Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.

Özet

Anjiyogenez alanındaki çalışmalar, anjiyogenezin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar gibi 50'den fazla farklı patolojik hastalığın bir özelliği olduğunun kabulüyle son birkaç on yılda agresif bir şekilde büyümektedir. ve tümör metastazı. Anjiyogenez ilaç gelişimi sırasında, fizyolojik anjiyogenez sürecini yansıtmak için uygun hücre tipleri ve uygun koşullara sahip in vitro dosay sistemleri kullanmak çok önemlidir. Mevcut in vitro anjiyogenez istinat sistemlerinin esas olarak endotel hücreleri kullanılarak sınırlandırılmasını aşmak için 3 boyutlu (3D) eş kültür spheroid filizlenme saji sistemi geliştirdik. Co-kültür spheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, endotel kolonioluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücreler (MsCs) 5-1 oranı ile üretildi. ECFCs +MSCs spheroids in vivo ekstrasellüler ortamı taklit etmek için tip I kollajen matris içine gömülü idi. 24 saat boyunca küresel leşmişlerden anjiyojenik filizlenmenin ilerlemesini sürekli olarak gözlemlemek için gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılmıştır. Anjiyojenik potansiyel, filiz sayısı nın sayılarak ve bireysel küresel lerden üretilen filizlerin kümülatif uzunluğunun ölçülmesiyle ölçüldü. Deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel analiz yapıldı. Karşılaştırma deneyleri, ECFCs+MSCs spheroidlerinin ecfcs'e özgü küresel lere göre daha fazla filiz sayısı ve kümülatif filiz uzunluğu gösterdiğini göstermiştir. Bevacizumab, BIR FDA onaylı anjiyogenez inhibitörü, anti-anjiyojenik ilaçlar tarama potansiyelini doğrulamak için yeni geliştirilen co-kültür küresel test sistemi ile test edildi. ECFCs+MSCs sferoidler için IC50 değeri, ecfcs'e özel küresel sferoidlere göre ksenogreft tümör fare modelinden elde edilen bevacizumab'ın etkili plazma konsantrasyonuna daha yakındı. Bu çalışma, 3D ECFCs+MSCs sferoid anjiyogenez tsay sisteminin fizyolojik anjiyogenez ile ilgili olduğunu ve hayvan deneyleri öncesinde etkili bir plazma konsantrasyonunu öngörebildiği düşündürmektedir.

Giriş

Dünya çapında yaklaşık 500 milyon kişinin romatoid artrit, okülopati, kardiyovasküler hastalıklar ve tümör metastazı gibi vasküler malformasyonla ilişkili hastalıklar için anjiyogenez modüle edici tedaviden yararlanmasıbeklenmektedir. Böylece, anjiyogenezi kontrol eden ilaçların gelişimi ilaç endüstrisinde önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. İlaç geliştirme sürecinde, in vivo hayvan çalışması, ilaç adaylarının organlar arasındaki fizyolojik fonksiyonlar ve sistemik etkileşimler üzerindeki etkilerini araştırmak için gereklidir. Ancak, etik ve maliyet sorunları hayvan deneyleri ile ilgili endişeleri artmıştır2. Bu nedenle, hayvan deneyleri öncesinde daha iyi karar verme için daha doğru ve öngörülebilir veri elde etmek için geliştirilmiş in vitro araştırma sistemleri gereklidir. Mevcut in vitro anjiyogenez tahlilleri genellikle iki boyutlu (2D) kültür plakaları3tohumlu endotel hücrelerinin (ECs) çoğalma, invazyon, göç veya tübüler yapı oluşumunu ölçmek . Bu 2D anjiyogenez tahlilleri hızlı, basit, kantitatif ve uygun maliyetlidir ve anjiyogenez modüle edici ilaçların keşfine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Ancak, bazı sorunlar geliştirilmeye devam etmektedir.

Bu tür 2D in vitro tahnit sistemleri in vivo fizyolojik koşullarda meydana gelen anjiyogenezin karmaşık çok aşamalı olaylarını yansıtamaz, bu da in vitro tahssonucu verileri ile klinik deney sonuçları arasında tutarsızlıklara neden olan yanlış sonuçlara yol açar4. 2B kültür koşulları da hücresel fenotiplerin değişimine neden olur. Örneğin, 2B kültür plakalarında çoğalma sonra, ECs CD34 azaltılmış ifade ve hücresel yanıtları yöneten çeşitli sinyaller ile tezahür zayıf bir hücresel fenotip var5,6. 2D kültür tabanlı anjiyogenez test sistemlerinin sınırlamalarını aşmak için üç boyutlu (3D) spheroid anjiyogenez test sistemleri geliştirilmiştir. EC'lerin oluşturduğu küresel yapı oluşumunu takip eden filizlenme, vivo neo-vaskülarizasyon süreçlerini yansıtır7,8. Böylece, 3D spheroid anjiyogenez tsay potansiyel pro- veya anti-anjiyogenez ilaçları tarama için etkili bir kontrol sistemi olarak kabul edilmiştir.

En 3D spheroid anjiyogenez tahlilleri sadece ECs kullanmak, özellikle insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs) veya insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs) anjiyogenez sırasında ECs hücresel yanıt odaklanmak için. Ancak, kan kılcal damarları iki hücre tipioluşur: ECs ve perisitler. EC'ler ve perisitler arasındaki çift yönlü etkileşimin ayrıntılı olarak detaylandırılması uygun vasküler bütünlük ve fonksiyon için çok önemlidir. Kalıtsal inme, diyabetik retinopati ve venöz malformasyon gibi çeşitli hastalıklar, değişmiş perisit yoğunluğu veya endotel 9 perisit eki azalmış ileilişkilidir. Perisitler de anjiyojenik sürecin önemli bir unsuru olarak bilinir. Perisitler ECs tarafından yeni oluşan damar yapıları stabilize etmek için işe alınır. Bu bağlamda, mono-kültür sheroid anjiyogenez tsay perisit7dahil değildir,10. Bu nedenle, EC'ler ve perisitler tarafından oluşturulan eş-kültür spheroids daha yakından fizyolojik anjiyojenik olayları taklit değerli bir yaklaşım sağlayabilir.

Bu çalışmada, insan endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFCs) ve mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) bir kombinasyonu ile 3Boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez analizi nin vivo anjiyogenezi daha yakından yansıtması amaçlandı. Normal bir kan damarının in vitro temsil montaj olarak Co-kültür küresel sistem ilk Korff ve ark. tarafından 200111yılında kurulmuştur. Onlar HUVECs ve insan göbek arter düz kas hücreleri (HUSMCs) kombine ve iki olgun vasküler hücrelerin co-kültür filizlenme potansiyelini azalttığını gösterdi. Olgun ECs (HUVECs) giderek çoğalmak ve ayırt etmek için yeteneklerini kaybetmek bilinmektedir, hangi olumsuz onların anjiyogenez yanıtları etkiler12,13. Olgun perivasküler hücreler (HUSMCs) vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) duyarlılık11abrogation yoluyla endotel hücre inaktivasyonuna neden olabilir. Korff'un ve ortak kültür küresel sistemimiz arasındaki temel fark kullanılan hücre tipleridir. Pro-veya anti-anti-anjiogenik ajanları taramak ve araştırmak için uygun bir anjiyogenez testi sistemi kurmak için iki vasküler öncül, ECFC ve MsC uyguladık. ECFC'ler, EC'lerin öncüsütür. ECFC'ler, AC'lerin sınırlamasının üstesinden gelmeyi sağlayan olgun EC14ile karşılaştırıldığında sağlam çoğalma kapasitesine sahiptir. ECFCs birçok doğum sonrası patofizyolojik koşullarda yeni damar oluşumuna katkıda15,16,17. MSC'ler perisitlere ayırma kapasitesine sahip pluripotent kök hücrelerdir, bu nedenle anjiyogenez18,19.

Önceki raporlarda, ECFCs ve MSCs in vitro tüp oluşumu üzerinde sinerjik etkileri gösterdi20, in vivo neo-vaskülarizasyon21,22, ve iskemik dokuların geliştirilmiş reperfüzyon23,24. Bu çalışmada, ECFCs ve MSCs co-kültür spheroids oluşturmak için kullanılan ve in vivo 3D ortamı yansıtmak için tip I kollajen jel gömülü. Kollajen, ECs25'içevreleyen hücre dışı matriks (ECM) önemli bileşenleri nden biri olarak kabul edilir. ECM hücre davranışı26düzenleyen kritik bir rol oynar. Burada önerilen test protokolü, ortak laboratuvar teknikleri kullanılarak iki gün içinde kolayca ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Filizlenme işlemi sırasında etkili hücre takibi için, her hücre türü floresan olarak etiketlenebilir ve gerçek zamanlı hücre kaydedici kullanılarak izlenebilir. Yeni kurulan 3D eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi potansiyel anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde duyarlılığı artırmak ve in vivo çalışma öncesinde öngörülebilir bilgi sağlamak için tasarlanmıştır.

Protokol

İnsan ECFC'leri bir önceki raporda açıklandığı gibi insan periferik kan izole edildi27. Kısaca, mononükleer hücre tabakası Ficoll-Paque Plus kullanılarak tüm kandan ayrıldı ve endotel benzeri koloniler ortaya çıkana kadar uygun ortamda kültürlendi. Koloniler toplandı ve ECFC'ler CD31 kaplı manyetik boncuklar kullanılarak izole edildi. MSC'ler insan yetişkin kemik iliğinin yapışık mononükleer hücre (MNC) fraksiyonundan izole edildi. Çalışma protokolü Duksung Kadın Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (IRB No. 2017-002-01).

1. Hücre Kültürü

  1. ECFC'lerin ve MSC'lerin orta ve kat plakalarının hazırlanması
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 glutamin-penisilin-streptomisin (GPS) ile desteklenen endotel hücre büyüme ortamı MV2 (ECGM-MV2, hidrokortizon hariç) hazırlayın.
    2. % 10 FBS ve% 1 GPS içeren mezenkimal kök hücre büyüme orta-2 (MSCGM-2) hazırlayın.
    3. ECFC kültürü için hücre kültür plakalarını %1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. %1 jelatin çözeltisi hazırlamak için, 500 mL PBS'de 1 g jelleşme tozunu manyetik karıştırıcı ile eritin ve otoklavla sterilize edin. Plakalar 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm veya 15 mL/150 mm%1 jelatin çözeltisi ile kaplanabilir. Hücre kültürü kuluçka makinesinde 15 dakika (37 °C ve %5 CO2)kuluçka plakaları . Daha sonra, aspirasyon ile kalan% 1 jelatin çözeltisi çıkarın ve PBS ile kaplı plakaları bir kez yıkayın.
  2. Büyüyen ECFC'ler ve MSC'ler
    1. %1 jelatin kaplı 150 mm plakaüzerinde tohum 1 x 106 ECFC' ler ve hücre kültürü kuluçka makinesinde (37°C ve %5 CO2)%80-90 biraraya kadar ECGM-MV2 (%10 FBS, %1 GPS) kullanarak büyür. Tutarlı sonuçlar elde etmek için 7-10 geçiş numaralarındaki ECFC'leri kullanın.
    2. 1 x 106 MSC'ler kaplamasız 150 mm plakaüzerinde ve hücre kültürü kuvözde (37°C ve %5 CO2)%80-90 birleşmede MSCGM-2 kullanılarak büyür. Tutarlı sonuçlar elde etmek için 7-10 geçiş numaralarında MSC'leri kullanın.

2. %1.2 w/v Metilselüloz Çözeltisinin Hazırlanması

  1. 500 mL cam şişede 6 g metil selüloz ölçün ve bir otoklavda sterilize edin.
  2. Isı ECGM-MV2 (FBS ve GPS olmadan) 60 °C için 20 dakika, ve sterilleştirilmiş metil selüloz tozu için ısıtmalı ECGM-MV2 250 mL ekleyin. Steril koşulları korumak için, akış kaputu içinde süreci yürütmek.
  3. Sterilize edilmiş bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve metil selüloz iyice ıslanana ve topaklar olmadan eşit olarak dağılana kadar 20 dk boyunca çözeltiyi manyetik karıştırıcıüzerinde karıştırın. Steril durumda 250 mL soğuk (4 °C) ECGM-MV2 (FBS ve GPS olmadan) ekleyin ve manyetik karıştırıcı üzerinde ek bir 10 dakika karıştırın. Daha sonra çözeltiyi bir gecede buzdolabında (4 °C) soğutun.
    NOT: Metilselüloz şişme ve sonraki hidrasyon nedeniyle serin sıcaklıklarda iyi çözünen bir karbonhidrat polimeridir.
  4. Ertesi gün çözeltiyi 50 mL'lik bir tüpve santrifüjde 5.000 x g'de 4 °C'de 3 saat pişirin. Açık viskoz süpernatant çözeltisini alın ve 3-6 aya kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Tortu artık selüloz lif içerebilir, bu nedenle yavaşça hacmi en az 5 mL geride bırakarak supernatant çözeltisi almak. Bu hacim deneysel koşullara göre ayarlanabilir.

3. Yalnızca ECFC'lerin, yalnızca MSC'lerin ve ECFCs-MSCs Spheroidlerin Üretimi ve Katıştırma

1. Gün

  1. ECFC'lerin ve MSC'lerin hücre süspansiyonunun hazırlanması
    1. Kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek% 80-90 uyumlu ECFCs ve MSCs yıkayın ve aspire.
    2. ECFC'leri ve MSC'leri kültür plakasından ayırmak için, hücre kültürü kuluçka makinesinde (37°C ve %5 CO2),sırasıyla bir hücre kültürü kuluçka makinesinde %0,05 tripsin-EDTA ile kuluçkaya yatırın.
    3. %10 FBS ve %1 GPS içeren DMEM ortamı ekleyerek trypsin'i inaktive edin. Pipet hücreleri yukarı ve aşağı tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için.
    4. Hücreleri 282 x g'de 5 dk RT'de santrifüj ederek tortuleyin.
    5. Supernatant çıkarın ve ilgili ortamda hücreleri yeniden askıya.
  2. ECFC'leri ve MSC'leri floresan boyayla etiketleme
    NOT: PKH67 (yeşil) ve PKH26 (kırmızı) floresan boya ile ECFCs hücre zarı etiketleme gerçekleştirmek aşağıdaki gibi hafif değişiklikler ile üreticinin talimatları aşağıdaki gibi.
    1. FBS kaldırmak için serum serbest orta ile hücreleri iki kez yıkayın.
      NOT: FBS'deki proteinler ve lipidler hücreleri bağlayıcı olarak etiketlemek için etkili boya konsantrasyonu azaltır.
    2. Mikroskop altında hemositometre kullanarak ECFC'leri ve MSC'leri sayın ve 3 x 106 ECFC ve 2 x 106 MSC'yi 2 mL mikro tüplere aktarın.
      NOT: Bunlar, hücreleri boyalarla etiketlemek için en uygun hücre yoğunluklarıdır. Çok sayıda hücrenin kullanımı kötü ve heterojen boyamaya neden olurken, çok az hücre kullanımı zayıf hücre kurtarma sağlar.
    3. Bir hücre peletelde etmek için RT 5 dakika için 100 x g tüplersantrik. Supernatant'ı 15-25 μL'den fazla kalıntı hacmi bırakmadan dikkatlice aspire edin.
    4. Boya kitinden 250 μL'lik Diluent C'deki ECFC'leri ve MSC'leri yeniden askıya alın. Tam dağılmayı sağlamak için hücre süspansiyonuna yavaşça pipet olun.
      NOT: Dilüent C fizyolojik bir tuzdur ve misel oluşturarak boyaboyama verimliliğini azaltabilir. Bu nedenle, hücrelerin uzun süre dilüent C'de durmasına izin vermeyin ve tüpleri girdap etmeyin.
    5. 5 μL PKH67 ile 250 μL Dilüent C (20 μM son konsantrasyon) ve MSC'ler için 3 μL PKH26 ila 250 μL Diluent C (12 μM son konsantrasyon) ekleyerek boyama çözeltisini hazırlayın.
      NOT: Son boya konsantrasyonları üreticinin tavsiyelerinden farklıdır. Yüksek konsantrasyon hücre kümelenme ve hücre toksisitesi yol açacak. Düşük konsantrasyon boyama için yeterli olmaz.
    6. 250 μL PKH67 boya çözeltisine 250 μL ECFC hücre süspansiyonu ve 250 μL'lik PKH26 boya çözeltisine 250 μL'lik MSC ekleyin. Hemen yukarı ve aşağı boru ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka ile boyalar ile hücreleri karıştırın. Daha iyi sonuçlar için, alüminyum folyo ile tüp kapağı ve boyama sırasında yeterli karıştırma sağlamak için bir shaker üzerine yerleştirin.
    7. Lekeli hücre süspansiyonuna 0,5 mL FBS ekleyerek boyama işlemini durdurun ve fbs'nin fazla bağlanmamış boyayı bağlamasına izin vermek için 1 dakika kuluçkaya yatırın. 5 dk için 100 x g santrifüj tarafından lekeli hücreleri sediment.
      NOT: ECFC'ler ve MSC'ler peletleri, boyama dan sonra sırasıyla açık sarı ve pembedir.
    8. Dikkatle supernatant çıkarın ve aşırı boya kaldırmak için tam orta ile hücreleri iki kez yıkayın. Tüpleri 100 x g'de 5 dk santrifüj edin ve her tam ortamın 2 mL'sinde peleti yeniden askıya alın.
  3. ECFC, MSC veya ECFC+MSC küresel spheroidleri oluşturma
    NOT: Daha önce28açıklandığı gibi küresel oluşturmak için asma damla tekniğini uygulayın. Küresel lerin hazırlanması için gerekli adımlar aşağıda verilmiştir.
    1. Lekeli ECFC'leri ve MSC'leri sayın.
    2. %20 Metilselüloz çözeltisi ve %5 FBS içeren ECGM-MV2'deki lekeli ECFC'leri, MSC'leri veya ECFC+MsC'leri askıya alın. ECFC'ler veya MSC'ler için 4 x 104 hücre/mL hücre yoğunluğunda hazırlayın (hücre süspansiyonunun 25 μL'si 1.000 hücre içerir). ECFC'lerin ve MSC'lerin iki hücre süspansiyonu için, 2 x 104 hücre/mL ECFC ve 0,4 x 104 hücre/mL MSC(25°L 500 ECFC ve 100 MSC içerir) hücre yoğunluğunda hazırlayın.
      NOT: ECFC'lerin MSC'lere oranı 5:1'i geçmemelidir. Daha fazla sayıda MSC aşırı göç ve düzensiz filiz morfolojisine yol açabilir. Daha az sayıda MSC hücreler arasında kötü etkileşime neden olabilir, kötü filizlenme verim.
    3. 150 mm'lik bir kültür plakasının altına 15 mL PBS ekleyerek bir hidrasyon ünitesi hazırlayın.
    4. Çok kanallı pipet kullanımı için hücre süspansiyonunun sterilize edilmiş polistiren dikdörtgen haznesine aktarın. Borular oluşturarak hücreleri eşit olarak dağıtın.
    5. Çok kanallı pipet (150 mm plakanın yaklaşık 100 damla/kapağı) kullanılarak 150 mm'lik bir kültür plakasının kapağına 25°L hücre süspansiyonu yatırın. Kapağı PBS dolu bir hidrasyon ünitesinin üzerine ters çevirin ve hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Metilselüloz çözeltisi süspansiyon çözeltisine uygun bir viskozite sağlar. Asma bırakma yöntemi metilselüloz solüsyonu olmadan yapıldığında, kapak ters çevrildiğinde damlalar kolayca aşağı kaymıştır(Ek Şekil 1). Ayrıca, gece kuluçka sonra, spheroids mükemmel metilselüloz çözeltisi olmadan oluşmuş değildi. Bu sonuç, seheroidlerin yuvarlak şeklini oluşturmak için metilselüloz çözeltisi ile uygun viskozitenin gerekli olduğunu göstermektedir.

2. Gün

  1. Nötralize kollajen jel içinde spheroids gömme
    1. Sıcak FBS ve ECGM-MV2 (FBS ve GPS olmadan) bir su banyosu (37 °C). Oda sıcaklığına getirmek için bir çalışma tezgahına soğuk metilselüloz çözeltisi yerleştirin.
    2. Isınmak için hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C) 24 kuyulu bir tabak yerleştirin.
    3. Methylcellulose solüsyonu ve tip I kollajen gibi küresel ve viskoz süspansiyonları aspire etmek için sivri 1 mL pipet uçlarını 3-5 mm rahat ve doğru bir şekilde kesin.
    4. Hazırlamak 3 mg /mL nötralize tip I kollajen jel i kollajen jel üreticisinin talimatını izleyerek buz üzerinde.
      NOT: Kollajenin oda sıcaklığında jelleşmesini önlemek için buz üzerinde nötralizasyon yapılmalıdır. 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusu için 500 μL nötralize kollajen gereklidir. Her zaman 1 mL ekstra hacimli kollajen hazırlayın. Kollajen jel buz üzerinde tutulursa nötralizasyon dan sonra 2-3 saat kadar kullanılabilir.
    5. 5 mL PBS ile küreseloidiçeren kapağı durulayarak küreselleri hasat edin. 50 mL konik bir tüpte spheroid askıda çözeltitoplayın. Kalan küresel leri elde etmek için kapağı 5 mL PBS ile yeniden durulayın.
      NOT: Hasat sırasında, yakından küresel lerin varlığını doğrulamak için gözlemlemek. Daha fazla görsel inceleme için, slayt camı üzerinde yaklaşık 50-100 μL küresel askıda çözelti aktarın ve mikroskop altında küreseloidlerin yuvarlak şeklini kontrol edin.
    6. 5 dk. 282 x g'de santrifüj yaparak küreseloidleri tortulat.
    7. Tüp duvarına hafifçe dokunun, böylece küresel ler kalan 100-200 μL çözeltide serbestçe asılı kalır.
    8. Spheroid içeren tüpe %5 FBS ve %40 metilselüloz solüsyonu içeren ECGM-MV2 ekleyin. Eklenen hacim yaklaşık 100 küresel/mL esas alınılarak belirlenir. Küresel süspansiyonu 1 mL lik bir pipet ucuyla boruyla hafifçe karıştırın.
      NOT: Metilselüloz çözeltisi yaygın olarak spheroidlerin tortulanmasına izin vermeyen bir askıya alma maddesi olarak kullanılır. FBS konsantrasyonu %5 olmalıdır. Yüksek FBS konsantrasyonu aşırı büyüme faktörleri nedeniyle anormal filizlenme neden olur. Düşük FBS konsantrasyonu hücreler için sağlıklı koşulları koruyamaz.
    9. Mix sferoid-süspansiyon çözeltisi ve nötralize tip I kollajen jel (3 mg /mL) buz üzerinde 1:1 oranında. Küresel lerin kırılmasını önlemek için 1 mL lik künt pipet ucu kullanın.
      NOT: 24 kuyulu bir tabak kuyusu için spheroidlerin 1 mL'si kollajen jel çözeltisi gereklidir. Mümkünse ekstra bir karma süspansiyon çözümü yapın.
    10. Herhangi bir ajanın (lar) veya kimyasal(lar) anjiyojenik özelliklerinin test edilmesi gerekiyorsa, 1 mL mikro tüpte küresel askıda alan kollajen jel çözeltisinin 1 mL'sini aktarın ve ardından künt 1mL pipet ucuyla hafifçe karıştırmayı takip edin.
      NOT: Ajan ve kimyasal hacmi 200 mL'ye kadar çıkabilir, bu da tip I kollajen jel konsantrasyonunu 1,5 mg/mL'den 1,25 mg/mL'ye düşürür, ancak Tip I kollajen jel polimerizasyonunu etkilemez. Kontrol spheroids araç aynı hacimde ekleyin.
    11. Borulama ile önceden ısıtılmış 24 kuyulu bir plakanın (0,9 mL/kuyu) kuyularına küresel-askıya alan kollajen jel çözeltisini ekleyin ve polimerizasyon için hücre kültürü kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Spheroid katıştırma işlemi sırasında, plakaajlayarak jel rahatsız etmeyin.
    12. VEGF'li/vegf'siz %2,5 FBS içeren 100 μL ECGM-MV2 ekleyerek küresel askılı kollajen jelini kapatın. ECFC'ye özel küresel ler için, hücreleri eksojen ekolarak VEGF (50 ng/mL nihai konsantrasyonu) ile uyararak uygun filizler oluşturur. ECFC+MSC spheroidler herhangi bir büyüme faktörü tarafından eksojen stimülasyon gerektirmez.
    13. Plakayı hücre kültürü kuvöze (37 °C ve %5 CO2)yerleştirilen gerçek zamanlı bir hücre kaydedicisine yerleştirin ve rastgele 5-10 küresel (10 x objektif lens) üzerine odaklanın. Her floresan etiketli küresel spheroidlerin filizlenme oluşumunu herhangi bir rahatsızlık duymadan 24 saat boyunca her 1 saatte bir izleyin.

4. Quantitate Sheroid Filizlenme

  1. Filiz sayısını ölçmek ve her filizin uzunluğunu ölçmek için resim dosyalarını ImageJ yazılımına aktarın. Ortak kültür küreselleri için, küresel boya yapmadan önce ecfc'leri yeşil floresan boyaile etiketlendirin. Daha sonra, yeşil floresan ile boyanmış filizlerin sayısını ve uzunluğunu ölçün (Ek Şekil 2). Deney grubu başına rastgele seçilen beş küresel hastalık ölçüldü.
    NOT: Filizler, küresel lerden dışarı yayılan birkaç ECFC'nin oluşturduğu işbirlikçi uzun yapılardır. Filiz uzunluğu, küresel lerin yüzeyinden filizin ucuna kadar filiz kökenli olan uzunluk olarak ölçülür.
  2. En az üç bağımsız deneyin ± SEM anlamına gelir. Birden çok karşılaştırma için istatistiksel olarak anlamlı farkı tek yönlü ANOVA veya eşleştirilmiş karşılaştırmalar için Öğrencinin t-testiile belirleyin.
    NOT: P ≤ 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Sonuçlar

Karşılaştırma deneyleri, MsC'lerin ECFC'ler aracılı anjiyogenezde önemli bir rol oynayıp oynamadığını incelemek için mono-kültür küreseloidleri (yalnızca ECFC'ler) ve eş kültür küreselleri (ECFCs+MSCs) kullanılarak yapılmıştır. Her küresel oidden filizlenme oluşumu, küresel lerden anjiyojenik filizlenmenin ilerlemesini yakalabilen gerçek zamanlı bir hücre kaydedici tarafından 24 saat boyunca izlendi. Anjiyojenik potansiyel, filiz sayısı nın sayılarak ve bireysel küresel lerden üreti...

Tartışmalar

Bu çalışmada, iki insan vasküler hücre atası, ECFC ve MSC'lerden oluşan eş kültür sploroidlerini kullanan geliştirilmiş bir in vitro anjiyogenez titreşme sistemi ortaya konmuştur. endotel hücreleri ve perisitler arasındaki etkileşim ve birleşme ile gerçekleştirilir. Sadece EC'ler aracılı anjiyogenezi yansıtan diğer in vitro anjiyogenez tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu eş-kültür tahlil sistemi hücresel etkileşim, filizlenme, tüp oluşumu da dahil olmak üzere fizyolojik anjiyog...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Gıda ve İlaç Güvenliği Bakanlığı'ndan (17172MFDS215) bir hibe, Kore hükümeti (MSIP) (2017R1A2B4005463) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı(NRF) hibesi ve Temel Bilim Araştırma Programı ile desteklenmiştir. Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) (2016R1A6A1A03007648).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % Trypsin EDTA (1X)Gibco25300-054
BevacizumabRocheNACommercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle MediumGibco11885-084DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10X)Gibco21600-010PBS (10X)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1X)Corning21-031-CVRPBS (1X)
Endothelial cell Growth medium MV2 kitPromocellC-22121ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS)AtlasFP-0500AFBS
GelatinBD Sciences214340
L-Glutamine–Penicillin–StreptomycinGibco10378-016GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2PromocellC-28009MSCGM-2
Methyl celluloseSigma-AldrichM0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichMINI26PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker KitsSigma-AldrichMINI67PKH67
Sodium HydroxideSigma-AldrichS5881
Type I collagen gelCorning354236
Vascular endothelial growth factor AR&D293-VE-010VEGF

Referanslar

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 151anjiyogeneze k lt r k reselendotel kolonisi olu turan h crelermezenkimal k k h crelertip I kollajen jelfilizlenmebevacizumab

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır