使用由内皮结肠形成细胞和间质干细胞形成的共培养球体的三维血管生成测定系统

摘要

三维共培养球形血管生成测定系统设计用于模拟生理血管生成。共培养球体由两个人类血管细胞前体ECFC和MSCs组成，并嵌入胶原蛋白凝胶中。新系统对血管生成调节器的评估是有效的，为体内研究提供了更多的相关信息。

摘要

在过去的几十年中，血管生成领域的研究一直在积极增长，人们认识到血管生成是50多种病理疾病的标志，如风湿性关节炎、神经病、心血管疾病，和肿瘤转移。在血管生成药物开发过程中，使用具有适当细胞类型和适当条件的体外测定系统以反映生理血管生成过程至关重要。为了克服目前主要使用内皮细胞的体外血管生成测定系统的局限性，我们开发了一种三维（3D）共培养球体发芽测定系统。共培养球体由两个人类血管细胞前体，内皮菌群形成细胞（ECFCs）和间质干细胞（MSCs）产生，比例为5比1。ECFCs_MSCs球体被嵌入到I型胶原蛋白基质中，以模拟体内细胞外环境。利用实时细胞记录仪连续观察24小时从球体发散血管生成过程，还应用了活细胞荧光标记技术，用于在发芽形成过程中处理每种细胞类型的定位。血管生成电位通过计算芽的数量和测量从单个球体产生的芽的累积长度来量化。每个实验组对五个随机选择的球体进行了分析。比较实验表明，与仅E氟氯化碳的球体相比，ECFCs_MSCs球体具有更大的发芽数和累积发芽长度。Bevacizumab，一种FDA批准的血管生成抑制剂，与新开发的共培养球形检测系统进行了测试，以验证其筛选抗血管生成药物的潜力。与仅ECFCs球体相比，ECFCs_MSCs球体的IC₅₀值更接近于从异种移植肿瘤小鼠模型获得的bevacizumab的有效血浆浓度。本研究表明，3D ECFCs_MSCs球形血管生成测定系统与生理血管生成有关，可在动物实验前预测有效的血浆浓度。

引言

全世界约有5亿人有望受益于血管畸形相关疾病的血管生成调节疗法，如风湿性关节炎、神经病、心血管疾病和肿瘤^转移1。因此，控制血管生成的药物的开发已成为制药业的一个重要研究领域。在药物开发过程中，有必要在体内进行动物研究，以探讨候选药物对生理机能和器官间系统相互作用的影响。然而，伦理和成本问题增加了对^{动物实验2}的关注。因此，需要改进体外测定系统，以获得更准确和可预测的数据，从而在动物实验前做出更好的决策。目前的体外血管生成测定通常测量在二维（2D）培养^板3中播种的内皮细胞（ECs）的增殖、入侵、迁移或管状结构形成。这些2D血管生成测定快速、简单、定量、经济高效，为发现血管生成调节药物做出了重大贡献。然而，仍有若干问题有待改进。

这种2D体外检测系统不能反映在体内生理条件下发生的血管生成的复杂多步骤事件，导致不准确的结果，导致体外测定数据与临床试验^结果4之间的差异。2D培养条件也诱发细胞表型的变化。例如，在二维培养板中增殖后，EC 具有弱细胞表型，表现为 CD34 表达减少和控制细胞响应^5、6的几个信号。为了克服基于2D培养的血管生成测定系统的局限性，开发了三维（3D）球形血管生成测定系统。发芽后，由EC形成的球体形成管状结构，反映了体内新血管化^{过程7、8。}因此，3D球形血管生成测定被认为是一种有效的检测系统，用于筛选潜在的亲或抗血管生成药物。

大多数 3D 球形血管生成测定仅利用 EC，主要是人类脐带静脉内皮细胞 （HUVECs） 或人类皮下微血管内皮细胞 （HDMECs）， 专注于血管生成期间 EC 的细胞反应。然而，血毛细血管由两种细胞类型组成:EC和围细胞。阐述EC和围细胞之间的双向相互作用对于正确的血管完整性和功能至关重要。几种疾病，如遗传性中风，糖尿病视网膜病变，和静脉畸形，都与改变的围观密度或减少的内皮依不舍的附着性附件9^相关。围卵体也被称为血管生成过程的关键元素。由EC招募围冰船以稳定新形成的船舶结构。在这方面，单培养球形血管生成测定不包括围^{细胞7，10。}因此，由EC和围细胞形成的共培养球体可能为更密切地模拟生理血管生成事件提供有价值的方法。

本研究旨在开发一种3D共培养球形血管生成测定，结合人类内皮菌群形成细胞（ECFCs）和中位体干细胞（MSCs），以更密切地反映体内血管生成。共培养球体系统作为正常血管的体外表示组装，由Korff等人于2001年建立。他们将HUVECs和人类脐带动脉平滑肌细胞（HUSMC）结合，并证明两个成熟血管细胞的共同培养降低了发芽潜力。众所周知，成熟的ECs（HUVECs）会逐渐失去增殖和分化的能力，这对其血管生成^{反应12、13}产生负面影响。成熟的血管细胞（HUSMC）可以通过废除血管内皮生长因子（VEGF）反应^能力11导致内皮细胞失活。Korff 和我们的共培养球形系统的主要区别是所使用的细胞类型。我们应用了两种血管前体，ECFC和MSCs，以建立一个适当的血管生成测定系统，以筛选和调查亲或抗血管原药。氟氯烃是氟氯化碳的前身。与^{成熟的EC14}相比，氟氯烃具有强大的扩散能力，能够克服EC的限制。在产后病理生理条件下，氟氯烃有助于新血管^的形成。MSCs是多能干细胞，具有分化成围细胞的能力，从而有助于血管^{生成18，19。}

在以前的报告中，ECFCs和MSCs对体外管^形成20、体内新血管^化21、22以及缺血^{组织23、24}的改善再灌注表现出协同效应。在本研究中，ECFC和MSCs被用来形成共培养球体，并嵌入I型胶原凝胶中，以反映体内的3D环境。胶原蛋白被认为是^围绕ECs25的细胞外基质（ECM）的主要成分。ECM在调节细胞^行为26中起着关键作用。这里提出的测定方案可以使用通用实验室技术在两天内轻松快速地执行。为了在发芽过程中进行有效的细胞跟踪，可以使用实时细胞记录器对每种细胞类型进行荧光标记和监测。新建立的3D共培养球形血管生成测定系统旨在提高评估潜在血管生成调节器的灵敏度，并在体内研究之前提供可预测的信息。

研究方案

人类氟氯烃与人类外周血分离，^如27日的报告所述。简单地说，单核细胞层使用Ficoll-Paque Plus从整个血液中分离出来，并在适当的培养基培养，直到内皮状菌落出现。收集菌落，并使用CD31涂层磁珠分离ECFC。MSCs从人类成人骨髓的粘附单核细胞（MNC）部分中分离出来。研究协议获得杜松女子大学机构审查委员会（IRB No. 2017-002-01）的批准。

1. 细胞培养

1. 制备氟氯烃和MSC介质和涂层板
   1. 制备内皮细胞生长培养基MV2（ECGM-MV2，氢皮质酮除外），辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%谷氨酰胺-青霉素-链霉素（GPS）。
   2. 制备含有10%FBS和1%GPS的中位干细胞生长介质-2（MSCGM-2）。
   3. 对于ECFC培养，用1%明胶溶液涂覆细胞培养板。要制备 1% 明胶溶液，使用磁性搅拌器将 1 g 凝胶粉末溶解在 500 mL 的 PBS 中，然后用高压灭菌器消毒。板可以涂上 3 mL/60 mm、5 mL/100 mm 或 15 mL/150 mm 的 1% 明胶溶液。在细胞培养箱（37°C和5%CO_2）中孵育15分钟的孵化板。之后，通过吸入去除剩余的1%明胶溶液，用PBS清洗一次涂层板。
2. 不断发展的氟氯烃和MSC
   1. 种子 1 x 10⁶ EFC 在 1% 明胶涂层 150 mm 板，并在细胞培养箱 （37°C 和 5% CO_2）中使用 ECGM-MV2 （10% FBS， 1% GPS） 生长到 80-90% 汇合。在通道号 7-10 处使用 EFC 以获得一致的结果。
   2. 种子 1 x 10⁶ MSCs 在非涂层 150 mm 板上，并在细胞培养箱（37°C 和 5% CO_2）中使用 MSCGM-2 生长到 80-90% 汇合。使用通道号 7-10 处的 MSC 获得一致的结果。

2. 制备1.2%（带甲基纤维素溶液）

1. 在 500 mL 玻璃瓶中测量 6 g 甲基纤维素，并在高压灭菌器中消毒。
2. 在 60°C 加热 ECGM-MV2（不含 FBS 和 GPS）20 分钟，并加入 250 mL 的加热 ECGM-MV2 以灭菌甲基纤维素粉末。要保持无菌条件，在流量罩内执行该过程。
3. 加入消毒的磁搅拌棒，在磁搅拌器上混合溶液20分钟，直到甲基纤维素彻底润湿，均匀分散，没有肿块。在无菌条件下加入 250 mL 的冷 （4 °C） ECGM-MV2（不含 FBS 和 GPS），并在磁力搅拌器上再混合 10 分钟。然后，在冰箱（4°C）中冷却溶液过夜。
   注:甲基纤维素是一种碳水化合物聚合物，由于肿胀和随后的水化，在低温下溶解良好。
4. 第二天，在50 mL管中对溶液进行等分，在5000 x g下将溶液在4°C下3小时。取清粘性上清溶液，储存在4°C，直到使用长达3-6个月。
   注:沉积物可能含有残留的纤维素纤维，因此轻轻服用上清溶液，留下至少5 mL的体积。这个体积可以根据实验条件进行调整。

3. 仅产生和嵌入仅氟氯烃、仅限MSC和ECFC-MSCs的球形

第1天

1. 制备氟氯烃和MSC电池悬浮液
   1. 通过添加不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和吸气液，清洗80-90%的汇入EFC和MSC。
   2. 为了从培养板分离ECFC和MSCs，分别在细胞培养箱（37°C和5%CO_2）中孵育它们，分别在细胞培养箱中孵化3分钟和5分钟。
   3. 通过添加包含 10% FBS 和 1% GPS 的 DMEM 介质来激活胰蛋白酶。上下移移细胞，形成单个细胞悬浮液。
   4. 在RT处，在282 x g下离心5分钟，使细胞沉淀。
   5. 取出上清液，并在相应介质中重新挂起细胞。
2. 用荧光染料标记氟氯烃和MSC
   注:按照制造商的说明，使用 PKH67（绿色）和带 PKH26（红色）荧光染料的 MSC 执行 ECFC 的细胞膜标签，并稍作修改，如下所示。
   1. 用无血清培养基清洗细胞两次，以去除FBS。
      注:FBS 中的蛋白质和脂质通过结合降低标记细胞的有效染料浓度。
   2. 在显微镜下使用流量计对ECFC和MSC进行计数，并将3 x 10⁶ EFC和2 x 10⁶ MSCs转移到2 mL显微管中。
      注:这些是用染料标记细胞的最佳细胞密度。使用大量细胞会导致不良和异质染色，而使用太少的细胞会产生较差的细胞恢复。
   3. 在RT处将管在100 x g下离心5分钟，以获得细胞颗粒。小心吸出上清液，留下不超过15-25 μL的残余体积。
   4. 从染料试剂盒中重新悬浮250μL的稀释剂C中的ECFC和MSCs。轻轻移移电池悬架，以确保完全分散。
      注:稀释C是一种生理性盐，通过形成云母降低染料的染色效率。因此，不要让细胞长期处于稀释C中，并且不要涡旋管。
   5. 通过加入5μL的PKH67至250μL的稀释剂C（最终浓度为20μM），为MSC制备ECFC染色溶液，并通过添加3μL的PKH26至250μL的稀释剂C（最终浓度为12μM）。
      注:最终染料浓度与制造商的建议不同。高浓度会导致细胞结块和细胞毒性。低浓度不足以染色。
   6. 将250μL的ECFCs细胞悬浮液加入250μL的PKH67染料溶液中，将250μL的MSC添加到250μL的PKH26染料溶液中。立即将细胞与染料混合，在室温下上下移液，孵育5分钟。为了获得更好的效果，用铝箔盖住管子，放在摇床上，以确保在染色过程中充分混合。
   7. 在染色细胞悬浮液中加入0.5 mS的FBS，然后孵育1分钟，使FBS结合多余的未结合染料，从而停止染色过程。通过在100 x g下离心将染色细胞沉淀5分钟。
      注:EFC 和 MSC 颗粒在染色后分别为浅黄色和粉红色。
   8. 小心地去除上清液，用完整的介质清洗细胞两次，以去除多余的染料。将管在100 x g下离心5分钟，并在每个完整介质的2 mL中重新悬浮颗粒。
3. 生成 ECFC、MSC 或 ECFC_MSC 球体
   注:应用悬挂滴技术来生成球形，如前^所述28。下面给出了制备球体的步骤。
   1. 计算染色的氟氯烃和MSC。
   2. 在含有20%甲基纤维素溶液和5%FBS的ECGM-MV2中暂停染色的ECFC、MSCs或ECC_MSC。在4 x10⁴细胞/mL的细胞密度下制备，用于ECFC或MSCs（25 μL的细胞悬浮液包含1，000个细胞）。对于ECFC和MSCs的两个细胞悬浮液，在2 x 10⁴细胞/mL EFC和0.4 x 10⁴细胞/mL MSCs（25 μL包含500个氟氯化碳和100个MSCs）的细胞密度下制备。
      注:氟氯烃与MSC的比例不应超过5:1。大量的MSC可能导致过度迁移和不规则的发芽形态。数量较少的MSC可能导致细胞之间的相互作用不良，产生不良的发芽。
   3. 将 15 mL 的 PBS 添加到 150 mm 培养板的底部，准备水化装置。
   4. 将电池悬架转移到灭菌的聚苯乙烯矩形储液罐中，以便使用多通道移液器。通过移液均匀地分散细胞悬浮液。
   5. 使用多通道移液器将 25 μL 电池悬架滴沉积到 150 mm 培养板的盖上（150 mm 板的大约 100 滴/盖）。将盖子倒置在PBS填充的补水单元上，在细胞培养箱中孵育24小时。
      注:甲基纤维素溶液为悬浮液提供了适当的粘度。当在没有甲基纤维素溶液的情况下执行悬垂滴法时，当盖倒置时，滴落很容易滑落（补充图1）。此外，在一夜孵育后，没有甲基纤维素溶液，球体不能完美形成。结果表明，甲基纤维素溶液的粘度是形成球体圆形所必需的。

第2天

4. 在中和胶原蛋白凝胶中嵌入球体
   1. 水浴（37 °C）中加热FBS和ECGM-MV2（不含FBS和GPS）。将冷甲基纤维素溶液放在工作台上，使其温度升高。
   2. 在细胞培养箱（37°C）中放置一个24孔板进行加热。
   3. 切割尖 1 mL 移液器尖端 3-5 mm 吸气球体和粘性悬浮液，如甲基纤维素溶液和 I 型胶原蛋白，舒适而准确。
   4. 按照I型胶原蛋白凝胶制造商的指示，在冰上制备3mg/mL中和I型胶原蛋白凝胶。
      注:应在冰上进行中和，以避免在室温下胶原蛋白凝胶化。对于24孔板的一口井，需要500μL的中和胶原蛋白。始终准备 1 mL 额外的胶原蛋白体积。如果保存在冰上，胶原蛋白凝胶在中和后可长达2-3小时使用。
   5. 通过用 5 mL 的 PBS 对包含球体的球体进行剥毛，收获球体。在 50 mL 锥形管中收集球体悬浮溶液。用 5 mL 的 PBS 重新冲洗盖，以获得剩余的球形。
      注:收获期间，密切观察确认球体的存在。为了进行更多的目视检查，在滑动玻璃上转移约50-100 μL的球体悬浮溶液，并在显微镜下检查球体的圆形。
   6. 在282 x g下离心将球体沉淀5分钟，小心地丢弃上清液，而不会干扰球体留下的不超过100-200 μL的残余体积。
   7. 轻轻敲击管壁，使球体自由悬浮在剩余的 100-200 μL 残留溶液中。
   8. 在含球体的管中加入含有5%FBS和40%甲基纤维素溶液的ECGM-MV2。添加的体积根据大约 100 个球体/mL 确定。用钝的 1 mL 移液器尖端移液，轻轻混合球形悬浮液。
      注:甲基纤维素溶液被广泛用作不允许球体沉积的悬浮剂。FBS浓度应为5%。FBS浓度越高，由于生长因子过大，导致异常发芽。较低的FBS浓度不能维持细胞的健康条件。
   9. 在冰上以1:1的比例混合球体悬浮液和中和I型胶原蛋白凝胶（3mg/mL）。使用钝 1 mL 移液器尖端，以避免球形断裂。
      注:24孔板的一口孔需要1mL的球体悬浮胶原凝胶溶液。如果可能，制作额外的混合悬架溶液。
   10. 如果需要测试任何制剂或化学物的血管生成特性，在 1 mL 微管中转移 1 mheroid 悬浮胶原胶胶胶胶凝胶溶液，然后与钝的 1mL 移液器尖端温和混合。
       注:剂和化学物的体积可加到200 mL，将I型胶原蛋白凝胶浓度从1.5mg/mL稀释至1.25mg/mL，但不影响I型胶原蛋白凝胶聚合。将相同体积的车辆添加到控制球体。
   11. 通过移液将球体悬浮胶原蛋白凝胶溶液加入预加热的24孔板（0.9 mL/孔）的孔中，然后在细胞培养箱中孵育30分钟，用于聚合。
       注:在球形嵌入过程中，请勿通过搅动板来干扰凝胶。
   12. 加入含有2.5%FBS的ECGM-MV2含有2.5%的FBS，不含VEGF，覆盖球体悬浮胶原蛋白凝胶。对于仅ECFC的球体，用外源添加VEGF（最终浓度为50纳克/mL）刺激细胞形成适当的芽。ECFC_MSC球体不需要任何生长因子的外源刺激。
   13. 将板放在安装在细胞培养箱（37°C和5%CO2）的实时细胞记录器中，并随机聚焦在5-10球体（10倍物镜）。监测每个荧光标记球体的发芽形成，每 1 小时 24 小时，没有任何干扰。

4. 定量球状芽

1. 将图像文件导入 ImageJ 软件，以量化芽的数量并测量每个芽的长度。对于共培养球体，在制作球体之前，用绿色荧光染料标记ECFCs。然后，测量沾有绿色荧光的芽的数量和长度（补充图2）。每个实验组对五个随机选择的球体进行了量化。
   注:喷出物是由多个从球体延伸的ECFC形成的协作延伸结构。芽芽长度测量为从球体表面到芽尖的芽源点的长度。
2. 表示值作为至少三个独立实验的平均值 = SEM。通过单向 ANOVA 确定统计显著性差异，以便进行多个比较或学生对对比较的t-test测试。
   注:P= 0.05 被认为具有统计显著性。

结果

比较实验使用单培养球体（仅限氟氯烃）和共培养球体（ECFCs_MSCs）进行，以检查MSC在氟氯化碳介导的血管生成中是否发挥相当大的作用。实时细胞记录器监测了每个球体的发芽形成24小时，可以捕获从球体中产生血管生成的过程。血管生成电位通过计算芽的数量和测量从单个球体产生的芽的累积长度来量化。对每个实验组随机选择的5个球体进行了分析。对于ECFCs_MSCs球体，发芽数量和累积发芽长?...

讨论

本研究采用一种利用两个人类血管细胞祖体、ECFC和MSCs共同培养球体的体外血管生成测定系统改进，共培养球体系统可以模拟体内血管芽的形成，即通过内皮细胞和围细胞之间的相互作用和结合来完成。与其他仅反映ECs介导血管生成的其他体外血管生成测定相比，这种共培养性检测系统更代表生理血管生成多步级联，包括细胞相互作用、发芽、管形成、和船舶成熟。这种新建立的测定系统也类似?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05 % Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
Bevacizumab	Roche	NA	Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium	Gibco	11885-084	DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X)	Gibco	21600-010	PBS (10X)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X)	Corning	21-031-CVR	PBS (1X)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit	Promocell	C-22121	ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas	FP-0500A	FBS
Gelatin	BD Sciences	214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin	Gibco	10378-016	GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2	Promocell	C-28009	MSCGM-2
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI67	PKH67
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Type I collagen gel	Corning	354236
Vascular endothelial growth factor A	R&D	293-VE-010	VEGF