Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Resumo

O objetivo deste protocolo é detectar diferentes toxinotipos de Clostridium perfringens em alimentos adquiridos localmente, particularmente a toxina Epsilon produzindo tipos de estirpe B e D, sem o uso de câmaras anaeróbias.

Resumo

Clostridium perfringens (C. perfringens) é um produtor prolífico da toxina e causa uma escala larga das doenças em vários anfitriões. C. perfringens é categorizado em cinco diferentes toxinotipos, a através de E, com base no transporte de quatro genes principais da toxina. A prevalência e distribuição destes vários toxinotipos é subestudada, especialmente a sua difusão em alimentos de retalho americanos. De particular interesse para nós são as estirpes tipo B e D, que produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente letal sugerida para ser o gatilho ambiental da esclerose múltipla em seres humanos. Para avaliar a presença de diferentes toxinotipos de C. perfringens em várias amostras de alimentos, desenvolvemos um método fácil para a cultura seletiva dessas bactérias sem o uso de um sistema de Container anaeróbio envolvendo apenas três etapas de cultivo. Os alimentos são comprados em mercearias locais e transportados para o laboratório em condições ambientais. As amostras são picadas e inoculadas em meios de perfringens rápidos modificados (RPM) e incubadas durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico selado, hermético. Culturas overnight são inoculadas em uma camada inferior de sólidos Triptse sulfito cicloserina (TSC) Agar, e, em seguida, sobrepostas com uma camada superior de agar TSC derretido, criando um "imprensado", ambiente anaeróbio. As placas de agar são incubadas durante a noite a 37 ° c e, em seguida, avaliadas para o aparecimento de colônias pretas, com redução de sulfito. C. perfringens-as colônias suspeitadas são removidas do agar de TSC usando os conta-gotas estéreis do olho, e INOCULADOS no RPM e subcultivados durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico hermético. O DNA é extraído da subcultura RPM e, em seguida, analisado para a presença de genes de toxina C. perfringens via reação em cadeia da polimerase (PCR). Dependendo do tipo de alimento amostrado, tipicamente 15 – 20% das amostras testam positivo para C. perfringens.

Introdução

Clostridium perfringens (C. perfringens) é um Gram positivo, anaeróbio, esporo-formando, haste em forma de bactéria que é encontrado onipresente no ambiente. Esta espécie de bactéria transporta genes que codificam por mais de 17 toxinas e, historicamente, tem sido caracterizada em cinco toxinotipos (A-E) com base na presença de quatro genes de toxina diferentes: alfa, beta, Épsilon e toxina Iota (tabela 1)¹. Recentemente, tem sido sugerido que este esquema de digitação precisa ser expandido para incluir os tipos F e G, que abrigam a toxina C. perfringens enterotoxina (CPE) e NetB, respectivamente². Entretanto, mais pesquisa é precisada antes que este sistema planejando seja aceitado formalmente. Quando o gene da toxina alfa for localizado estritamente cromossomicamente, o gene de CPE pode ser encontrado no cromossoma e nos Plasmids. Em comparação, os genes restantes das toxinas são encontrados em vários plasmídos de tamanho diferente. Estamos particularmente interessados na prevalência de C. perfringens tipos B e D como estas cepas produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente potente, formando poros, que tem sido sugerido para desempenhar um papel no desencadeamento da esclerose múltipla (MS) em seres humanos^{3 ,4,5,6,7}. Como as pessoas se tornam infectadas ou colonizadas por essas cepas é desconhecido. Uma possível explicação é através do consumo de produtos alimentares contaminados. Para ajudar a responder a esta pergunta, procurou-se determinar a prevalência de diferentes toxinotipos de C. perfringens em amostras de alimentos americanas.

A presença de C. perfringens toxinotypes em amostras de alimentos americanas é subestudada e muitas vezes requer o uso de sistemas de contêineres anaeróbios e inúmeras etapas de subculturação^8,9,10,11 . Embora inúmeras etapas de subculturação sejam necessárias para a obtenção de isolados purificados, esse método pode levar à perda de plasmídeo ao longo do tempo^{12,13,14, possivelmente}afetando a detecção de genes de toxina de origem plasmática incluindo o gene da toxina épsilon. Procurou-se desenvolver um método fácil, com menos etapas de subculturação, para seletivamente cultura C. perfringens sem o uso de câmaras anaeróbias, frascos, ou sacos. Brevemente, as amostras de alimentos são inoculadas em Rapid perfringens Media (RPM) durante a noite (ON), em seguida, "imprensado" em agar TSC e incubadas ON. Colônias suspeitas de ser C. perfringens são então SUBCULTIVADAS em RPM e incubadas novamente em. O DNA é extraído e a PCR é realizada para determinar o genótipo (Figura 1). Optou-se por utilizar a RPM, como foi demonstrado para aumentar a recuperação de cepas de C. perfringens de amostras de alimentos em comparação com outros meios mais padrão¹⁵. Além, o RPM foi usado com sucesso para isolar uma toxina do Epsilon que produz a tensão do tipo B de um paciente de MS⁴. Nós usamos uma versão modificada do RPM em vez da versão original para permitir a extração fácil do ADN. Enquanto este método permite a fácil identificação de genes de toxinas dentro de amostras, é possível que uma amostra individual conterá mais de um C. perfringens toxinotype. Como nosso método não isola cepas purificadas usando várias rodadas de purificação, a identificação de vários toxinotipos de uma amostra não é possível. No entanto, técnicas de purificação padrão (tipicamente estrias em placas de TSC ou placas de agar sangue) podem ser aplicados no final do nosso protocolo para alcançar culturas purificadas.

Protocolo

Nota: C. perfringens é considerado um organismo de nível de risco de biossegurança 2 (BSL2). Apesar de nem todas as amostras de alimentos conterá C. perfringens, todas as amostras cultivadas devem ser tratadas como tal. Todas as precauções apropriadas e equipamentos de proteção de pessoal (EPI) devem ser usados em todos os momentos. Descontaminam todo o material antes da eliminação.

1. Prepare rpm modificado^4,15

1. Combine 30 g/L fluido tioglicolato médio, 60 g/L gelatina, 5 g/L peptona, 5 g/L de glicose, 5 g/L fosfato de potássio dibásico, 3 g/L extrato de levedura, 1,5 g/L cloreto de sódio, 0,5 g/L de sulfato ferroso em água deionizada até dispersar uniformemente. Normalmente, fazemos lotes de 1 L.
2. Autoclave a 121 ° c por 15 min.
3. Deixe esfriar a aproximadamente 40 ° c.
4. Uma vez que o RPM é fresco, adicione D-Cycloserine a uma concentração final de 440 mg/L.
   Nota: as concentrações de D-cicloserina dissolvidas em água estéril a 50 mg/mL podem ser armazenadas a-20 ° c para utilização futura.
5. Transfira assepticamente 10 mL de RPM para tubos cônicos de 15 mL. A RPM pode ser preparada em lotes e armazenada a 4 ° c por até um mês.
6. Aqueça o RPM ao ° c 37 antes do uso.

2. coleção da amostra e incubação do RPM

1. Transporte de alimentos para o laboratório temperaturas ambiente dentro de 1 h. os alimentos podem ser transportados em embalagens originais ou recipientes estéreis. Se não estiver testando imediatamente, os alimentos podem ser armazenados a-20 ° c até o uso. Anote o tipo de alimento e o país de origem de acordo com o rótulo da embalagem, se disponível, bem como qualquer outra informação relevante.
2. Remova aproximadamente 1,0 – 2,0 g de alimento e transfira para a placa de Petri estéril ou equivalente. Finamente mince com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi.
3. Inocular em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo cônico de 15 mL. Misture bem.
   1. Para selecionar para células vegetativas, transfira 5 mL da mistura de PBS-Food para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Fixe a tampa firmemente.
   2. Para selecionar para esporos, aqueça os restantes 5 mL de mistura de PBS-Food a 85 ° c durante 15 min e depois transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Fixe a tampa firmemente.
4. Vórtice e inverta as culturas Food-RPM para garantir a mistura completa.
5. Vede firmemente os tubos cônicos e enrole as tampas com película de parafina ou envoltório plástico para garantir um ambiente anaeróbio.
6. Incubar durante a noite (ON) a 37 ° c.
7. Na manhã seguinte, anote qualquer turbidez ou fermentação em tubos RPM.

3. TSC "sanduíche" chapeamento

1. Inoculate em culturas RPM em agar TSC usando uma técnica de "sanduíche" (Figura 2) descrita abaixo.
2. Prepare o agar TSC de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Prepare a camada de base das placas de TSC Transferindo 10 mL de agar TSC derretido para pratos de Petri estéreis e permita solidificar. Estes podem ser preparados em avançado e armazenados a 4 ° c. Assegure-se de que as placas estejam aqueceu à temperatura ambiente antes do uso.
   2. Para a camada superior da placa de TSC, mantenha o ágar derretido restante de TSC em 40 ° c.
      Nota: embora o ponto de derretimento do agar esteja acima de 85 ° c, o agar derretido solidifica em torno de 32 – 45 ° c.
3. Recupere cuidadosamente as culturas ON RPM e transfira 100 μL para a base de agar TSC. Por causa da fermentação, algumas culturas podem estar pressão. Certifique-se de usar todos os EPI apropriados.
4. Espalhe o inóculos RPM usando grânulos de vidro esterilizados ou propagador de células.
5. Permitir que o RPM seja "absorvido" em agar TSC por 5 – 10 min à temperatura ambiente.
6. Transfira cuidadosamente 20 mL de agar TSC derretido de 40 ° c para a placa utilizando uma pipeta serológica.
7. Substitua a tampa do prato de Petri e permita que o agar TSC se solidifique completamente à temperatura ambiente.
8. Inverta o prato de Petri e incubar a 37 ° c ON.
9. Se as diluições seriais forem desejadas, realize diluições das culturas ON RPM em RPM pré-aquecido antes da inoculação em agar TSC.

4. sub-cultivo de colônias redutoras de sulfitos

1. Na manhã seguinte, retire as placas da incubadora e examine o crescimento bacteriano. Bactérias aeróbias podem estar presentes na superfície do agar. As bactérias anaeróbias serão encontradas crescendo incorporado dentro do ágar. As bactérias redutoras de sulfito vão virar preto Agar circundante. As colônias possíveis de C. perfringens serão pretas e encaixadas no ágar.
2. As colônias suspeitas de C. perfringens serão positivas para a redução do sulfito e parecerá pretas, encaixadas dentro do agar. Usando um conta-gotas estéril, de uso único, "Pluck" as colônias pretas do agar e transferência para 10 mL de RPM fresco em um tubo cônico de 15 mL. É importante que o ar do conta-gotas seja expulso antes do agar piercing.
3. Se houver uma quantidade densa de crescimento bacteriano aeróbio na superfície da placa, use um raspador de células estéreis para remover colônias de áreas selecionadas. Várias colônias suspeitas de C. perfringens podem ser amostradas a partir da mesma placa de TSC em culturas de RPM separadas.
4. Firmemente segura tampas de tubo cônicos e enrole em filme de parafina ou plástico Wrap. Incubar ON a 37 ° c.

5. extração de DNA

1. Remova as culturas ON RPM e examine os sinais de crescimento, incluindo turbidez e fermentação.
2. Inverta suavemente a cultura de RPM para dispersar qualquer bactéria liquidada e abrir cuidadosamente. Transfira 1 mL da cultura para um tubo de microcentrífuga.
3. Centrifugador na velocidade superior (aproximadamente 15.000 x g) para 10 minutos às bactérias da pelota.
4. Lave a pelota com 1 mL de PBS estéril.
   1. Em algumas circunstâncias, gelatina não digerida vai assentar em cima de bactérias peletizadas. Para remover a gelatina, "fluff" fora de gelatina, agitando suavemente com PBS usando uma micropipeta. Isso vai "fluff-up" a gelatina, deixando a pelota bacteriana intacta.
   2. Retire a mistura de PBS-gelatina com aspiração suave. Resuspender a pelota bacteriana remanescente com 1 mL de PBS fresco.
5. Centrifugue a pelota bacteriana ressuscipended na velocidade superior por 10 minutos e Aspire com cuidado o sobrenadante.
6. Execute imediatamente a extração do ADN usando um jogo da extração do ADN e um protocolo criado especificamente para o ADN da extração das bactérias Gram-positive (veja a tabela dos materiais).
7. Use o DNA extraído imediatamente ou armazene a-20 ° c até a análise do PCR.

6. detecção de C. perfringens via PCR genotipagem

1. Para determinar se as culturas são positivas para os toxinotypes de C. perfringens , examine o ADN extraído para genes diferentes da toxina através do PCR.
   Nota: como estamos mais interessados na toxina Epsilon produzindo cepas tipo B e D C. perfringens, avaliamos a presença dos genes alfa, beta e toxina épsilon. Os primers estão listados na tabela 2. Os primers para o ADN ribosomal 16s são usados como um controle da extração do ADN. Os primers adicionais podem ser usados para testar toxinotypes a através de G e podem ser encontrados na literatura publicada^2,12,13.
2. Use o ADN previamente extraído de C. perfringens como um controle positivo. Este controle assegura-se de que todos os componentes das reações do PCR estejam trabalhando. Utilizamos DNA extraído de C. perfringens tipo B (atcc 3626) como nosso controle positivo. Cresça ATCC 3636 ON em RPM a 37 ° c e extraia o DNA usando os mesmos métodos descritos nas etapas 5.1 – 5.7. Armazene o DNA extraído a-20 ° c até o uso.
3. Defina as condições do PCR da seguinte maneira: 94,0 ° c por 3 min; 94,0 ° c por 30 s; 47,9 ° c para 30 s, 72,0 ° c por 1 min (repita os passos 2 – 4 para 35 ciclos); 72,0 ° c por 10 min.
4. Para confirmar produtos do PCR, funcione reações do PCR em um gel do agarose de 1,8 g/100 mL usando técnicas padrão. Os tamanhos de produto de PCR esperados estão listados na tabela 2. Os resultados típicos da PCR são exibidos na Figura 3.

Resultados

Usando este método, 15 – 20% de nossos alimentos amostrados testam positivo para C. perfringens. Quando a maioria de tensões forem positivas para o toxinotype A, nós detectamos com sucesso o tipo B e o D em amostras de alimento. Em um artigo publicado anteriormente, testamos um total de 216 amostras de alimentos compradas em lojas de varejo de Nova York¹⁶ (tabela 3). Estas amostras incluíram várias amostras de carne (carne bovina, cordeiro, porco e cordeiro), amostras de aves (frango e Peru) e amostras de frutos do mar (bacalhau, salmão, mariscos, pardos, linguado, Lula, tilápia, atum e vários outros peixes). Amostras de produtos e laticínios também foram testadas. De 216 amostras, 34 (16%) foram positivas para C. perfringens. Das 34 amostras positivas de C. perfringens , 31 amostras (91,2%) continha a toxina alfa, uma amostra (2,9%) continha a toxina alfa, beta e épsilon, e duas amostras (5,9%) continha a toxina alfa e Épsilon.

Curiosamente, também descobrimos que C. perfringens foi mais prevalente como células vegetativas em comparação com esporos. Vinte e cinco amostras foram comparadas para a presença de células vegetativas de C. perfringens ou esporos. Os esporos foram selecionados por amostras de calor chocantes a 85 ° c por 15 min. Das 25 amostras testadas, 16% foram positivas para cepas vegetativas de C. perfringens versus 4% para esporos. Isso indica que pode ser mais rentável para testar somente células vegetativas em vez de ambos.

Figura 1: visão geral do procedimento.
As amostras de alimentos são triturados e diluídos em PBS estéril. Metade da amostra de PBS-Food é inoculada em RPM para selecionar para células vegetativas. A amostra restante do PBS-alimento é calor chocado em 85 ° c por 15 minutos para selecionar para esporos antes da inoculação no RPM. As culturas são incubadas sobre a 37 ° c, em seguida, banhado em agar TSC. O agar TSC é incubado ON a 37 ° c e as culturas redutores de sulfito são subcultivadas em RPM fresco. As culturas subcultivadas do RPM são incubadas sobre em 37 ° c e o ADN é extraído para executar genotipagem através do PCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: esquema da técnica de sanduíche de agar TSC.
Os meios do RPM que contêm as bactérias de C. perfringens são chapeados entre duas camadas de agar de TSC a fim promover um ambiente anaeróbio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: resultados de PCR selecionados.
Exemplo de imagens dos resultados genotipantes de c. perfringens de sete tipos diferentes de alimentos, e um controle positivo de c. perfringens tipo B. Uma escada de peso molecular (primeira pista de cada gel) foi utilizada para aproximar o tamanho dos resultados da PCR em pares de base (BP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Toxinotipo		Alfa	Beta	Epsilon	Iota	Cpe	NetB
Estabelecido	Um	+	-	-	-	-	-
	B	+	+	+	-	-	-
	C	+	+	-	-	+	-
	D	+	-	+	-	+	-
	E	+	-	-	+	+	-
Proposta	F	+	-	-	-	+	-
	G	+	-	-	-	-	+
+ presente -Não está presente +/-pode ou não estar presente

Tabela 1: visão geral dos genótipos de C. perfringens . Um gráfico das combinações de toxinas produzidas por cada C. perfringens toxinotype.

Alvo	Pares da primeira demão	Produto esperado do PCR (BP)
Alfa	F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG	325
Beta	F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA ATT GTA TAT CTT C	196
Epsilon	F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC	655
16s RNA	F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T	~ 1300

Tabela 2: primers e produtos esperados de PCR para genes de toxina selecionados. Primers utilizados na etapa de genotipagem de PCR.

Tipo de alimento			Tipo A		Tipo B		Tipo C		Tipo D		C. perf +
			positivo da toxina alfa		Alfa, beta e toxina épsilon positivas		Alfa e beta toxina positiva		toxina alfa e Épsilon positiva
		N	N	%	N	%	N	%	N	%	N	%
Carne	Carne	38	8	21	1	3	0	0	0	0	9	24
	Cordeiro	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Porco	15	2	13	0	0	0	0	0	0	2	13
	Misto	1	1	100% de	0	0	0	0	0	0	1	100% de
	Subtotal	64	11	17	1	2	0	0	0	0	12	19
Aves	Frango	19	5	26	0	0	0	0	0	0	5	26
	Turquia	7	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Subtotal	26	5	19	0	0	0	0	0	0	5	19
Marisco	Bacalhau	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Misto	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Salmão	11	2	18	0	0	0	0	0	0	2	18
	amêijoas	32	1	3	0	0	0	0	0	0	1	3
	Snapper	4	3	75% de	0	0	0	0	0	0	3	75% de
	Solha	12	4	33% de	0	0	0	0	0	0	4	33% de
	Lula	4	1	25	0	0	0	0	0	0	1	25
	Tilápia	21	2	10	0	0	0	0	2	10	4	19
	Atum	3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Outros	8	1	13	0	0	0	0	0	0	1	13
	Subtotal	100	14	14	0	0	0	0	2	2	16	16
Leiteria	vaca	3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Cabra	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Leite	3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Subtotal	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Produzir	Vegetal	12	1	8	0	0	0	0	0	0	1	8
	Fruta	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Erva	3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Subtotal	16	1	6	0	0	0	0	0	0	1	6
Total		216	31	14	1	0,50% de	0	0	2	0,90% de	34	16

Tabela 3: prevalência de diferentes toxinotipos de C. perfringens em 216 amostras de alimentos. Um exemplo dos resultados obtidos ao usar este método para testar o alimento de varejo para C. perfringens. Esta tabela foi modificada do manuscrito publicado anteriormente, Regan et al.¹⁶.

Discussão

Aqui nós descrevemos um método para identificar a predominância de C. perfringens em amostras do alimento de varejo com repicagem limitado e sem uso de um sistema anaeróbio da câmara. Este método utiliza uma combinação de técnicas para aumentar a identificação de C. perfringens a partir de amostras de alimentos. Usando uma versão modificada da mídia RPM, permitimos o crescimento seletivo de C. perfringens. Ao imprensar o RPM inoculado entre as camadas de agar TSC, somos capazes de identificar e isolar bactérias anaeróbicas, redutoras de sulfito, características de C. perfringens. Para confirmar a presença de C. perfringens, as colônias de redução de sulfito são subcultivadas em RPM fresco. A versão modificada ou RPM permite-nos extrair facilmente o DNA das culturas, permitindo a confirmação do PCR de genes específicos da toxina. A confirmação de C. perfringens contaminou amostras de alimento pode ser conseguida dentro de três dias.

Em experimentos precoces, amostras de alimentos foram simplesmente inoculadas em RPM e DNA extraído de culturas ON. Este método resultou na detecção de C. perfringens em um número limitado de amostras (dados não mostrados). Embora o RPM seja seletivo para o crescimento de c. perfringens , não é exclusivo para o crescimento de c. perfringens . Outros, gram-positivos, D-cycolserine bactérias resistentes ainda pode crescer em RPM. Nós supor que a contaminação por outras espécies bacterianas pode ter diminuído nossa deteção de tensões de C. perfringens diminuindo a sensibilidade de nossa análise do PCR em nossa primeira cultura do RPM. Um passo crítico no aumento da detecção de C. perfringens foi a inclusão da técnica de "sanduíche" de agar TSC. Isso nos permitiu diferenciar e selecionar para colônias anaeróbicas, de redução de sulfito, características de C. perfringens. Uma etapa chave neste processo é assegurar-se de que a camada superior de agar derretido de TSC esteja em 40 ° c. Embora algumas cepas de C. perfringens possam crescer a temperaturas elevadas (46 – 48 ° c)^{15,16, a}adição de agar derretido a temperaturas elevadas reduz consideravelmente a quantidade de culturas recuperadas, provavelmente devido à morte celular .

Existem várias limitações potenciais para este método. Como mencionado anteriormente, nem a RPM nem o agar TSC selecionam ou diferenciam para C. perfringens exclusivamente, permitindo o crescimento de outras espécies bacterianas presentes em amostras de alimentos. Isto pode reduzir a sensibilidade do ensaio para seleccionar apenas C. perfringens . No entanto, esta é uma limitação comum em quase todas as técnicas de cultivo. A confirmação de genotipagem de isolados purificados é o melhor método para identificar definitivamente C. perfringens e outras espécies bacterianas. Outra limitação deste estudo é que não testamos os isolados purificados. Nós propositadamente fizemos isso para limitar a quantidade de subculturação, como a subculturação repetida é temida a resultar em perda de plasmídeo. Porque nós não isolamos à pureza, é possível que os toxinotypes múltiplos de C. perfringens possam estar atuais na mesma amostra ou Subculture. Se os pesquisadores desejam obter isolados purificados, métodos de purificação padrão podem ser usados na última cultura de RPM descrita neste método; Isso normalmente requer o uso de câmaras anaeróbias. Embora originalmente usado para isolar c. perfringens de alimentos, este método pode ser usado para identificar e isolar c. perfringens de uma infinidade de fontes. Especificamente, uma tal aplicação deste método é testar amostras fecais dos seres humanos (ou dos animais) que são suspeitados para ser contaminados com C. perfringens e toxinotype as bactérias para compreender melhor a fonte de infecção.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Cycloserine	Sigma-Aldrich	C6880
Dextrose	Sigma Life Science	D9434-250G
Disposable Transfer Pipets	any brand		Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69504	Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.
Dry Incubator	any brand
Fluid thioglycolate medium	Remel	R453452
Gelatin from porcine skin	Sigma Life Science	G1890-500G
Individual Primers	Invitrogen
Iron (II) sulfate heptahydrate	Sigma Life Science	F8633-250 G
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	L6876	Needed for DNA extraction, not provided in kit
microcentrifuge tube	any brand
parafilm or plastic wrap	any brand
Peptone from casein and other animal proteins	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP)	Oxoid	CM0587	Make TSC agar according to instructions
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-7653
Sterile Cell Scraper	any brand
Sterile cell Spreader	any brand
Sterile petri dishes	any brand
Supplies and equipment for gel electrophoresis	any brand
table top centrifuge	any brand
Taq PCR Master Mix Kit	Qiagen	201443
Thermocycler for PCR reaction	any brand
water bath	any brand
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161-100G