Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Riepilogo

Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l'abbinamento ad alta efficienza e l'analisi microscopica di più cellule singole.

Abstract

I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l'eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l'applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l'interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.

Introduzione

L'acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole¹. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l'operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo². Al contrario, l'utilizzo dello smistamento delle celle attivate a fluorescenza (FACS) può superare la limitazione della distribuzione di Poisson per preparare in modo elevato le singole celle³. Tuttavia, FACS potrebbe non essere accessibile ad alcuni laboratori a causa di costosi costi di strumentazione e manutenzione. I dispositivi microfabbricati sono stati recentemente sviluppati per l'intrappolamento a cella singola^{di 4}, l'abbinamento a cella singola⁵e le applicazioni di coltura a cella singola. Questi dispositivi sono vantaggiosi in base alla loro capacità di manipolare con precisione singole celle⁶, eseguire esperimenti ad alto rendimento o ridurre il consumo di campioni e reagenti. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti di cocoltura a cella singola con più tipi di cellule con gli attuali dispositivi microfluidici è ancora difficile a causa della limitazione della distribuzione di Poisson^1,7,8, o l'incapacità di i dispositivi per catturare più di due tipi di celle singole^4,5,6,9,10.

Per esempio, Yoon et al. ha segnalato un dispositivo microfluidico per lo studio di interazione cellulare-cellula¹¹. Questo dispositivo utilizza il metodo probabilistico per accoppiare le celle in una camera. Tuttavia, può ottenere solo l'associazione di due diversi tipi di cella a causa di restrizioni geometriche nella struttura del dispositivo. Un altro rapporto di Lee et al. ha dimostrato un metodo deterministico per catturare e accoppiare singole celle¹². Questo dispositivo aumenta l'efficienza di accoppiamento con il metodo deterministico, ma è limitato dal tempo di funzionamento prolungato richiesto per accoppiare le celle. In particolare, l'acquisizione della seconda cella può essere eseguita solo dopo che la prima cella catturata è stata attaccata alla superficie dopo che24 h. Possiamo riscontrare che il dispositivo microfluidico a base di gocciolamento è ancora limitato alla distribuzione di Poisson e può essere utilizzato solo su cellule non collegate, e non è possibile modificare la soluzione di coltura durante il processo di coltivazione.

In precedenza, abbiamo sviluppato un "chip di chiusura idrodinamico" microfluidico che utilizza forze idrodinamiche deterministiche per catturare più tipi di cellule singole nella camera di coltura e successivamente può eseguire esperimenti di cocoltura cellulare per analizzare comportamento di migrazione delle singole cellule nelle interazioni cellula-cellula¹⁴. Il chip di chiusura idrodinamico comprende un array di unità che contengono ciascuno un canale di passaggio serpentino, un sito di cattura e una camera di coltura. Utilizzando la differenza di resistenza al flusso tra il canale di passaggio serpentino e la camera di coltura, e una procedura operativa appositamente progettata, diversi tipi di singole cellule possono essere ripetutamente catturati nella camera di coltura. In particolare, l'ampio spazio della camera di coltura può non solo impedire che la cellula venga arrossata durante la cattura delle cellule, ma anche fornire spazio sufficiente per le cellule per diffondersi, proliferare e migrare, consentendo l'osservazione di interazioni vive a singola cellula. In questo articolo, ci concentriamo sulla produzione di questo dispositivo e passaggi di protocollo dettagliati.

Protocollo

1. Fabbricazione di uno stampo di wafer mediante litografia morbida

NOTA: i dati del modello maschera sono disponibili nella pubblicazione precedente¹⁴.

1. Disidratare un wafer di silicio da 4 pollici in un forno a 120 gradi per 15 min.
2. Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2 fotoresist negativo su un wafer di silicio da 4 pollici a 1.000 giri/m per 30 s per creare uno strato di 5 m di spessore (strato #1).
3. Cuocere lo strato morbido #1 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e poi trasferire lo strato #1 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
4. Strato freddo #1 a temperatura ambiente, posizionarlo sul supporto dell'allineatore maschera semi-automatico e allineare con il livello #1 fotomaschera cromata (strato di sito di cattura).
5. Esponi lo strato #1 con una luce UV a 365 nm a una dose di 150 mJ/cm².
6. Togliere lo strato #1 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min #1.
7. Strato fresco #1 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil del glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 2 min #1.
8. Coprire lo strato #1 segno di allineamento con un nastro adesivo, ruotare il cappotto 4 g di SU-8 10 fotoresist negativo sullo strato #1 a 1.230 giri per 30 s per creare uno strato di 25 m di spessore #2.
9. Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #2 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 3 min, quindi trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 7 min.
10. Strato freddo #2 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #2 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #2 fotomaschera placcata in cromo (strato di canale di bypass) al livello #1 segno di allineamento.
11. Esponi lo strato #2 con una luce UV a 365 nm a una dose di 200 mJ/cm².
12. Togliere lo strato #2 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 1 min e trasferire lo strato #2 a una piastra calda di 95 gradi per 3 min.
13. Strato fresco #2 a temperatura ambiente e coprire lo strato #1 segno di allineamento con nastro adesivo. Cappotto di rotazione 4 g di SU-8 2050 fotoresist negativo su #2 a 1.630 rpm per 30 s per creare uno strato di 100 m di spessore #3.
14. Togliere il nastro, strato di cuocere morbido #3 su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min, quindi trasferire lo strato #3 a una piastra calda di 95 gradi per 20 min.
15. Strato freddo #3 alla temperatura ambiente, posizionate il livello #3 sul supporto dell'allineatore semiautomatico della maschera e allineate il livello #3 fotomaschera placcata in cromo (strato della camera di coltura) al livello #1 segno di allineamento.
16. Esporre i #3 di strati con luce UV a 365 nm a una dose di 240 mJ/cm².
17. Togliere lo strato #3 dall'allineatore e post-cuocere su una piastra calda di 65 gradi centigradi per 5 min #3.
18. Strato fresco #3 a temperatura ambiente. Immergere in una soluzione di eteato monomeil di glicole propilene per lavare via il fotoresist non collegato per 10 minuti e asciugare delicatamente con gas di azoto.

2. Preparazione del dispositivo PDMS per l'acquisizione di più celle

1. Mettere lo stampo del wafer e la teglia contenente 100 -L di triclorosilalla in un desiccatore (solo per insilanizzazione) e applicare un vuoto (-85 kPa) per 15 min.
   NOTA: Silanizzare la superficie del wafer con trichlorosilane per creare proprietà di superficie idrofobiche prima della colata PDMS in modo che possa essere staccata senza sforzo dallo stampo wafer PDMS.
2. Fermare il vuoto, quindi insidiare lo stampo del wafer nel desiccatore (solo per la silanizzazione) a 37 gradi centigradi per almeno 1 h.
3. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS in un rapporto di 10:1. Versare un totale di 20 g di PDMS mista sullo stampo del wafer in un piatto di 15 cm.
4. Mettere il piatto di 15 cm in un desiccatore e applicare il vuoto (-85 kPa) per 1,5 min. Quindi rimuovere il piatto di 15 cm dal desiccatore. Conservare per 20 min a temperatura ambiente. Infine, rimuovere le bolle d'aria residue nel PDMS con gas di azoto.
5. Mettere il piatto di 15 cm in forno a 65 gradi centigradi per 2-4 h per curare la PDMS.
6. Rimuovere la replica PDMS dallo stampo del wafer, quindi eseguire un'uscita da 1,5 mm e una presa di 0,5 mm sul PDMS utilizzando un diametro interno di 1,5 mm e un perforatore di diametro interno di 0,5 mm (Figura 1C).
7. Pulire la replica PDMS e la superficie di scorrimento con nastro rimovibile e quindi trattare la superficie con plasma di ossigeno (100 W per 14 s).
8. Allineare manualmente le repliche PDMS con la diapositiva e metterle in contatto tra loro.
9. Mettere la vetritta PDMS in un forno a 65 gradi centigradi per 1 giorno.
   NOTA: L'incollaggio permanente tra la diapositiva e la replica PDMS si ottiene per formare il dispositivo.
10. Immergere il dispositivo PDMS in un contenitore pieno di fosfato tampone salina e metterlo in un desiccatore. Quindi applicare il vuoto (-85 kPa) per 15 min per rimuovere le bolle d'aria.
11. Posizionare il dispositivo PDMS in una cappa di coltura cellulare e sterilizzare il dispositivo con luce UV (lunghezza d'onda luminosa: 254 nm) per 30 min.
12. Sostituire il buffer del dispositivo PDMS con un supporto medio (supporto basale DMEM-F12 contenente 1% di antibiotici e 10% siero bovino fetale) e incubare il dispositivo PDMS a 4 gradi centigradi per 1 giorno. Ciò impedisce alle cellule di aderire alla superficie PDMS.

3. Preparazione di una sospensione a cella singola

NOTA: I tipi di cellule cellulari includono cellule endotiliali linfatiche umane (LEC), cellule OSCC TW2.6 umane che esprimono shRNA specifico wnT5B (WNT5B sh4) e controllo vettoriale (pLKO-GFP) che sono state ottenute dal nostro studio precedente¹⁵. Si prega di fare riferimento alla nostra pubblicazione precedente per le fasi di coltivazione dettagliate.

1. Rimuovere il mezzo di coltura quando le cellule raggiungono 70-80% confluenza. Quindi lavare delicatamente le cellule con 5 mL di PBS sterile tre volte.
2. Aggiungere 1 mL di mezzo DMEM-F12 contenente 1 colorante fluorescente in celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (utilizzare il mezzo MV2 per i LEC) e quindi incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
   NOTA: le cellule leC sono state macchiate con colorana diaceta cloromemetilofluoresceina verde (CMFDA), le cellule sh4 WNT5B sono state macchiate con colorante fluorescente blu 7-amino-4-chloromethylcouin (CMAC) e cellule pLKO-GFP sono state macchiate con colorante fluorescente Dil rosso.
3. Lavare delicatamente le celle con 5 mL di PBS sterile tre volte.
4. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA per LEC).
5. Incubare le cellule per 4 min a temperatura ambiente e quindi toccare delicatamente il piatto di coltura del tessuto per promuovere il distacco delle cellule.
6. Aggiungere 4 mL di cellule medie DMEM-F12 per disperdere le celle WNT5B sh4 e pLKO-GFP (per i LEC utilizzare 3 mL di MV2 medio e 1 mL di soluzione di ritorizzante). Quindi trasferire le cellule in un tubo da 15 mL, e centrifugare a 300 x g per 3 min.
7. Rimuovere il supernatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di Mezzo DMEM-F12. Contare il numero di celle vive in un emocitometro utilizzando il metodo di esclusione Trypan Blue standard¹⁶. Preparare 1 mL di sospensione cellulare a 3 x 10⁵ celle/mL di concentrazione nel mezzo DMEM-F12, quindi mantenere le celle sul ghiaccio per impedire l'aggregazione delle cellule.
   NOTA: Per migliorare l'efficienza di acquisizione a una singola cella, è necessaria un'attenta preparazione della sospensione a cella singola con una sospensione ben dissociata.

4. Cattura multipla a cella singola e tripla coltura a cella singola

1. Collegare un tubo poli-tetrafluoroethene (PTFE) tra la presa del dispositivo e la pompa della siringa. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 lofde di sospensione cellulare ad una concentrazione di 3 x 10⁵ celle/mL nell'ingresso del dispositivo PDMS.
2. Caricare la sospensione cellulare nel dispositivo con una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2A). La direzione del flusso va dall'ingresso alla presa.
   NOTA: Caricare immediatamente dopo aver aggiunto la sospensione cellulare nell'ingresso per evitare la sedimentazione cellulare.
3. Aggiungete 1 -L di Mezzo DMEM-F12 nell'ingresso del dispositivo PDMS dopo il passaggio 4.2.Caricare il supporto DMEM-F12 nel dispositivo con una pompa di siringa a una velocità di flusso di 0,3 l/min (Figura 2B). La direzione del flusso scorreva dall'ingresso alla presa.
4. Caricare 0,3 L di DMEM-F12 medio nel dispositivo da una pompa di siringa ad una velocità di flusso di 10 L/min (Figura 2C). La direzione di flusso scorreva dalla presa all'ingresso.
5. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per caricare altri tipi di cella nel dispositivo.
6. Dopo aver completato la cattura cellulare, utilizzare un microscopio con lente 4x per visualizzare ogni camera di coltura.
   NOTA: Le emissioni di fluorescenza delle cellule sono state utilizzate per identificare e contare il numero di singole cellule in ogni camera di coltura.
7. Rimuovere il tubo PTFE e sigillare l'uscita e la presa con nastro adesivo per creare un sistema di coltura chiuso.
8. Spostare il dispositivo PDMS in un piatto di coltura di 10 cm e aggiungere 10 mL di PBS sterile intorno al dispositivo PDMS per evitare l'evaporazione del mezzo dal dispositivo.
9. Trasferire il piatto di coltura in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% di CO₂ e 95% di umidità) per una coltura a tripla cellula.
10. Osservare e fotografare la crescita delle cellule ogni 12 ore.

Risultati

Il dispositivo ha una struttura a tre strati come mostrato dalla fotografia trasversale di un dispositivo PDMS tagliato (Figura 1A). Il primo strato contiene un sito di cattura (6,0 m di larghezza e 4,6 m di altezza) che collega la camera di coltura e il canale di passaggio. La differenza di resistenza al flusso tra la camera di coltura e il canale by-pass fa sì che le cellule scorra nella posizione di cattura e riempiono l'ingresso del picc...

Discussione

Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore¹⁷. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l'eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.

Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di pi?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape	3M Company	9795R
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye	Invitrogen	C2110
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium	Gibco	11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2	PromoCell	C-22022
Fetal bovine serum Hyclone	Thermo	SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )	Hamilton	80630	100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15075	with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15071	with 0.5mm inner-diameter
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
Oxygen plasma	NORDSON MARCH	AP-300
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
SU-8 10 negative photoresist	MicroChem	Y131259
SU-8 2 negative photoresist	MicroChem	Y131240
SU-8 2050 negative photoresist	MicroChem	Y111072
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution	Gibco	R-002-100