미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

요약

이 보고서는 여러 단일 세포의 고효율 페어링 및 현미경 분석을 달성할 수 있는 단일 세포 배양 실험을 설정하는 미세 유체 칩 기반 방법을 설명합니다.

초록

세포 공동 배양 시험은 암을 포함하여 질병의 생물학을 더 잘 이해하기 위하여 다른 세포 모형 사이 세포 세포 상호 작용을 공부를 위해 널리 이용되었습니다. 그러나, 세포 하위 집단의 이질성이 평균 값에 의해 가려지기 때문에 기존의 공동 배양 시스템을 사용하여 고도로 이질적인 세포 집단에서 세포 간 상호 작용의 복잡한 메커니즘을 명확히하는 것은 어렵다; 종래의 공동 배양 시스템은 모집단 신호를 설명하는 데만 사용될 수 있지만 개별 세포 동작을 추적할 수 없습니다. 더욱이, 종래의 단세포 실험 방법은 푸아송 분포 때문에 세포 조작에서 낮은 효율을 가지고 있다. 마이크로 패브릭 장치는 높은 처리량으로 단일 셀을 정확하게 조작할 수 있고 샘플 및 시약 소비를 줄일 수 있기 때문에 단일 셀 연구를 위한 새로운 기술입니다. 여기서, 우리는 다중 단세포 공동 배양을 위한 미세 유체 칩의 개념 그리고 응용을 기술합니다. 이 칩은 배양 챔버에서 여러 유형의 단일 세포를 효율적으로 캡처할 수 있습니다(~46%). 및 단일 세포 수준에서 세포-세포 상호작용 하에서 세포의 행동(예를 들어, 이동, 증식 등)을 연구하는데 유용한 충분한 배양 공간을 갖는다. 림프내피 세포 및 경구 편평 상피 세포 암종은 살아있는 다중 단세포 상호작용 연구를 위한 미세유체 플랫폼에서 단일 세포 공동 배양 실험을 수행하기 위해 사용되었다.

서문

단일 세포의 상이한 유형의 효율적인 포획 및 충분한 배양 공간을 제공하는 것은 단일 세포의 여러 유형의 단일 세포 공동 배양 실험에 필요합니다^1. 희석을 제한하는 것은 필요한 장비의 낮은 비용으로 인해 이러한 실험을 위해 단일 세포를 제조하는 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 푸아송 분포 제한으로 인해 최대 단일 셀 획득 확률은 37%에 불과하여 실험 작업이 힘들고 시간이 많이 소요됩니다^2. 이에 반해, 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 이용하여 푸아송 분포 한계를 극복할 수 있고 단일 세포를 고효율로^{준비한다(3).} 그러나 FACS는 비용이 많이 드는 계측 및 유지 보수 비용으로 인해 일부 실험실에서 접근하지 못할 수 있습니다. 마이크로 패브릭 장치는 최근 단일 셀 트래핑^4,단일 셀 페어링⁵및 단일 세포 배양 응용 을 위해 개발되었습니다. 이러한 장치는 단일 셀^6을정확하게 조작하거나, 높은 처리량의 실험을 수행하거나, 샘플 및 시약 소비를 줄이는 능력에 따라 유리합니다. 그러나, 현재 미세 유체 장치를 가진 다중 세포 모형을 가진 단세포 동시 배양 실험을 수행하는 것은 푸아송 분포^1,7,8,또는 무능력의 한계 때문에 아직도 도전적입니다 장치는 단일 셀^{4,5,6,9,10의}두 가지 유형 이상을 캡처합니다.

예를 들어, Yoon et al.은 세포-세포 상호작용 연구를 위한 미세유체 장치를^{보고한 11.} 이 장치는 확률적 방법을 사용하여 세포를 하나의 챔버에 페어링합니다. 그러나 장치 구조의 기하학적 제한으로 인해 두 개의 서로 다른 셀 유형의 페어링만 달성할 수 있습니다. Lee et al.의 또 다른 보고서는 단일^셀(12)을캡처하고 페어링하는 결정적인 방법을 시연했습니다. 이 장치는 결정적 방법에 의해 페어링 효율을 증가하지만 셀을 페어링하는 데 필요한 연장된 작동 시간에 의해 제한됩니다. 구체적으로, 제2 세포 포획은 24h 이후 의 표면에 부착된 제1 포획된 세포가 단일^{세포(13)의}두 가지 유형을 포착하는 액적계 미세유체 장치를 보고한 후에만 수행될 수 있다. 우리는 액적 계 미세 유체 장치가 여전히 푸아송 분포에 국한되어 있고 부착되지 않은 세포에서만 사용할 수 있으며 재배 과정에서 배양 용액을 변경할 수 없다는 것을 알 수 있습니다.

이전에는 결정적 유체역학적 힘을 활용하여 여러 유형의 단일 세포를 배양 챔버로 포착하고 세포 공동 배양 실험을 수행하여 분석할 수 있는 미세 유체 "유체 역학 적 shuttling chipschip"을 개발했습니다. 세포 세포 상호 작용의 밑에 개별적인 세포 이동 행동^14. 유체역학적 shuttling 칩은 각각 뱀 바이패스 채널, 캡처 사이트 및 배양 챔버를 포함하는 배열된 단위 세트를 포함한다. 서펜타인 바이패스 채널과 배양 챔버 사이의 유동 저항의 차이를 이용하여, 특별히 설계된 작동 절차, 상이한 유형의 단일 세포가 배양 챔버내로 반복적으로 포획될 수 있다. 특히, 배양 챔버의 충분한 공간은 세포가 세포 를 포착하는 동안 플러시되는 것을 방지 할뿐만 아니라 세포가 확산, 증식 및 마이그레이션할 수있는 충분한 공간을 제공하여 살아있는 단일 세포 상호 작용을 관찰 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이 장치의 생산과 자세한 프로토콜 단계에 중점을 둡니다.

프로토콜

1. 부드러운 석판화에 의한 웨이퍼 금형 의 제조

참고: 마스크 패턴 데이터는 이전 발행물^14에서사용할 수 있습니다.

1. 4인치 실리콘 웨이퍼를 120°C 오븐에서 15분 동안 탈수합니다.
2. 스핀 코트 4 g의 SU-8 2 네거티브 포토레지스트를 1,000 rpm에서 4인치 실리콘 웨이퍼에 30s의 5 μm 두께층(레이어 #1)을 생성한다.
3. 소프트 베이킹 층을 65°C 핫플레이트상에 1분간 #1 후 #1 95°C 핫플레이트로 3분간 옮김을 옮김을 전달합니다.
4. 실온으로 #1 냉각층은 반자동 마스크 얼라이너의 홀더에 놓고 크롬 도금 포토마스크(캡처 사이트 레이어)#1 레이어에 정렬합니다.
5. 150 mJ /^cm2의용량으로 365 nm UV 광으로 #1 층을 노출하십시오.
6. 65°C 핫플레이트에서 #1 층을 제거하고 1분간 65°C 핫플레이트에서 굽습니다 #1.
7. 층을 실온으로 #1 식힙니다. 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 용액에 담그어 교차되지 않은 포토레지스트를 2분 동안 씻어냅니다. 질소 가스로 부드럽게 건조하여 층 #1 정렬 마크를 드러냅니다.
8. 접착제 테이프에 의해 정렬 마크에 #1 층을 커버, 스핀 코트 4 g의 SU-8 10 네거티브 포토 레지스트 층 #1 층 1,230 rpm에 대 한 30 s25 μm 두께의 층 #2 만들 수 있습니다.
9. 테이프를 제거하고, 부드러운 베이킹 층을 65°C 핫플레이트상에 3분간 #2 후, #2 95°C 핫플레이트로 7분간 옮니다.
10. 실온으로 #2 냉각층, 반자동 마스크 정렬기의 홀더에 레이어 #2 놓고, 크롬 도금 포토마스크(바이패스 채널 레이어)#2 레이어 #1 정렬 마크에 정렬합니다.
11. 200 mJ /^cm2의용량으로 365 nm UV 광으로 #2 층을 노출하십시오.
12. 65°C 핫플레이트에서 #2 층과 후 구우기를 1분간 제거하고 #2 95°C 핫플레이트로 3분간 옮김을 옮김을 옮김.
13. 실온으로 #2 냉각층, 접착제 테이프로 #1 정렬 마크를 커버. 스핀 코트 4 g의 SU-8 2050 네거티브 포토레지스트를 1,630 rpm에서 레이어에 #2 30s의 100 μm 두께의 층 #3 생성합니다.
14. 테이프를 제거하고, 부드러운 베이킹 층을 65°C 핫플레이트에 5분간 #3 후, #3 95°C 핫플레이트로 20분간 옮니다.
15. 실온으로 #3 냉각층, 반자동 마스크 정렬기의 홀더에 #3 층을 놓고, 크롬 도금 포토마스크(culture chamber layer)#3 레이어 #1 정렬 마크에 정렬한다.
16. 240 mJ /^cm2의용량으로 365 nm UV 광으로 #3 층을 노출하십시오.
17. 65°C 핫플레이트에서 #3 층을 제거하고 5분간 65°C 핫플레이트에서 후구 #3를 합니다.
18. 실온으로 #3 냉각층. 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 용액에 담그고 교차되지 않은 포토레지스트를 10분 동안 씻어내고 질소 가스로 부드럽게 건조시다.

2. 다중 단세포 포획을 위한 PDMS 장치 준비

1. 웨이퍼 몰드와 100 μL의 트리클로로실란을 함유한 계량 접시를 건조기(실라화용)에 놓고 진공(-85kPa)을 15분 동안 도포합니다.
   참고: 트리클로로실란으로 웨이퍼 표면을 실란화하여 PDMS 주조 전에 소수성 표면 특성을 생성하여 웨이퍼 PDMS 금형에서 쉽게 벗겨낼 수 있습니다.
2. 진공을 중지한 다음, 적어도 1시간 동안 37°C에서 건조기(실란화에만)에서 웨이퍼 몰드를 실라니화한다.
3. PDMS 염기 및 PDMS 경화제를 10:1의 비율로 혼합합니다. 총 20g의 혼합 PDMS를 웨이퍼 몰드에 15cm 접시에 붓습니다.
4. 15cm 접시를 데시케이터에 넣고 진공(-85kPa)을 1.5분 동안 바갑니다. 그런 다음 건조기에서 15cm 접시를 제거합니다. 실온에서 20분 동안 보관하십시오. 마지막으로, 질소 가스로 PDMS의 잔류 기포를 제거합니다.
5. PDMS를 치료하기 위해 2-4 시간 동안 65 °C에서 오븐에 15cm 접시를 놓습니다.
6. 웨이퍼 몰드에서 PDMS 복제본을 제거한 다음 1.5 mm 내경 및 0.5 mm 내경 펀처를 사용하여 PDMS상에 1.5 mm 입구 및 0.5 mm 출구를 펀치합니다(그림1C).
7. PDMS 복제본과 슬라이드 표면을 탈착식 테이프로 청소한 다음 산소 플라즈마로 표면을 처리합니다(14s의 경우 100W).
8. PDMS 복제본을 슬라이드에 수동으로 정렬하고 서로 접촉하게 합니다.
9. PDMS 슬라이드를 65°C 오븐에 1일 동안 놓습니다.
   참고: 슬라이드와 PDMS 복제본 간의 영구적인 결합은 장치를 형성하기 위해 달성됩니다.
10. PDMS 장치를 인산완식염염수로 채워진 용기에 담그고 건조기안에 넣습니다. 그런 다음 진공 (-85 kPa)을 15 분 동안 적용하여 기포를 제거하십시오.
11. PDMS 장치를 세포 배양 후드에 놓고 30 분 동안 UV 광 (광 파장 : 254 nm)으로 장치를 살균하십시오.
12. PDMS 장치 완충액을 배지(1% 항생제 및 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM-F12 기저 배지)로 교체하고 PDMS 장치를 1일 동안 4°C에서 배양합니다. 이렇게 하면 세포가 PDMS 표면에 준수되는 것을 방지할 수 있습니다.

3. 단세포 현탁액의 준비

참고: 세포 유형은 인간 림프내피 세포(LECs), WNT5B 특이적 shRNA(WNT5B sh4) 및 벡터 대조군(pLKO-GFP)을 발현하는 인간 OSCC TW2.6 세포를 포함하며, 이는 이전 연구^15에서수득되었다. 자세한 재배 단계는 이전 간행물을 참조하십시오.

1. 세포가 70-80% 합류를 달성할 때 배양 배지를 제거한다. 그런 다음 멸균 PBS 5 mL로 세포를 세 번 부드럽게 씻으십시오.
2. WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포에 1 μM 형광 염료를 함유한 DMEM-F12 배지 1 mL을 넣고 (LEC에 MV2 배지사용) 실온에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
   참고: LEC는 녹색 클로로메틸플루오레세인 디아세테이트(CMFDA) 염료로 염색하였고, WNT5B sh4 세포는 청색 7-아미노-4-클로로메틸코마린(CMAC) 염료 및 pLKO-GFP 세포로 염색하였고 적색 딜 형광염료로 염색하였다.
3. 멸균 PBS 5 mL로 세포를 세 번 부드럽게 씻으십시오.
4. PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA(0.05% 트립신-EDTA용 LEC용 트립신-EDTA)의 2mL를 추가합니다.
5. 실온에서 4 분 동안 세포를 배양 한 다음 조직 배양 접시를 부드럽게 탭하여 세포 분리를 촉진합니다.
6. WNT5B sh4 및 pLKO-GFP 세포를 분산시키기 위해 DMEM-F12 배지 4mL를 추가합니다(LEC의 경우 MV2 배지 3mL, 트립신 중화제 용액 1mL 사용). 그런 다음 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 합니다.
7. 상급체를 제거하고 DMEM-F12 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다. 표준 Trypan Blue 배제 방법^16을사용하여 혈전계에서 살아있는 세포의 수를 계산합니다. DMEM-F12 배지에서 3 x 10⁵ 세포/mL 농도에서 1 mL의 세포 현탁액을 준비한 다음 세포 응집을 방지하기 위해 얼음 에 세포를 보관하십시오.
   참고: 단세포 포획 효율을 향상시키기 위해서는 잘 해리된 단일 셀 현탁액을 신중하게 준비해야 합니다.

4. 다중 단세포 포획 및 삼중 단세포 배양

1. 장치의 출구와 주사기 펌프 사이에 폴리 테트라 플루오로에테네(PTFE) 튜브를 연결합니다. 배지를 제거하고 PDMS 장치의 입구에 3 x 10⁵ 세포/mL의 농도로 1 μL의 세포 현탁액을 추가합니다.
2. 0.3 μL/min의 유량으로 주사기 펌프에 의해 셀 현탁액을 장치에 로드합니다(그림2A). 흐름 방향은 입구에서 출구로 이동합니다.
   참고: 셀 서스펜션을 입구에 넣은 직후에 로드하여 세포 침전을 방지합니다.
3. 4.2단계 후 PDMS 장치의 입구에 DMEM-F12 배지 1 μL을 추가합니다.0.3 μL/min의 유량으로 주사기 펌프에 의해 DMEM-F12 배지를 장치에 로드합니다(그림2B). 유입구로부터 출구로 유동방향이 흐르고 있었다.
4. 10 μL/min의 유량으로 주사기 펌프에 의해 DMEM-F12 배지의 0.3 μL을 장치에 적재하십시오(그림2C). 흐름 방향은 출구로부터 입구로 흐르고 있었다.
5. 4.1에서 4.4 단계반복하여 다른 셀 유형을 장치에 로드합니다.
6. 세포 포획을 완료한 후, 4x렌즈가 있는 현미경을 사용하여 각 배양 챔버를 이미지화합니다.
   참고: 세포의 형광 방출은 각 배양 챔버에서 개별 세포의 수를 식별하고 계산하는 데 사용되었다.
7. PTFE 튜브를 제거하고 입구와 출구를 폴리올레핀 테이프로 밀봉하여 폐쇄형 배양 시스템을 만듭니다.
8. PDMS 장치를 10cm 배양 접시로 옮기고 PDMS 장치 주위에 10 mL의 멸균 PBS를 추가하여 장치에서 배지의 증발을 방지합니다.
9. 배양 접시를 삼중 단세포 배양을 위해 인큐베이터(37°C, 5%_CO2 및 95% 습도)로 옮김을 옮니다.
10. 현미경으로 관찰하고 12 시간마다 세포 성장을 촬영합니다.

결과

이 장치는 컷 PDMS 장치의 단면 사진에 도시된 바와 같이 3층 구조를갖는다(도 1A). 첫 번째 레이어에는 배양 챔버와 바이패스 채널을 연결하는 캡처 사이트(폭 6.0 μm 및 높이 4.6 μm)가 포함되어 있습니다. 배양 챔버와 바이패스 채널 사이의 유동 저항의 차이로 인해 세포가 포획 위치로 흐르고 작은 경로의 입구를 채웁니다. 포획 위치에서 ?...

토론

종양 미세환경에서 다양한 세포의 세포간 상호작용은^{종양(17)의}진행에 중요한 역할을 한다. 세포 세포 상호 작용의 메커니즘을 이해하기 위해, 공동 배양 시스템은 일반적인 분석 방법으로 사용된다. 그러나, 다중 세포 모형 및 세포 자체의 이질성은 실험적인 복잡성 및 분석 어려움으로 이끌어 냈습니다.

유체역학적 shuttling 칩은 희석 방법 및 마이크로웰 플...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100