使用微流体芯片以确定性方式建立基于单细胞的共培养物

摘要

本报告描述了一种基于微流体芯片的方法，用于建立单细胞培养实验，实现多个单细胞的高效配对和微观分析。

摘要

细胞共培养测定已广泛用于研究不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用，以更好地了解包括癌症在内的疾病的生物学。然而，使用传统的共生系统来澄清高异质细胞群中细胞间相互作用的复杂机制具有挑战性，因为细胞亚群的异质性被平均值所掩盖;传统的共培养系统只能用于描述总体信号，但不能跟踪单个细胞的行为。此外，传统的单细胞实验方法由于泊森分布而降低细胞操作效率。微制造器件是单细胞研究的新兴技术，因为它们能以高通量精确操作单个细胞，并能减少样品和试剂的消耗。在这里，我们描述了微流体芯片在多种单细胞共培养物中的概念和应用。该芯片可以有效地捕获培养室中的多种类型的单个细胞（+46%）并有足够的培养空间可用于研究细胞在单细胞级细胞-细胞相互作用下的行为（如迁移、增殖等）。淋巴内皮细胞和口腔鳞状细胞癌用于在微流体平台上进行单细胞共培养实验，进行活多细胞相互作用研究。

引言

高效捕获不同类型的单细胞，并提供足够的培养空间，为多种类型的单细胞的单个细胞共培养^实验1。限制稀释是准备单细胞用于此类实验的最常见方法，因为所需的设备成本低。然而，由于泊森分布的限制，最大单细胞采集概率仅为37%，使得实验操作费力大，^耗时2.相比之下，使用荧光活化细胞分拣（FACS）可以克服泊森分布限制，以高效制备单^细胞3。然而，由于仪器仪表和维护费用高昂，一些实验室可能无法进入外地资产管制系统。微造设备最近被开发用于单细胞陷^印4，单细胞^配对5和单细胞培养应用。这些设备基于其准确操作单^细胞6、执行高通量实验或减少样品和试剂消耗的能力而具有优势。然而，使用当前微流体装置对多种细胞类型进行单细胞共培养实验仍然具有挑战性，因为泊森^{分布1、7、8}或不能设备捕获两种以上类型的单个细胞4，5，6，9，10。

例如，Yoon等人报告了用于细胞-细胞相互作用研究的微流体^装置11。此设备使用概率方法在一个腔室中配对细胞。但是，由于设备结构的几何限制，它只能实现两种不同单元类型的配对。另一份来自Lee等人的报告展示了一种确定性的方法来捕获和配对单个^细胞12。此设备通过确定性方法提高了配对效率，但受配对单元所需的长时间操作时间的限制。具体来说，第二个细胞捕获只能在24小时后将第一个捕获的细胞附着在表面后进行。 赵等人报告了一种基于液滴的微流体装置，以捕获两种类型的单个^细胞13。可以发现，液滴基微流体装置仍局限于泊液分布，只能在非附着细胞上使用，在培养过程中无法改变培养液。

此前，我们已经开发出一种微流体"流体动力学穿梭芯片"，利用确定性流体动力将多种类型的单细胞捕获到培养室中，并随后进行细胞共培养实验以进行分析细胞-细胞相互作用下的单个细胞迁移^行为14。流体动力穿梭芯片包括一组阵列单元，每个单元包含蛇形通路通道、捕获场和培养室。通过使用蛇形通路通道和培养室之间的流动电阻差，以及专门设计的操作程序，不同类型的单细胞可以反复捕获到培养室中。值得注意的是，培养室的充足空间不仅可以防止细胞在细胞捕获过程中被冲洗，而且为细胞扩散、增殖和迁移提供了足够的空间，从而可以观察活的单细胞相互作用。在本文中，我们将重点介绍此设备的生产和详细的协议步骤。

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研究方案

1. 用软光刻制造晶圆模具

注:掩码模式数据可在我们以前的^出版物14中提供。

1. 在 120°C 烤箱中脱水 4 英寸硅晶圆 15 分钟。
2. 在 1，000 rpm 转速下将 4 g SU-8 2 负光刻胶旋转到 4 英寸硅片上，30 s 可形成 5 μm 厚的层（层#1）。
3. 软烘烤层#1在65°C的热板上1分钟，然后将层#1转移到95°C的热板3分钟。
4. 冷却层#1室温，将其放在半自动蒙版校准器的支架上，并与镀铬光掩膜（捕获位图层）#1层对齐。
5. 以150 mJ/cm²的剂量照射365nm紫外光的#1层。
6. 从校准器上取下层#1，在 65°C 热板上进行后烘烤 1 分钟，将层#1转移到 95°C 热板 1 分钟。
7. 冷却层#1室温。浸入丙二醇单甲基乙醚醋酸溶液中，将未交联的光酸胶洗去2分钟，用氮气轻轻干燥，露出一层#1对齐标记。
8. 用胶带覆盖层#1对齐标记，将 4 g SU-8 10 负光刻胶旋转到层上，#1在 1，230 rpm 下 30 s，形成 25 μm 厚的层#2。
9. 取出胶带，软烘烤层#2在65°C的热板上3分钟，然后将层#2转移到95°C热板7分钟。
10. 冷层#2室温，将图层#2放置在半自动蒙版校准器的支架上，并将图层#2镀铬光蒙膜（旁路通道图层）与#1对齐标记的图层对齐。
11. 以200 mJ/cm²的剂量照射365nm紫外光的#2层。
12. 从校准器中取出层#2，在 65°C 热板上进行后烘烤 1 分钟，并将层#2转移到 95°C 热板 3 分钟。
13. 冷却层#2室温，用胶带覆盖层#1对齐标记。在 1，630 rpm 转速下将 4 g SU-8 2050 负光刻胶旋转到层 #2上，在 30 s 下，形成 100 μm 厚的层#3。
14. 将胶带、软烘烤层#3在 65°C 热板上5分钟，然后将#3层转移到 95°C 热板 20 分钟。
15. 冷却层#3室温，将图层#3放置在半自动蒙版校准器的支架上，并将图层#3镀铬光蒙膜（培养室图层）与#1对齐标记的图层对齐。
16. 以240 mJ/cm²的剂量照射365nm紫外光的#3层。
17. 从校准器中取出层#3，在 65°C 热板上进行后烘烤 5 分钟，将层#3转移到 95°C 热板 10 分钟。
18. 冷却层#3室温。浸入丙二醇单甲基乙醚醋酸溶液中，将未交联的光合电阻洗去10分钟，用氮气轻轻干燥。

2. PDMS 设备准备，用于多个单单元捕获

1. 将含有 100 μ0 μL 三氯硅烷的晶圆模具和称重盘放入干燥器（仅用于硅化），然后应用真空 （-85 kPa） 15 分钟。
   注:在PDMS铸造之前，用三氯硅烷对晶圆表面进行硅化，以产生疏水性表面特性，以便毫不费力地从晶圆PDMS模具中剥离。
2. 停止真空，然后在37°C下将干燥器中的晶圆模具（仅用于硅化）硅胶至少1小时。
3. 以 10:1 的比例混合 PDMS 碱基和 PDMS 固化剂。在 15 厘米的盘中将总共 20 克混合 PDMS 倒入晶圆模具上。
4. 将 15 厘米的盘子放入干燥器中，然后应用真空 （-85 kPa） 1.5 分钟。然后从干燥器中取出 15 厘米的盘子。在室温下保持20分钟。最后，用氮气去除PDMS中的残余气泡。
5. 将 15 厘米的盘子放在 65°C 的烤箱中 2-4 小时，以治愈 PDMS。
6. 从晶圆模具中取出 PDMS 复制品，然后使用 1.5 mm 内径和 0.5 mm 内径打孔器在 PDMS 上打孔 1.5 mm 入口和 0.5 mm 出口（图 1C）。
7. 用可拆卸胶带清洁 PDMS 副本和滑动表面，然后用氧气等离子体处理表面（100 W，14 s）。
8. 手动将 PDMS 副本与幻灯片对齐，并使它们相互接触。
9. 将 PDMS 滑块放在 65°C 烤箱中 1 天。
   注: 幻灯片和 PDMS 副本之间实现永久粘接以形成设备。
10. 将 PDMS 设备浸入充满磷酸盐缓冲盐水的容器中，并放入干燥器中。然后应用真空（-85 kPa）15分钟以去除气泡。
11. 将 PDMS 设备置于电池培养罩中，用紫外线（光波长:254 nm）对设备进行消毒 30 分钟。
12. 用培养基（含有1%抗生素和10%胎儿牛血清的DMEM-F12基础培养基培养基）更换PDMS设备缓冲液，并在4°C下孵育PDMS设备1天。这可以防止细胞粘附到 PDMS 表面。

3. 准备单细胞悬浮液

注:细胞类型包括人类淋巴内皮细胞（LECs）、表达WNT5B特异性shRNA（WNT5B sh4）的人类OSCC TW2.6细胞和载体对照（pLKO-GFP），这些细胞是从我们先前^的研究15中获得的。有关详细的种植步骤，请参阅我们以前的出版物。

1. 当细胞达到70-80%汇合时，去除培养基。然后用5mL的无菌PBS轻轻清洗细胞三次。
2. 在WNT5B sh4和pLKO-GFP细胞中加入1mL含有1μM荧光染料的DMEM-F12培养基（使用MV2培养基用于LEC），然后在室温下孵育细胞30分钟。
   注:LECs被染色为绿色氯氟辛二乙酸（CMFDA）染料，WNT5B sh4细胞沾有蓝色7-氨基-4-氯甲基二甲二甲二甲酯（CMAC）染料，pLKO-GFP细胞沾染红色Dil荧光染料。
3. 用5 mL的无菌PBS轻轻清洗细胞三次。
4. 取出 PBS 并添加 2 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（LED 为 0.05% 胰蛋白酶-EDTA）。
5. 在室温下孵育细胞4分钟，然后轻轻敲打组织培养盘，促进细胞分离。
6. 加入4 mL的DMEM-F12介质以分散WNT5B sh4和pLKO-GFP细胞（对于LEC，使用3 mL的MV2介质和1 mL的胰蛋白酶中和溶液）。然后将细胞转移到15 mL管中，在300 x g下离心3分钟。
7. 取出上清液，并轻轻地将细胞颗粒重新悬浮在 DMEM-F12 介质的 1 mL 中。使用标准Trypan蓝排除^方法16计算血细胞仪中的活细胞数。在DMEM-F12培养基中，以3 x 10⁵细胞/mL浓度制备1mL细胞悬浮液，然后将细胞保持在冰上，以防止细胞聚集。
   注:为了提高单细胞捕获效率，需要仔细准备单细胞悬浮液，并做好分离。

4. 多个单细胞捕获和三元单细胞培养

1. 在设备出口和注射器泵之间连接聚四氟乙烯 （PTFE） 管。取出介质，在PDMS装置的进气中加入浓度为3 x 10⁵细胞/mL的1 μL细胞悬浮液。
2. 通过注射器泵将细胞悬浮液以 0.3 μL/min 的流速加载到设备中（图 2A）。流量方向是从入口到出口。
   注:将细胞悬浮液添加到入口后立即加载，以防止细胞沉淀。
3. 在步骤 4.2 之后，将 1 μL 的 DMEM-F12 介质添加到 PDMS 器件的进气中，通过注射器泵将 DMEM-F12 介质以 0.3 μL/min 的流量加载到器件中（图 2B）。流量方向从入口流向出口。
4. 以 10 μL/min 的流速将 0.3 μL 的 DMEM-F12 介质通过注射器泵加载到器件中（图 2C）。流量方向从出口流向入口。
5. 重复步骤 4.1 到 4.4 以将其他单元类型加载到设备中。
6. 完成细胞捕获后，使用带有 4 倍透镜的显微镜对每个培养室进行成像。
   注:细胞的荧光发射用于识别和计算每个培养室中单个细胞的数量。
7. 拆下 PTFE 管，用聚烯烃胶带密封入口和出口，以创建封闭的培养系统。
8. 将 PDMS 设备移到 10 厘米培养盘中，并在 PDMS 设备周围添加 10 mL 无菌 PBS，以避免介质从设备中蒸发。
9. 将培养皿转移到培养箱（37°C，5% CO₂和 95% 湿度），用于三元单细胞培养。
10. 显微镜观察和拍摄细胞每12小时的生长。

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结果

该器件具有三层结构，如切割 PDMS 器件的横截面照片所示（图1A）。第一层包含连接文化室和旁路通道的捕获位点（宽度为 6.0 μm，高度为 4.6 μm）。培养室和通路通道之间的流动电阻差异导致细胞流入捕获位置并填充小路径的入口。在捕获位置捕获单元后，小路径的流量阻力增加，导致下一个传入的单元朝向并通过旁路通道到达下一个?...

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讨论

肿瘤微环境中各种细胞间的相互作用对^肿瘤17的进展起着重要作用。为了理解细胞-细胞相互作用的机制，共培养系统作为一种常见的分析方法。然而，多种细胞类型和细胞本身的异质性导致了实验的复杂性和分析困难。

流体动力穿梭芯片允许通过确定性方法在培养室中进行多个单元加载，而不受稀释方法和微孔平台中的泊森分布限制的限制。通过提供高三?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100