葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）诱导RA小鼠中iNKT细胞的采用免疫治疗

摘要

该协议使用G6PI混合肽构建类风湿关节炎模型，更接近^CD4+T细胞和细胞因子中的人类类风湿性关节炎模型。高纯度不变天然杀伤性T细胞（主要是iNKT2），具有特定的表型和功能，通过体内诱导和体外纯化获得，用于采用免疫治疗。

摘要

风湿性关节炎（RA）是一种复杂的慢性炎症性自身免疫性疾病。这种疾病的发病机制与不变的自然杀手T（iNKT）细胞有关。活性RA的患者存在较少的iNKT细胞，有缺陷的细胞功能，和Th1的极化过度。在这项研究中，使用hGPI325-339和hGPI469-483肽的混合物建立了RA动物模型。iNKT细胞通过体内诱导和体外纯化获得，然后输入RA小鼠进行采用免疫治疗。体内成像系统（IVIS）跟踪显示，iNKT细胞主要分布在脾脏和肝脏中。细胞治疗后的第12天，病情进展明显减缓，临床症状得到缓解，胸腺中iNKT细胞的丰度增加，胸腺中iNKT1的比例下降，TNF-α、IFN-α和IL-6水平下降。血清减少。iNKT细胞的接受免疫疗法恢复了免疫细胞的平衡，纠正了身体的过度炎症。

引言

风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特征是慢性、渐进性侵入性，发病率为0.5-1%，^{发病率为1，2。}潜在的发病机制归因于自动反应^CD4+和^CD8+T细胞的异常增殖，表现为^CD4+IFN++和CD4+IL-17A+T细胞比例增加，CD4+IL-4+CD4+CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例增加。 因此，炎症细胞因子的分泌增加，过度的炎症反应破坏人体免疫系统的本生平衡和耐受功能。此外，穿透关节的助剂T淋巴细胞（Th）1细胞会加重炎症反应和关节损伤。因此，抑制过度的炎症反应和恢复免疫耐受性和免疫平衡是治疗RA^3，4的关键。

iNKT细胞同时具有NK细胞和T细胞的功能和特性。iNKT细胞具有独特的、不变的T细胞受体（TCR）+链，具有有限的TCR+链表5，^并识别抗原呈现细胞表面的主要组织相容性复合物（MHC）I类分子CD1d呈现的糖脂抗原。三三等人⁶日检测出大量iNKT细胞和功能缺陷，包括RA在内的许多自身免疫性疾病。Aurore等人⁷表明，iNKT细胞对维持自身免疫耐受性有积极作用，当iNKT细胞的数量和功能恢复时，疾病得到缓解。此外，Miellot-Gafsou等人⁸日发现，iNKT细胞不仅可使疾病发生，而且增加了疾病的进展。这些相互矛盾的结果表明，iNKT细胞是异质T细胞，不同子集的功能可能逆转。在RA的临床研究中，iNKT细胞的频率与疾病活性⁹的分数相关。结果还证实，在RA患者中，iNKT的频率降低^，CD4+IFN-α+T细胞子集数量增加，炎症细胞因子IFN-α和TNF-α的分泌水平增加^10，11。此外，Sharif等人¹²日调查了1型糖尿病（T1D），发现INKT细胞的选择性输注能调节炎症细胞因子IL-4的表达，保持免疫耐受性，并防止1型糖尿病的发展。因此，采用特定iNKT细胞的输注或针对iNKT细胞的活化可增加RA患者的iNKT细胞水平，这在RA治疗中是一个突破。

细胞免疫疗法目前备受关注，已广泛应用于癌症治疗。然而，iNKT细胞是罕见的，异质免疫调节细胞（只占PBMC总数的^0.3%）13，这限制了潜在的临床应用。这些细胞主要分为三个亚群:1）iNKT1细胞，具有高表达的原发性白血病锌指蛋白（PLZF）和T-盒转录因子（T-bet）;2） 具有PLZF和GATA结合蛋白3（GATA3）中间表达的iNKT2细胞;3）iNKT17细胞，具有PLZF和视网膜相关孤立核受体（ROR）的低表达，即分泌IFN-*、IL-4和^{IL-17 14。}激活的iNKT细胞分泌Th1、Th2和Th17样细胞因子，这些细胞因子决定了iNKT细胞¹⁵的不同免疫调节作用。iNKT细胞各亚群特异性活化的免疫调节和免疫治疗效果不同。因此，选择具有抗炎功能的iNKT细胞（主要是iNKT2）的特定表型，以调节人体的免疫反应，可以纠正RA的免疫不平衡和免疫障碍。

建立理想的动物模型对RA发病机制的治疗和研究具有重要意义。目前，最常用的和成熟的动物模型包括胶原蛋白引起的关节炎，辅助性关节炎，酶性关节炎，和多糖引起的关节炎^16-17。然而，没有一个模型可以完全模拟人类RA的所有特征。II型胶原蛋白诱发关节炎（CIA）是一种经典的关节炎模型。CIA是通过对II型胶原蛋白特异性单克隆抗体的小鼠进行免疫接种，反映该疾病模型的抗体依赖性。Benurs等人描述了一个对葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）有全身免疫反应的模型，该模型在易感小鼠菌株^18、19中诱导外周对称多关节炎。在这个模型中，关节炎的发展依赖于T细胞、B细胞和先天免疫18、19、20。Horikoshi²¹发现，在 CD4⁺ T 细胞和细胞因子（即 IL-6 和 TNF-α）方面，通过免疫 DBA/1 小鼠的 G6PI 多肽片段产生的 RA 模型比 CIA 模型更类似于人类 RA。为了增加对TCR识别部位的刺激作用，利用G6PI（hGPI325-339和hGPI469-483）的混合多肽片段对DBA/1小鼠进行免疫，以构建RA小鼠模型。这种方法的成功率可以很高，因为hGPI325-339和hGPI469-483是I-A q受限T细胞反应的免疫主导。因此，该模型可以模拟RA患者²²的^CD4+T细胞和iNKT细胞缺陷的增殖。RA免疫病理学的基础研究为我国进一步深入研究奠定了基础。

研究方案

所有实验小鼠（共150只）为健康的雄性DBA/1小鼠，6~8周大（20.0~1.5克），在特定的无病原体（SPF）环境中饲养。建模前没有特殊处理。实验分为健康对照组（15只小鼠）、模型对照组（15只小鼠）和细胞治疗组（55只小鼠）。这项研究得到了河北大学动物福利伦理委员会的批准。

1. 构建疾病模型

1. 复制 RA 动物模型
   1. 重量为1.75毫克的hG6PI 325-339和hG6PI 469-483碎片，并将其溶解在5.25 mL的4°C三蒸馏水中。
   2. 将完整的Freund的佐剂（CFA）溶解在50°C的水浴中，将5.25 mL抽到另一根10mL的离心管中，并冷却使用。
   3. 将hG6PI溶液和CFA溶液的混合物放入人工乳化单元中，连接两个玻璃注射器。
   4. 以每分钟10~20倍的恒定速度和频率推动注射器，完全乳化混合肽溶液和CFA溶液。在冰浴中执行操作，在乳化完成后将乳液滴在水中保持 10 分钟，而不会分散。
   5. 将150 μL乳化hG6PIs注射到小鼠的尾部根皮下。
   6. 在hG6PI注射后0小时和48小时后，将200毫克百日霉毒素注射到小鼠体内。
2. RA模型的实验验证
   1. 使用 Vernier 卡钳（每天 2 次）测量鼠标爪子的厚度。
   2. 观察并标记足部发红和肿胀的程度。使用以下评分标准:1）脚趾轻微肿胀;2） 带明显红色肿胀的多苏木和脚垫;3）脚踝有红色肿胀。
   3. 在模拟14天后，通过1%五巴比妥钠钠（50毫克/千克体重）的腹内注射，在深度麻醉下给小鼠安乐死，并去除用于HE染色的爪子。
   4. 根据制造商的协议，使用商业细胞学珠阵列（CBA）测定，使用商用细胞学珠阵列（CBA）测定确定血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-10、IL-17A、TNF-α和IFN-α的分泌水平。

2. 通过采用细胞疗法获得iNKT细胞

1. iNKT细胞的定向诱导
   1. 用β-GalCer（0.1毫克/千克的体重）在腹内注射正常小鼠。
2. iNKT细胞的隔离
   1. 建模三天后，用1%的五巴比妥钠（50毫克/千克体重）注射小鼠进行麻醉。充分麻醉的小鼠不会表现出对脚趾捏合的后爪戒断反应。
   2. 用β-GalCer注射后，分离DBA/1小鼠的脾脏。通过在200个网状筛中切割和研磨脾脏，准备单细胞悬浮液。
   3. 用PBS清洗细胞悬浮液，在200 x g下离心5分钟，然后丢弃上清液。重复。
   4. 用1 mL的全血和组织稀释溶液重新悬浮细胞。加入3 mL小鼠淋巴细胞分离培养基，然后在室温下以300 x g将细胞离心20分钟。
   5. 收集乳白色淋巴细胞的层（即，从顶部的第二层），用PBS洗涤2x，用自动细胞计数器计数。
3. 用于 iNKT 细胞纯化的磁性活细胞分拣 （MACS） 正选择策略
   注:对于CD1d四聚体的预处理，将1mg/mL的β-Galcer稀释至200μg/mL，加入0.5%的Tween-20和0.9%的NaCl，并将5μL的所得溶液添加到CD1d四聚体溶液的100μL中。该混合物在室温下孵育12小时，置于4°C下使用。TCR = 用去离子水稀释80倍。所有其他抗体都被用作库存溶液。
   1. 用100μL的4°C PBS重新悬浮10⁷个细胞，加入10μL的β-GalCer加载CD1d四聚体PE，并在4°C下孵育它们15分钟。
   2. 用PBS清洗细胞2倍，并在80μL的PBS中重新悬浮。
   3. 加入20μL的抗PE微珠，在黑暗中在4°C下孵育20分钟。
   4. 用PBS清洗2次，用500μL的PBS重新悬浮细胞。
   5. 将分拣柱置于 MACS 分拣机的磁场中，然后用 500 μL 的 PBS 冲洗。
   6. 将步骤 2.3.4 中的细胞悬浮液添加到分拣列中，收集流水，然后用 PBS 缓冲液冲洗 3x。
   7. 移除磁场并从排序列中收集单元格。此时，向分拣柱添加 1 mL 的 PBS 缓冲液，并在恒定压力下快速推动柱塞，将标记的细胞驱动到收集管，并获得纯化的 iNKT 细胞。使用自动细胞计数器计数。
4. iNKT细胞表型的识别
   1. 分别从步骤2.2.5和2.3.7中取取1 x 10⁶个细胞，并在50μL的PBS中重新悬浮。
   2. 抗体孵育:请勿将抗体添加到阴性控制管中，在单阳性控制管中加入0.5μL的β-GalCer-PE-CD1d四联体或10μL的FITC-TCR+。在样品管中加入0.5μL的β-GalCer-PE-CD1d四聚体和10μL的FITC-TCR+。在黑暗中在4°C下孵育30分钟。
   3. 在PBS中清洗细胞，然后在200 x g下离心5分钟。
   4. 丢弃上清液，加入1mL的Foxp3Foxation/渗透工作溶液，在黑暗中4°C下孵育细胞45分钟。
   5. 加入1mL的1x渗透缓冲液工作溶液，在室温下将细胞在室温下离心500 x g，5分钟。
   6. 丢弃上清液。在黑暗中室温下，加入 1 μL 的 Alexa Fluor 647 鼠标抗 PLZF 和 1 μL PerCP-Cy 5.5 鼠标抗 T-bet（或 1 μL 的 PerCP-Cy 5.5 鼠标抗 ROR_t），30 分钟。
   7. 将渗透缓冲液的渗透液添加到 2 mL，用于清洁。
   8. 丢弃上清液，将细胞重新悬浮在 500 μL 的 PBS 中，然后通过流式细胞测定进行测量。
5. iNKT细胞的功能识别
   1. 从步骤2.3.7中取取3 x 10⁶ iNKT细胞，并将其重新悬浮在12个孔板中，其转速为1.5 mL的RPMI-1640不完全培养基（即，不含血清）。
   2. 加入phorester（PMA，50纳克/mL）和碘霉素钙（IO，1微克/mL），并放入_CO2培养箱24小时。
   3. 根据制造商的协议，使用商用CBA测定法收集细胞上清液，检测IL-2、IL-17A、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-α和IL-10的分泌水平。
6. RA小鼠iNKT细胞迁移途径的实验研究
   1. 在 DMSO 中溶解二R染料（2.5 mg/mL）。
   2. 用RPMI-1640不完全培养基在6个孔板中重新悬浮iNKT细胞。密度为1 × 10⁶细胞/mL。
   3. 加入DiR（5μg/mL）溶液，在_CO2培养箱中孵育25分钟。
   4. 用PBS清洗并重新悬浮细胞（3 x 10⁶/300 μL），以获得标有DiR标记的iNKT细胞（DiR-iNKT）。
   5. 注射1%的五巴比妥钠（50毫克/千克体重）内腹，给小鼠麻醉。充分麻醉的小鼠不会显示后爪退出脚趾捏。在麻醉下对小鼠眼睛应用兽医药膏，以防止干燥进行成像。
   6. 将 DiR-iNKT 细胞 3 x 10⁶每只小鼠注入尾静脉与 RA 模型 8 天。使用小型动物体内成像系统（IVIS）监测小鼠注射后0分钟、10分钟、30分钟、60分钟和0天（3小时后）、1、3、6、12、26、34、38和42天的iNKT细胞。使用的激发波长为748nm，发射波长为780nm，暴露时间是自动的。
   7. 每次观察后，将每只小鼠放在一个单独的笼子中，并保持胸腔。观察，直到麻醉恢复。

3. 用iNKT细胞对RA小鼠的采用免疫治疗的评价

1. RA小鼠的iNKT细胞采用免疫疗法
   1. 通过尾静脉注入3 x 10⁶个细胞iNKT细胞。随机选择15只在8天前进行建模的小鼠，通过尾静脉输液从步骤2.3.7获得不含DiR标记的iNKT细胞。
2. 评估采用免疫疗法对iNKT细胞的疗效。
   1. 测量小鼠爪子的厚度，量化踝关节肿胀，并在iNKT细胞注入后系统地评分，如步骤1.2.1~1.2.2所述。
   2. 如步骤 1.2.3 所述，观察小鼠关节的炎症细胞渗透和关节变化。
   3. 如步骤 1.2.4 所述，确定 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α 和 IFN-*的分泌水平。
3. 确定 iNKT 细胞和子集的频率。
   1. 分离小鼠胸腺并准备单个细胞悬浮液。
   2. 用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
   3. 确定步骤 2.4 中描述的 iNKT 单元频率和子组频率。
4. 统计分析
   注:所有数据均值为平均值 = SD。P < 0.05 的值被视为具有统计显著性。
   1. 使用方差的单因子分析 （ANOVA）。如果满足方差，请使用 LSD 测试进行进一步比较。
   2. 如果方差不均匀，请使用非参数检验。使用克鲁斯卡尔-瓦利斯H测试进一步比较^31。

结果

关节指数得分和爪子厚度增加建模后。与对照组相比，RA模型组在建模后6天开始出现红色肿胀，逐渐加重。在14天，脚踝关节的红色肿胀达到顶峰，随后逐渐缓解。爪子的厚度变化类似（P < 0.05） （图 1）。

炎症细胞渗透在建模后显著增加。病理结果表明，RA模型小鼠脚踝间阴膜组织炎症细胞的渗透程度不同。高峰炎症发生在第14天后建模（

讨论

iNKT细胞是特殊的T细胞，桥接先天和适应性免疫，主要从^CD4+/CD8+ 胸腺细胞开发。iNKT细胞具有不同的免疫调节功能，通过直接接触和分泌不同细胞因子²³与其他免疫细胞相互作用，影响树突细胞（DC）、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、B细胞、T细胞和NK细胞分化和发育^{2 4。}β-GalCer是从海绵中提取的经典iNKT细胞特异性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF	BD	563490	America
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	Germany
Columns	Miltenyi	MS	Germany
Cryogenic Centrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
Embedding Center	Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.	BMJ-1	China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain	BD	553170	America
Flow cytometer	BD	Accuri C6	America
Freund's complete adjuvant	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	China
In Vivo Imaging System	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
Ionomycin Calcium	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
Mouse CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Mouse percoll	Solarbio	P8620	China
Optical Microscope	Olympus	Olympus-II	Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet	BD	561316	America
Pertussis toxin	Sigma	P7208	America
phorbol esters	Cayman	10008014	America
Red Blood Cell Lysis Buffer	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit	BD	560485	America
Ultramicrotome	Leica	Leica EM UC6	Germany