	325
试用版	F: GCG AAT AT CTG AT CAT CTA R: GCA GGA ACA GTA TAT CTT C	196
小量	F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC	655
16s RNA	F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CT T GTT ACG ACT T	¥1300

表2:选定毒素基因的引信和预期PCR产物。在 PCR 基因分型步骤中使用的引基器。

食品类型			A 型		B 型		C 型		D 型		C. perf |
			α毒素阳性		α、β和epsilon毒素阳性		α和β毒素阳性		α和环子毒素阳性
		n	n	%	n	%	n	%	n	%	n	%
肉	牛肉	38	8	21%	1	3%	0	0%	0	0%	9	24%
	羔羊	10	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	猪肉	15	2	13%	0	0%	0	0%	0	0%	2	13%
	混合	1	1	100%	0	0%	0	0%	0	0%	1	100%
	次 全 切除	64	11	17%	1	2%	0	0%	0	0%	12	19%
家禽	鸡	19	5	26%	0	0%	0	0%	0	0%	5	26%
	土耳其	7	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	次 全 切除	26	5	19%	0	0%	0	0%	0	0%	5	19%
海鲜	Cod	4	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	混合	1	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	鲑鱼	11	2	18%	0	0%	0	0%	0	0%	2	18%
	货架	32	1	3%	0	0%	0	0%	0	0%	1	3%
	甲鱼	4	3	75%	0	0%	0	0%	0	0%	3	75%
	比目鱼	12	4	33%	0	0%	0	0%	0	0%	4	33%
	鱿鱼	4	1	25%	0	0%	0	0%	0	0%	1	25%
	罗非鱼	21	2	10%	0	0%	0	0%	2	10%	4	19%
	金枪鱼	3	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	其他	8	1	13%	0	0%	0	0%	0	0%	1	13%
	次 全 切除	100	14	14%	0	0%	0	0%	2	2%	16	16%
乳品	牛	3	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	山羊	4	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	牛奶	3	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	次 全 切除	10	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
生产	蔬菜	12	1	8%	0	0%	0	0%	0	0%	1	8%
	水果	1	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	药草	3	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%	0	0%
	次 全 切除	16	1	6%	0	0%	0	0%	0	0%	1	6%
总		216	31	14%	1	0.50%	0	0%	2	0.90%	34	16%

表3:216个食品样本中不同C.perfringes的雄基类型流行率。使用这种方法测试零售食品时获得的结果示例。这张表是从先前出版的手稿Regan^等人16日修改的。

讨论

在这里，我们描述了一种方法，以确定零售食品样品中C. perfringes的流行，其亚培养有限，并且不使用厌氧室系统。该方法使用多种技术的组合来增加从食品样品中识别C.perfringens。通过使用改进版本的 RPM 介质，我们允许C. perfringes的选择性增长。通过将接种的RPM夹在TSC琼脂层之间，我们能够识别和分离厌氧、亚硫酸盐还原的细菌特性。为了确认C.perfringes的存在，亚化亚培养亚培养成新的RPM。改性版本或 RPM 使我们能够轻松地从培养物中提取 DNA，从而能够确认特定毒素基因的 PCR。三天内即可确认C.perfringes污染食品样本。

在早期实验中，食物样本被简单地接种到RPM和从ON培养物中提取的DNA中。此方法导致在有限数量的样本（未显示数据）中检测C. perfringes。虽然 RPM 是选择性的 C. perfringes增长， 它不是排他性的C. perfringes增长.其他，克阳性，D-环素耐药细菌仍然可以在RPM中生长。我们假设其他细菌物种的污染可能降低了我们在第一个 ON RPM 培养中 PCR 分析的灵敏度，从而降低了我们对C. perfringes菌株的检测。增加C.perfringens检测的一个关键步骤是纳入了TSC琼脂"三明治"技术。这使我们能够区分和选择厌氧，亚硫酸盐减少菌落，C. perfringens的特征。此过程的一个关键步骤是确保熔融 TSC 琼脂的顶层温度为 40°C。虽然一些C.perfringens菌株可以在增加的温度（46-48°C）15，16，添加熔融琼脂在增加的温度大大降低恢复的培养物的数量，主要可能是由于细胞死亡.

此方法存在几个潜在的限制。如前所述，RPM 和 TSC agar 均不专门选择或区分C. perfringens，从而允许食物样本中存在的其他细菌物种的生长。这可能降低测定的灵敏度，以便仅选择C. perfringes。然而，这是几乎所有栽培技术的一个常见限制。纯化分离物的基因分型确认是明确识别C.perfringens和其他细菌物种的最佳方法。这项研究的另一个限制是，我们不测试纯化的隔离物。我们特意这样做来限制亚培养的数量，因为反复的亚培养令人担心会导致质粒损失。由于我们不分离到纯度，有可能在同一样品或亚培养中存在多个C. perfringes toxinotype。如果研究人员希望获得纯化的分离物，标准纯化方法可用于该方法所述的最后RPM培养;这通常需要使用厌氧室。虽然最初用于从食物中分离C. perfringes，但此方法可用于从多种来源中识别和分离C. perfringes。具体来说，这种方法的一个应用是检测人类（或动物）的粪便样本，这些样本被怀疑感染了C. perfringes，并对细菌进行管灭，以更好地了解感染源。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Dextrose	Sigma Life Science	D9434-250G
Disposable Transfer Pipets	any brand		Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69504	Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.
Dry Incubator	any brand
Fluid thioglycolate medium	Remel	R453452
Gelatin from porcine skin	Sigma Life Science	G1890-500G
Individual Primers	Invitrogen
Iron (II) sulfate heptahydrate	Sigma Life Science	F8633-250 G
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	L6876	Needed for DNA extraction, not provided in kit
microcentrifuge tube	any brand
parafilm or plastic wrap	any brand
Peptone from casein and other animal proteins	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP)	Oxoid	CM0587	Make TSC agar according to instructions
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-7653
Sterile Cell Scraper	any brand
Sterile cell Spreader	any brand
Sterile petri dishes	any brand
Supplies and equipment for gel electrophoresis	any brand
table top centrifuge	any brand
Taq PCR Master Mix Kit	Qiagen	201443
Thermocycler for PCR reaction	any brand
water bath	any brand
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161-100G