内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

要約

三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。

要約

血管新生の分野での研究は、血管新生が関節リウマチ、眼科症、心血管疾患などの50以上の異なる病理学的状態の特徴であるという認識で、ここ数十年で積極的に成長してきました。、および腫瘍転移。血管新生の薬剤開発の間、生理血管新生プロセスを反映するために適切な細胞型および適切な条件を有するインビトロアッセイシステムを使用することが重要である。主に内皮細胞を用いた体外血管新生アッセイ系の現在の限界を克服するために、3次元(3D)共培養スフェロイド発芽アッセイシステムを開発した。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、内皮コロニー形成細胞(CFFC)および間葉系幹細胞(MSC)の2つの比率によって5対1の比率で産生された。EFc+MSCスフェロイドは、生体内細胞外環境を模倣するためにI型コラーゲンマトリックスに埋め込まれた。リアルタイムの細胞レコーダーを用い、24時間のスフェロイドからの血管新芽の進行を連続的に観察した。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さを測定することによって定量された。実験群ごとに5つのランダムに選択されたスフェロイドを分析した。比較実験は、EFC+MSCスフェロイドが、EFCのみのスフェロイドと比較して、より大きな芽数と累積芽長を示したことを実証した。FDA承認血管新生阻害剤であるベバシズマブは、新たに開発された共培養スフェロイドアッセイシステムを用いて、抗血管新生薬のスクリーニングの可能性を検証した。ECFCのみのスフェロイドと比較したECFC+MSCスフェロイド_のIC50値は、異種移植片腫瘍マウスモデルから得られたベバシズマブの有効血漿濃度に近かった。本研究は、3D ECFC+MSCスフェロイド血管新生アッセイシステムが生理学的血管新生に関連し、動物実験の前に有効な血漿濃度を予測できることを示唆している。

概要

世界中で約5億人が、関節リウマチ、眼症、心血管疾患、腫瘍転移1などの血管奇形関連疾患に対する血管新生調節療法の恩恵を受ける見込^みです。このように、血管新生を制御する薬剤の開発は、製薬業界において重要な研究領域となっています。創薬プロセスの間に、生体内動物研究は、生理機能および臓器間の全身相互作用に対する薬剤候補の影響を探求する必要がある。しかし、倫理的およびコストの問題は、動物実験2に関する懸念を高^{めています。}したがって、動物実験の前により良い意思決定につながるより正確で予測可能なデータを得るためには、インビトロアッセイシステムの改良が必要です。現在の体外血管新生アッセイは、通常、2次元(2D)培養^{プレート3}に播種された内皮細胞(IC)の増殖、侵入、移行、または管状構造形成を測定する。これらの2D血管新生アッセイは、迅速、シンプル、定量的、費用対効果が高く、血管新生調節薬の発見に大きく貢献しています。ただし、いくつかの問題は改善される必要があります。

このような2Dインビトロアッセイシステムは、生体内生理学的条件下で起こる血管新生の複雑な多段階事象を反映することができず、インビトロアッセイデータと臨床試験結果との間に不一致を引き起こす不正確な結果^{をもたらす4。}2D培養条件はまた、細胞型の変化を誘発する。例えば、2D培養プレートで増殖した後、ICはCD34の発現の減少と細胞^応答5、6を支配するいくつかのシグナルによって現れる弱い細胞表現型を^持つ。2D培養系血管新生アッセイシステムの限界を克服するために、3次元(3D)スフェロイド血管新生アッセイシステムが開発されました。発芽に続いて、ICによって形成されたスフェロイドからの管状構造形成は、生体内ネオ血管化^{プロセス7,8}に反映される。従って、3Dスフェロイド血管新生アッセイは、潜在的なプロまたは抗血管新生薬をスクリーニングするための有効なアッセイシステムと考えられている。

ほとんどの3Dスフェロイド血管新生アッセイは、主にヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)またはヒト真皮微小血管内皮細胞(HDMEC)のみを使用して、血管新生時のICの細胞応答に焦点を当てています。しかし、血液毛細血管は、2つの細胞タイプで構成されています: ICとペリサイト.適切な血管の完全性と機能のためには、ICとペリサイト間の双方向相互作用を詳述することが重要です。遺伝性脳卒中、糖尿病網膜症、静脈奇形などのいくつかの疾患は、内^皮9に対する周辺細胞密度の変化または減少した周辺細胞の付着と関連している。血管細胞はまた、血管新生プロセスの重要な要素として知られています。ペリサイトは、新たに形成された容器構造をICで安定させるために募集されています。この点に関して、単培養スフェロイド血管新生アッセイは、ペリ^{サイト7、10}を組み込まない。したがって、ICおよびペリサイトによって形成される共培養スフェロイドは、生理学的血管新生事象をより密接に模倣する貴重なアプローチを提供しうる。

本研究は、ヒト内皮コロニー形成細胞(EFC)と間葉系幹細胞(MSC)を組み合わせて生体内血管新生をより密接に反映する3D共培養スフェロイド血管新生アッセイの開発を目指した。正常血管のインインビトロ表現アセンブリとしての共培養スフェロイド系は、2001^年11月にKorffらによって最初に設立された。それらはHUVECとヒト臍動脈平滑筋細胞(HUSMC)を組み合わせ、2つの成熟した血管細胞の共培養が発芽電性を減少させたことを実証した。成熟したIC(HUVEC)は、増殖および分化する能力を徐々に失うことが知られており、これは血管新生^応答12,13に悪影響を及ぼす。成熟した血管皮細胞(HUSMC)は、血管内皮増殖因子(VEGF)応答^性11の剥奪を通じて内皮細胞の不活性化を引き起こす可能性がある。コルフと私たちの共培養スフェロイド系の主な違いは、使用される細胞タイプです。我々は、2つの血管前駆体であるCFFCとMSCを用いて、適切な血管新生アッセイシステムを確立し、プロまたは抗血管新生剤をスクリーニングおよび調査した。EFC は、PC の前駆体です。ECFCは成熟したIC¹⁴と比較して堅牢な増殖能力を備えており、PCの限界を克服できます。CFFCは、多くの出生後病態生理学的^{条件15、16、17}における新しい血管形成に寄与する。MSCは、多能性幹細胞であり、多細胞に分化する能力を有し、それによって血管新^生18、19に寄与する。

以前の報告では、CFFCおよびMSCは、インビトロチューブ^形成20、生体内ネオ血管^{化21、22、}および虚血^{組織23、24}の改善された再灌流に相乗効果を示した。本研究では、CFFCとMSCを用いて共培養スフェロイドを形成し、生体内3D環境を反映するためにI型コラーゲンゲルに埋め込まれた。コラーゲンは、EC²⁵を取り巻く細胞外マトリックス(ECM)の主要成分と考えられている。ECMは、細胞^行動26を調節する上で重要な役割を果たしている。ここで提案されるアッセイプロトコルは、一般的な実験室技術を用いて2日以内に容易かつ迅速に行うことができる。発芽プロセス中に効果的な細胞追跡のために、各細胞タイプは、リアルタイムの細胞レコーダーを使用して蛍光標識および監視することができる。新たに確立された3D共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、潜在的な血管新生変調器を評価するための感度を高め、生体内研究の前に予測可能な情報を提供するように設計されています。

プロトコル

ヒトECFCは、以前の^報告27で述べたように、ヒト末梢血から単離された。簡単に言えば、単核細胞層をフィコル・パック・プラスを用いて全血から分離し、内皮様コロニーが現れるまで適切な培地で培養した。コロニーを収集し、CD31コーティングされた磁気ビーズを用いてCFFCを単離した。MSCは、ヒト成人骨髄の付着単核細胞(MNC)画分から単離した。研究プロトコルは、Duksung女子大学の機関審査委員会によって承認されました (IRB No. 2017-002-01).

1. 細胞培養

1. CFC および MSC の媒体プレートとコート プレートの準備
   1. 内皮細胞増殖培地MV2(ECGM-MV2、ヒドロコルチゾンを除く)を10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%グルタミンペニシリン連鎖筋マイシン(GPS)を補充した。
   2. 10%FBSおよび1%GPSを含む間葉系幹細胞増殖培地-2(MSCGM-2)を調製する。
   3. ECFC培養の場合は、細胞培養プレートを1%ゼラチン溶液で塗ります。ゼラチン溶液1%を調剤し、磁気攪拌機でPBSの500mLに1gのゲル化粉末を溶解し、オートクレーブで殺菌する。プレートは3 mL/60 mm、5 mL/100 mm、または1%ゼラチン溶液の15 mL/150 mmでコーティングすることができます。細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)で15分間コーティングされたプレートをインキュベートする。その後、吸引によって残りの1%ゼラチン溶液を取り出し、PBSでコーティングされたプレートを1回洗浄します。
2. 成長する CFFC と MSC
   1. 種子1 x 10⁶ ECFCを1%ゼラチンコーティング150mmプレート上に、細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)でECGM-MV2(10%FBS、1%GPS)を用いて80〜90%のコンフルエンスに成長させる。通路番号 7~10 で ECFC を使用して、一貫した結果を得ます。
   2. シード1 x 10⁶ MSCを非コーティングされた150mmプレート上で、細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)でMSCGM-2を用いて80〜90%の合流に成長させる。一貫した結果を得るために、通路番号 7~10 の MSC を使用します。

2. メチルセルロース溶液1.2%の調製

1. 500 mLのガラスボトルで6gのメチルセルロースを測定し、オートクレーブで殺菌します。
2. ECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)を60°Cで20分間加熱し、殺菌されたメチルセルロース粉末に250 mLの加熱ECGM-MV2を加えます。滅菌条件を維持するために、フローフード内のプロセスを実行します。
3. 殺菌された磁気攪拌バーを追加し、メチルセルロースが完全に濡れ、塊なしで均等に分散されるまで、磁気攪拌機に20分間溶液を混ぜます。無菌状態で250 mLの冷たい(4°C)ECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)を加え、磁気攪拌機でさらに10分間混ぜます。その後、冷蔵庫(4°C)で一晩冷やします。
   注:メチルセルロースは、腫れやその後の水分補給のために涼しい温度でよく溶解する炭水化物ポリマーです。
4. 翌日、溶液を50mLチューブでアリコートし、遠心分離機を5,000 x gで4°Cで3時間使用します。透明な粘性上清溶液を取り、最大3〜6ヶ月の使用まで4°Cで保存します。
   注:堆積物には残留セルロース繊維が含まれている可能性があるため、少なくとも5mLの体積を残した上清溶液を穏やかに取る。この容積は実験条件に従って調節することができる。

3. EFC のみ、MSC のみ、および ECFC-MSC スフェロイドの生成と埋め込み

1日目

1. CFC および MSC セルサスペンションの準備
   1. カルシウムやマグネシウムを使わずにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて80~90%のコンフルエントなEFCとMSCを洗浄し、吸引します。
   2. 培養プレートからCFCとMSCを切り離すには、細胞培養インキュベーター(37°C_{および5%CO2)}でそれぞれ0.05%トリプシン-EDTAを0.05%トリプシン-EDTAでインキュベートします。
   3. 10%FBSおよび1%のGPSを含むDMEM媒体を加えることによってトリプシンを不活性化する。セルを上下にピペットにして、単一のセルサスペンションを作成します。
   4. RTで5分間282 x gで遠心分離して細胞を堆積させる。
   5. 上清を取り出し、それぞれの培地で細胞を再停止させる。
2. 蛍光色素によるCFFCおよびMSCのラベリング
   注:PKH67(緑色)とMSCの細胞膜標識をPKH26(赤色)蛍光色素で、メーカーの指示に従って、以下のようにわずかに変更します。
   1. 細胞を無血清培地で2回洗い、FBSを除去する。
      注:FBSのタンパク質および脂質は結合によって細胞を標識するための有効な色素濃度を低下させる。
   2. 顕微鏡下のヘモサイトメーターを使用してCFFCとMSCをカウントし、3 x 10⁶ ECFCと2 x 10⁶ MSCを2 mLマイクロチューブに転送します。
      注:これらは、染料で細胞を標識するための最適な細胞密度です。多数の細胞を使用すると、不十分で不均一な染色を引き起こしますが、あまりにも少ない細胞の使用は、細胞の回復が悪くなります。
   3. RTで100 x gでチューブを遠心分離し、細胞ペレットを得る。残量の15-25 μL以下を残して上清を慎重に吸引します。
   4. 色素キットから希釈Cの250 μLでCFFCとMSCを再中断します。細胞懸濁液をゆっくりとピペットにして、完全な分散を確保します。
      注:希釈剤Cは生理塩であり、ミセルを形成することにより色素の染色効率を低下させてもよい。したがって、細胞が希釈Cに長時間放置し、チューブを渦にしないでください。
   5. PKH67の5μLを希釈Cの250μL(最終濃度20μM)に加え、PKH26の3μLを250μLの希釈Cの250μL(最終濃度12μM)で加えて、CFCの染色液を調付けます。
      注:最終的な色素濃度は、メーカーの推奨とは異なります。高濃度は、細胞の束と細胞毒性につながるだろう.低濃度は染色には十分ではないであろう。
   6. PKH67色素溶液の250 μLに250 μLのCFC細胞懸濁液を、250 μLのMSCをPKH26色素溶液の250 μLに加えます。すぐに上下にピペッティングして染料と細胞を混合し、室温で5分間インキュベートします。より良い結果を出すために、アルミホイルでチューブを覆い、染色中に十分な混合を確保するためにシェーカーに置きます。
   7. 染色された細胞懸濁液に0.5 mLのFBSを加えて染色プロセスを停止し、その後、FBSが過剰な非結合色素を結合できるように1分間インキュベートします。100 x gで5分間遠心分離することにより染色した細胞を堆積させる。
      注:ECFCおよびMSCペレットは、染色後、それぞれ薄黄色とピンクです。
   8. 上清を慎重に取り除き、余分な色素を除去するために完全な培地で細胞を2回洗浄します。チューブを100 x gで5分間遠心分離し、各完全培地の2mLでペレットを再中断します。
3. ECFC、MSC、または ECFC+MSC スフェロイドの生成
   注:前述の²⁸のように、吊り下げテクニックを適用してスフェロイドを生成します。スフェロイドの調製手順を以下に示す。
   1. 染色された CFFC と MSC をカウントします。
   2. 20%メチルセルロース溶液および5%FBSを含むECGM-MV2で染色されたECFC、MSCまたはECC+MSCを中断します。CFCまたはMSCの4 x 10⁴セル/mLの細胞密度で調記します(25 μLの細胞懸濁液には1,000個の細胞が含まれています)。CFFCとMSCの2つの細胞懸濁液の場合は、2 x 10⁴セル/mLエクセルおよび0.4 x 10⁴セル/mL MSC(25 μLには500のCFFCと100のMSCが含まれています)の細胞密度で調記します。
      注:MSC に対する CFC の比率は 5:1 を超えてはなりません。MSC の数が多いほど、過度の移行や不規則な芽の形態が発生する可能性があります。MSC の数が少ないと、セル間の相互作用が悪くなり、発芽が不十分になります。
   3. 150mm培養板の底部に15mLのPBSを加えて水和ユニットを準備します。
   4. マルチチャンネルピペットの使用のための殺菌ポリスチレン長方形リザーバに細胞懸濁液を移します。ピペッティングにより細胞懸濁液を均等に分散させる。
   5. マルチチャンネルピペット(150mmプレートの約100滴/カバー)を使用して、150mm培養プレートのカバーに25μL滴のセルサスペンションを堆積させます。PBS充填水和ユニットの上にカバーを反転し、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。
      注:メチルセルロース溶液は、懸濁液に適切な粘度を提供する。メチルセルロース溶液を使用せずに吊り下げ方法を行った場合、カバーを反転させた際に滴が滑り落ちやすい(補足図1)。さらに、一晩インキュベーション後、スフェロイドはメチルセルロース溶液なしで完全に形成されなかった。この結果は、メチルセルロース溶液による適切な粘度がスフェロイドの円形を形成する必要があることを示している。

2日目

4. 中和コラーゲンゲルにスフェロイドを埋め込む
   1. 水浴(37°C)で温かいFBSおよびECGM-MV2(FBSおよびGPSなし)。冷たいメチルセルロース溶液を作業ベンチに置き、室温にします。
   2. 24ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C)に入れ、温めます。
   3. メチルセルロース溶液やI型コラーゲンなどのスフェロイドや粘性懸濁液を吸引するために、尖った1 mLピペットチップを3〜5mmカットし、快適かつ正確に。
   4. I型コラーゲンゲルメーカーの指示に従い、氷上に3mg/mL中和型Iコラーゲンゲルを調剤する。
      注:室温でコラーゲンのゲル化を避けるために氷上で中和を行う必要があります。24ウェルプレートの1つのウェルには、中和コラーゲンの500 μLが必要です。常にコラーゲンの1 mL余分なボリュームを準備します。コラーゲンゲルは、氷の上に保持した場合、中和後2〜3時間まで使用することができます。
   5. PBSの5 mLでスフェロイドを含むカバーをすすいでスフェロイドを収穫します。50 mL円錐形チューブでスフェロイド懸濁液を採取します。残りのスフェロイドを得るためにPBSの5 mLでカバーを再リンスします。
      注:収穫の間、スフェロイドの存在を確認するために密接に観察する。より多くの目視検査のために、スライドガラス上に約50-100 μLのスフェロイド懸濁液を移し、顕微鏡下でスフェロイドの丸い形状を確認してください。
   6. 282 x gで5分間遠心分離してスフェロイドを堆積させ、残留量の100-200 μL以下の残りのスフェロイドを邪魔することなく、上清を慎重に廃棄します。
   7. 残りの100-200 μL残液でスフェロイドが自由に吊り下げられたように、チューブの壁を軽くタップします。
   8. 5%FBSおよび40%メチルセルロース溶液を含むECGM-MV2をスフェロイド含有管に添加する。添加された体積は、約100のスフェロイド/mLに基づいて決定される。鈍い1 mLピペットの先端とピペットによってそっとスフェロイド懸濁液を混ぜる。
      注:メチルセルロース溶液は、スフェロイドが堆積物にすることを許さない中断剤として広く使用されている。FBS濃度は5%でなければなりません。高いFBS濃度は、過剰な成長因子による異常な芽を引き起こす。低FBS濃度は、細胞の健康条件を維持することはできません.
   9. スフェロイド懸濁液と中和型Iコラーゲンゲル(3mg/mL)を氷上で1:1の比率で混合します。スフェロイドの破損を避けるために、鈍い1 mLピペットの先端を使用してください。
      注:24ウェルプレートの1つのウェルには、スフェロイドサスペンドコラーゲンゲル溶液の1 mLが必要です。可能であれば、余分な混合サスペンションソリューションを作成します。
   10. 任意の薬剤または化学薬品の血管新生特性をテストする必要がある場合は、1 mLマイクロチューブにスフェロイドサスペンジングコラーゲンゲル溶液の1 mLを転送し、その後、鈍い1mLピペット先端と穏やかな混合を加えます。
       注:薬剤および化学物質の体積は200 mLに合計することができ、これは1.5mg/mLから1.25 mg/mLにタイプIコラーゲンゲル濃度を希釈するが、タイプIコラーゲンゲル重合には影響しない。コントロール スフェロイドに同じボリュームの車両を追加します。
   11. ピペッティングにより予め温められた24ウェルプレート(0.9mL/ウェル)の井戸にスフェロイドサスペンジングコラーゲンゲル溶液を加え、重合のために細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートします。
       注:スフェロイド埋め込みプロセス中に、プレートを攪拌することによってゲルを乱さしないでください。
   12. VEGFの有無にかかわらず2.5%FBSを含むECGM-MV2を100μL添加して、スフェロイド懸濁コラーゲンゲルをカバーします。ECFCのみのスフェロイドの場合、VEGF(50ng/mLの最終濃度)を外因性添加して細胞を刺激し、適切な芽を形成する。ECFC+MSCスフェロイドは、任意の成長因子による外因性刺激を必要としません。
   13. 細胞培養インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に取り付けられたリアルタイムセルレコーダーにプレートを置き、5~10枚のスフェロイド(10倍対物レンズ)にランダムに焦点を合わせます。各蛍光標識スフェロイドの発芽形成を1時間ごとに24時間毎に監視し、妨害を行いません。

4. 量子スポロイド発芽

1. イメージ ファイルを ImageJ ソフトウェアに読み込んで、新芽の数を定量化し、各芽の長さを測定します。共培養スフェロイドの場合は、スフェロイドを作る前に緑色蛍光色素でEFCにラベルを付けます。次に、緑色蛍光で染色した芽の数と長さを測定する(補足図2)。5つのランダムに選択されたスフェロイドを実験群ごとに定量した。
   注:芽は、スフェロイドから伸びるいくつかのCFCによって形成される協調的に細長い構造である。芽の長さは、スフェロイドの表面から芽の先端までの芽の点から起源の長さとして測定されます。
2. 少なくとも3つの独立した実験の平均±SEMとして値を表す。複数の比較の一方通行分散分析またはペア比較の学生の t-testによって統計的に有意な差を決定します。
   注: P ≤ 0.05 は統計的に有意と見なされます。

結果

比較実験は、単培養スフェロイド(ECFCのみ)と共培養スフェロイド(EFc+MSC)を用いて、MSFcがEFC媒介血管新生において大きな役割を果たしているかどうかを調べた。各スフェロイドからの発芽形成は、スフェロイドからの血管新芽の進行を捕捉できるリアルタイム細胞レコーダーによって24時間モニタリングされた。血管新生電位は、芽の数を数え、個々のスフェロイドから発生する芽の累積長さ?...

ディスカッション

本研究では、2つのヒト血管細胞前駆体、EFCおよびMSCによって形成された共培養スフェロイドを利用したインビトロ血管新生アッセイ系の改良を導入する。内皮細胞と膜細胞間の相互作用と組み込みによって達成される。この共培養アッセイシステムは、IC媒介血管新生のみを反映する他のインビトロ血管新生アッセイと比較して、細胞相互作用、発芽、チューブ形成を含む生理学的血管新生?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x)	Gibco	25300-054
Bevacizumab	Roche	NA	Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium	Gibco	11885-084	DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x)	Gibco	21600-010	PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x)	Corning	21-031-CVR	PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit	Promocell	C-22121	ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS)	Atlas	FP-0500A	FBS
Gelatin	BD Sciences	214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin	Gibco	10378-016	GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2	Promocell	C-28009	MSCGM-2
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits	Sigma-Aldrich	MINI67	PKH67
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Type I collagen gel	Corning	354236
Vascular endothelial growth factor A	R&D	293-VE-010	VEGF