用于初级肝细胞保存的散装滴滴 Vit;

摘要

本手稿描述了一种用于大量大鼠肝细胞的无冰冷冻保存方法，即原生细胞以低浓度的预孵化，并在大液滴中进行玻璃化。

摘要

硝化是一种有前途的无冰替代品，适用于生物样品的经典慢冷冻（约1°C/min）冷冻保存。玻璃化需要极快的冷却速率，以实现水向玻璃相的过渡，同时避免有害的冰层形成。虽然使用冷冻保护剂（CPA）预孵育可以降低生物样品的关键冷却速率，但通常需要高浓度，通过保鲜法实现无冰冷冻保存。因此，由于CPA毒性，硝化受到阻碍，并仅限于可快速冷却的小样品。最近证明，这些固有的局限性可以通过散装滴滴的体积化来克服。使用这种新方法，细胞首先以低细胞内CPA浓度预育。利用快速渗透脱水，细胞内CPA直接集中在化化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体装置中进行，并与连续高通量生成大尺寸液滴集成，这些液氮被玻璃化。这种无冰冷冻保存方法，与传统的慢冷冻冷冻保存相比，适用于大细胞数量，可增强肝细胞活力和代谢功能。本手稿详细介绍了成功散装滴滴滴化的方法。

引言

肝细胞冷冻保存后细胞活力和代谢功能丧失仍然是限制临床^{应用1、2、3}的主要问题。肝细胞冷冻保存的基准方法是缓慢冷冻，通过用CPA（二甲基磺胺[DMSO]、葡萄糖和白蛋白）和随后控制速率冷冻（约1°C/min）预育肝细胞来执行低温^4，5。尽管许多报告优化，CPA毒性加上有害的渗透不平衡在冻结和机械应力的结冰形成仍然是缓慢^冻结6，7的基本缺点。

与缓慢冻结一个优势，因为水直接相向玻璃^状态6完全避免了由于结冰造成的伤害。然而，要达到纯水的玻璃过渡温度（-137 °C），水必须以每秒100万摄氏度（即临界冷却速率）的速度冷却，以避免冰形成高于玻璃过渡^温度8.添加 CPA 可以降低临界冷却速率，提高水溶液 9 的玻璃过渡^温度。然而，即使注册会计师的浓度很高（例如，40%v/v DMSO 或更高），快速冷却速率仍需要快速冷却率才能成功进行硝化^8、9。

所需的冷却速率和高 CPA 浓度导致两个主要的 Vitit 化缺点。首先，要实现快速冷却，样品必须具有较低的热质量。其次，为了达到高CPA浓度，同时避免渗透伤害，CPA必须缓慢引入，并在细胞内和细胞外^隔间6之间完全平衡。这增加了细胞接触有毒注册会计师的时间。总之，这使得硝化成为一个繁琐的过程，一次只能有几个小样本（微升）。滴滴五硝化已被提出作为这些限制的潜在解决方案。通过将小细胞含量液滴（纳米升）暴露于液氮中，冷却率显著提高，从而使CPA浓度显著降低10、11、12^，13，14.虽然多个高频滴产生喷嘴可能同时使用，但极小的滴大小将吞吐量限制在每分钟¹⁰微升，从而排除了大电池的有效玻璃化以每分钟毫升为单位的处理速率较高。

最近证明，这些固有的局限性的五化可以通过散装滴硝^化15克服。这种新方法利用快速渗透脱水来浓缩细胞内CPA浓度为7.5%v/v乙二醇和DMSO，紧接在硝化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体设备中通过肝细胞短暂接触高细胞外CPA浓度进行。虽然这种暴露会导致快速渗透脱水，但高CPA浓度太短，无法扩散到细胞中。脱水后，细胞立即被装在液氮直接玻璃化的液滴中。该方法消除了在细胞内完全接受高CPA浓度的需要，而高细胞外CPA浓度使大尺寸液滴的硝化成为可能化，从而以最小的CPA毒性产生高通量。

滴滴玻璃化提高保存后的直接和长期生存能力，以及原发性大鼠肝细胞的形态和代谢功能，而传统的冷冻保存慢^冷冻15。本手稿提供了原发性大鼠肝细胞大体积滴滴化的方法细节。

研究方案

该协议的主要肝细胞分离由美国马萨诸塞州波士顿马萨诸塞总医院的细胞资源核心 （CRC） 执行。动物协议（#2011N000111）得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 散装滴滴滴化

1. 准备点光化解决方案。
   1. 将40毫克牛血清白蛋白（BSA）加入威斯康星大学溶液（UW）的17.0 mL，使硝化溶液1（V1）。使用 0.22 μm 过滤器对 V1 溶液进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。
      注:UW是一种常用的器官保存解决方案。它含有50克/L羟基淀粉， 35.83 g/L 乳酸，3.4 g/L 磷酸钾单基，1.23 g/L 硫酸镁七分水合物，17.83 克/L 五氟化水合物，1.34 克/升腺苷，0.136 g/L 异丙醇，0.992 g/L 总谷胱甘肽，5.61 克/L 氢氧化钾和氢氧化钠，将pHH调整为7.4。
   2. 结合7.0 mL的UW、6.5 mL的DMSO、6.5 mL的乙二醇（EG）、40毫克的BSA和5.48克蔗糖，制成葡萄糖化溶液2（V2）。使用 0.22 μm 过滤器对 V2 溶液进行无菌过滤。在 3 mL 注射器中装载 3.5 mL 无菌过滤 V2 溶液，并储存在 4°C 下。
      注:为便于解散《全面和平协定》，准备了数量超过所需数量的解决方案。
2. 准备散装滴滴滴化装置。
   1. 要准备混合针，首先沿混合针的外灰色套筒的一侧切割，然后弯曲套筒以将其从混合针中取出。
   2. 将两个 25 mm 硅胶管部分滑到混合针的入口上，用胶水固定其位置（图 1A）。
   3. 将针切割至 20 mm 的长度（即内混合螺旋的长度），如图1A所示。
      注:混合针的长度与针内的体积成正比，因此可以改变，以控制肝细胞对高CPA浓度溶液的暴露时间。
   4. 将混合针的切断出口插入 20 G 注射针中（图 1B）。
      注: 注射针尺寸影响液滴大小。
   5. 通过高压灭菌对混合针组件进行消毒。
   6. 用液氮填充无菌的德瓦尔。在将德瓦尔置于无菌层流细胞培养罩之前，用异丙醇对德瓦尔的外侧进行消毒。
      注:在液滴直接暴露于液氮时，污染是一个重要的考虑因素。虽然现行协议中没有使用非消毒液氮的污染，但液氮可以过滤或辐照，以确保不育（
   7. 将外径与液氮Dewar内径相同的漏斗插入50 mL锥形管中，以创建液滴收集装置（图1C=E）。
   8. 将液氮液滴收集装置浸入液氮中，使用大钳子将其压到其最终的垂直位置。确保锥形管位于 Dewar 底部的垂直位置（图 1D+E）。
      注:漏斗应插入并放在圆锥管上。液氮水平应比漏斗入口高度低 1 厘米，如图1D所示。
   9. 将注射器泵从注射器泵支脚的一根绳绑在从细胞培养罩壁伸出的螺钉上，将注射器泵安装在细胞培养罩壁上的垂直位置。
   10. 将液氮 Dewar 与液滴收集装置放在垂直安装的注射器泵下（图 1E）。
3. 与注册会计师进行预孵育。
   1. 获得新鲜分离的大鼠肝细胞后，通过Trypan蓝色排除计算库存浓度，并服用4000万活肝细胞。
      注:在悬浮液中温和处理肝细胞对于防止细胞死亡至关重要。
   2. 在 50 x g下离心 5 分钟，无需踩刹车。
   3. 在V1溶液的3.4 mL中吸气上清液并重新悬浮肝细胞。
   4. 在冰上孵育3分钟。
   5. 在肝细胞中加入150μL的DMSO和150μL的EG，轻轻混合。
   6. 在冰上孵育3分钟。
   7. 再次，在肝细胞中加入150μL的DMSO和150μL的EG，然后轻轻混合。
   8. 在 3 mL 注射器中加载 3.5 mL。
4. 执行点化。
   1. 将带有预孵育肝细胞和 V2 溶液注射器的注射器插入注射器泵适配器。
   2. 将两个母 Luer 锁紧软管棒适配器连接到注射器上，并将混合针组件的硅胶管滑到棒接头上（图 1F）。
   3. 将整个组件放入注射器泵（图1E）。
   4. 上次向肝细胞中添加 DMSO 和 EG 后三分钟，以 2 mL/min 的速度启动泵。
   5. 将所有肝细胞添加到液氮中后，停止泵。

2. 低温储存

1. 使用 20 G 针在 50 mL 锥形管的盖子上穿刺 10 个小孔，并用柔性薄膜包裹盖子外侧，如图1B所示。这创造了一个阀门，使蒸发的剩液氮逃脱。
2. 要收集玻璃化肝细胞液滴，首先从液氮德瓦中取出漏斗。接下来，使用长钳将含有液氮液滴的锥形管从液氮中倒入，然后从锥形管中缓慢倒出多余的液氮。
3. 用穿刺盖合上锥形管，将封闭的锥形管与玻璃化肝细胞液滴直接放回液氮解毒液中。
4. 将锥形管从液氮转移到液氮蒸汽冷冻罐中。

3. 玻璃化肝细胞滴的再加热

1. 准备重新加热的解决方案。
   1. 在100 mL的DMEM肝细胞培养基中溶解17.13克蔗糖，使再加热溶液。使用 0.22 μm 过滤器对再加热溶液进行无菌过滤，并加热至 37°C。
2. 重新加热肝细胞。
   1. 取用玻璃化肝细胞从冷冻罐中加入锥形管，并将其用液氮Dewar输送到细胞培养罩。
   2. 轻轻松开盖子，将锥形管放回液氮中。
   3. 将玻璃化肝细胞液滴加入空烧杯，瞬间加入温暖（37°C）再加热溶液，并立即搅拌10s。
      注意:快速工作，以避免在重新加热期间结冰，这一点至关重要。根据研究要求，一些到所有玻璃化液滴可以一次重新加热。
3. 卸载重新加热的解决方案。
   1. 用两个 50 mL 锥形管上的肝细胞将再加热溶液分开。
   2. 在 4°C 下，在 100 x g下将两个锥形管离心 2 分钟，无需踩刹车。
   3. 利用锥形管的刻度线作为参考，吸出上清液，使总体积为12.5 mL，并加入每锥形管12.5 mL的冰冷DMEM，将再加热溶液稀释至50%。
   4. 重新悬浮肝细胞，在冰上孵育3分钟。
   5. 每锥形管加入25 mL的冰冷DMEM，将再加热溶液稀释至25%。
   6. 在 4°C 下在 50 x g下离心 5 分钟，无需踩刹车。
   7. 吸出上清液，将肝细胞重新悬浮在所需培养基的2 mL中，供使用。
      注:如果需要，密度梯度离心可用于去除细胞悬浮液中的死肝细胞。

结果

从五个不同的大鼠肝脏中分离出的新鲜原发性肝细胞，使用^文献4中报道的卓越的慢冷冻方案，将散装滴滴滴化直接与经典冷冻保存^{进行比较。 5.}简而言之，肝细胞悬浮在UW补充BSA（2.2毫克/升，葡萄糖（333 mM）和DMSO（10%v/v），并使用受控速率冷冻冷冻。在-196°C储存后，样品在温水浴中解冻。所有冰融化后，DMSO被直接稀释，同时葡萄糖浓度在多次降低渗?...

讨论

通过缓慢冷冻对肝细胞的冷冻保存会导致生存能力和代谢功能降低。冷冻为经典冷冻保存提供了一个有前途的替代方案，因为完全避免冷冻^损伤9。然而，需要与注册会计师进行预孵化，以降低临界冷却^率8。因此，由于CPA^毒性17，硝化受到阻碍，且样本量很小。为了克服这些限制，本手稿中提出的散装滴滴滴化方法被开发，以便在使用低预孵化...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-435
Beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution	Bridge to Life	BUW-001
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP	Cole-Parmer	EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank	Chart Industries	MVE 800
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Life Technologies	12800-082
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	107-21-1
Extra long forceps	Fisher Scientific	10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure	Fisher Scientific	06-443-18
Fishing line	Stren	SOFS4-15
Liquid nitrogen	Airgas	7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1	Grainger	3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel	ThermoFisher	4252-0100
Needle 20 ga	Becton Dickinson (BD)	305175
Parafilm M - Flexible film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Razor Blade	Fisher Scientific	12-640
Spatula	Cole-Parmer	EW-06369-18
Steriflip sterile filter	Fisher Scientific	SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S5-500
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container	ThermoFisher	2122