JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması, büyük miktarlarda sıçan hepatositleri için buzsuz kriyopreservation yöntemini açıklar ve böylece birincil hücreler düşük konsantrasyonda kriyoprotektif ajanlarla önceden kuluçkaya yatırılır ve büyük damlacıklarda vitrifiye edilir.

Özet

Vitrifikasyon, biyolojik numunelerin klasik yavaş donma (yaklaşık 1 °C/dk) kriyopreservation için umut verici bir buzsuz alternatiftir. Vitrifikasyon, zararlı buz oluşumunu önlerken suyun cam faza geçişini sağlamak için son derece hızlı soğutma hızları gerektirir. Kriyoprotektif ajanlar (CPA) ile pre-inkübasyon biyolojik numunelerin kritik soğutma hızını azaltabilir rağmen, yüksek konsantrasyonlarda genellikle vitrifikasyon ile buzsuz kriyopreservation sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon EBM toksisitesi tarafından engellenir ve hızlı soğutulabilen küçük numuneler ile sınırlıdır. Son zamanlarda bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem kullanılarak, hücreler ilk olarak düşük hücre içi EBM konsantrasyonu ile ön kuluçkaya yatırılır. Hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanan hücre içi EBM, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengelemeye gerek kalmadan vitrifikasyonun hemen öncesinde yoğunlaşmıştır. Hücresel dehidratasyon akışkan bir cihazda gerçekleştirilir ve sıvı nitrojen vitrifiye büyük boyutlu damlacıkların sürekli yüksek iş üretimi ile entegre. Minimum EBM toksisitesi ile bu buzsuz kriyopreservation yöntemi büyük hücre miktarları için uygundur ve klasik yavaş dondurucu kriyopreservation ile karşılaştırıldığında artmış hepatosit canlılık ve metabolik fonksiyon sonuçları. Bu el yazması, başarılı toplu damlacık vitrifikasyon yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Giriş

Hepatositkriyat kriyopreservation sonra hücre canlılığı ve metabolik fonksiyon kaybı hala klinik uygulamaları sınırlayan önemli bir konudur1,2,3. Hepatosit kriyopatinin kriter yöntemi, hepatositlerin EBM (dimetil sülfoksit [DMSO], glikoz ve albumin) ile önceden kuluçkaya yatırılarak ve daha sonra kontrollü oranda dondurularak (yaklaşık 1 °C/dk) yavaş donma yöntemidir. kriyojenik sıcaklıklar4,5. Birçok bildirilen optimizasyonlar rağmen, Buz oluşumunun donma ve mekanik stres sırasında zararlı ozmotik dengesizlikler ile birlikte EBM toksisitesi yavaş donma temel sakıncaları kalır6,7.

Vitrifikasyon, buz oluşumu nedeniyle oluşan bu yaralanmada yavaş donma üzerinde bir avantaj sağlar tamamen cam durumuna su doğrudan faz geçiş ile kaçınılır6. Ancak, saf suyun cam geçiş sıcaklığına (-137 °C) ulaşmak için, su cam geçiş sıcaklığının üzerinde buz oluşumunu önlemek için saniyede bir milyon santigrat derece (yani kritik soğutma hızı) sırasına göre soğutulmalıdır8 . EBM'lerin eklenmesi kritik soğutma hızını düşürebilir ve sulu çözeltilerin cam geçiş sıcaklığını artırabilir9. Ancak, yüksek EBM konsantrasyonları ile bile (örneğin, 40% v / v DMSO veya daha yüksek) hızlı soğutma oranları yine de başarılı vitrifikasyon için gereklidir8,9.

Gerekli soğutma hızları ve yüksek EBM konsantrasyonları vitrifikasyon un iki büyük dezavantajına neden olmaktadır. İlk olarak, hızlı soğutma sağlamak için, örnekler düşük bir termal kütleye sahip olmalıdır. İkinci olarak, ozmotik yaralanmayı önlerken yüksek EBM konsantrasyonlarına ulaşmak için, EBM'ler yavaş yavaş tanıtılmalı ve hücre içi ve hücre dışı bölmeler arasında tam olarak dengelenmelidir6. Bu toksik EBM'lere hücrelerin maruz kalma süresini artırır. Birlikte, bu vitrifikasyon bir seferde birkaç küçük boyutlu örnekleri (mikrolitre) ile sınırlı hantal bir süreç yapar. Damlacık vitrifikasyon bu kısıtlamalar için potansiyel bir çözüm olarak önerilmiştir. Küçük hücre yüklü damlacıkları (nanolitreler) sıvı nitrojene maruz bırakarak soğutma hızı önemli ölçüde artar, bu da sonuç olarak EBM konsantrasyonunda önemli bir azalma sağlar10,11,12 ,13,14. Birden fazla yüksek frekanslı damlacık üreten nozullar potansiyel olarak aynı anda kullanılabilir olsa da, son derece küçük damlacık boyutu dakikada mikrolitre10için üretim sınırlar , hangi büyük hücre verimli vitrifikasyon engelleyen dakikada mililitre sırasına göre büyüklükleri daha yüksek işleme oranları ile hacimleri.

Son zamanlarda vitrifikasyon bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon15ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem, tüp bebekleşmeden hemen önce %7,5 v/v etilen glikol ve DMSO hücre içi CpA konsantrasyonunu yoğunlaştırmak için hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanarak toksik EBM konsantrasyonlarının tam dengelenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücresel dehidratasyon, hepatositlerin yüksek hücre dışı CpA konsantrasyonuna kısa bir maruziyeti ile akışkan bir cihazda gerçekleştirilir. Bu maruz kalma hızlı ozmotik dehidratasyonneden olsa da, hücrelere yaymak için yüksek EBM konsantrasyonu için çok kısa. Dehidratasyondan hemen sonra hücreler sıvı nitrojenle doğrudan vitrifiye edilen damlacıklarla yüklenir. Bu yöntem yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonlarının tam hücre içi alım ihtiyacını ortadan kaldırırken, yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonu büyük boyutlu damlacıkların vitrifikasyonunu sağlar ve bu da minimum EBM toksisitesi ile yüksek üretim hacimleri sağlar.

Damlacık vitrifikasyon koruma dan sonra doğrudan ve uzun vadeli canlılık artırır, yanı sıra yavaş donma tarafından klasik kriyopreservation göre birincil sıçan hepatositlerin morfolojisi ve metabolik fonksiyonu15. Bu el yazması, birincil sıçan hepatositlerinin toplu damlacık vitrifikasyonu için metodolojik ayrıntıları sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol için birincil hepatosit izolasyonları Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, ABD'deki Hücre Kaynak Çekirdeği (CRC) tarafından gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolü (#2011N000111) Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Dökme damlacık vitrifikasyon

  1. Vitrifikasyon çözümlerini hazırlayın.
    1. Vitrifikasyon solüsyonu 1 (V1) yapmak için Wisconsin Üniversitesi çözeltisi (UW) 17.0 mL sığır serum albumin (BSA) 40 mg ekleyin. Steril filtre V1 çözeltisi 0,22 μm filtre kullanarak ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: UW yaygın olarak kullanılan bir organ koruma solüsyonudur. 50 g/L hidroksietil nişasta içerir, 35.83 g/L laktobiyonik asit, 3.4 g/L potasyum fosfat monobasic, 1.23 g/L magnezyum sülfat heptahidrat, 17.83 g/L raffinose pentahidrat, 1.34 g/L adenozin, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/L toplam glutatyon, 51 g /L potasyum hidroksit ve sodyum hidroksit pH'ı 7.4'e ayarla.
    2. Vitrifikasyon solüsyonu 2 (V2) yapmak için 7.0 mL UW, 6.5 mL DMSO, 6.5 mL etilen glikol (EG), 40 mg BSA ve 5.48 g sakaroz birleştirin. Steril filtre V2 çözeltisi 0,22 μm filtre kullanarak. 3 mL şırıngada 3,5 mL steril filtrelenmiş V2 çözeltisi yükleyin ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: EBM'lerin çözülmesini kolaylaştırmak için çözümler gerekenden daha büyük miktarlarda hazırlanır.
  2. Dökme damlacık vitrifikasyon aparatını hazırlayın.
    1. Karıştırma iğnesini hazırlamak için, önce karıştırma iğnesinin dış gri kolunun bir tarafını kesin ve sonra karıştırma iğnesinden çıkarmak için kılıfı açık bir şekilde bükün.
    2. Karıştırma iğnesinin girişlerinin üzerine iki adet 25 mm silikon boru kesiti kaydırın ve konumlarını tutkalla sabitleyin(Şekil 1A).
    3. İğneyi Şekil 1A'dagösterildiği gibi 20 mm (yani iç karıştırma sarlisinin uzunluğu) kesin.
      NOT: Karıştırma iğne uzunluğu iğne içindeki hacimle orantılıdır ve bu nedenle hepatositlerin yüksek EBM konsantrasyon çözeltisine maruz kalma süresini kontrol etmek için değiştirilebilir.
    4. Karıştırma iğnesinin kesme çıkışını 20 G enjeksiyon iğnesine yerleştirin(Şekil 1B).
      NOT: Enjeksiyon iğnesi boyutu damlacık boyutunu etkiler.
    5. Karıştırma iğnesi tertibatını otoklavlayarak sterilize edin.
    6. Steril bir Dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun. Steril bir laminar akış hücre kültür başlık Dewar yerleştirmeden önce izopropanol ile Dewar dışında sterilize.
      NOT: Damlacıkların sıvı nitrojene doğrudan maruz kalmasında kontaminasyon önemli bir husustur. Mevcut protokolde sterilize edilmemiş sıvı azot kullanılarak herhangi bir kontaminasyon olmamasına rağmen, sıvı nitrojen16gerekirse steriliteyi sağlamak için filtrelenebilir veya ışınlanabilir.
    7. Damlacık toplama cihazını oluşturmak için sıvı nitrojen Dewar'ın iç çapı ile aynı dış çapa sahip bir huniyi 50 mL konik bir tüpe yerleştirin(Şekil 1C−E).
    8. Damlacık toplama cihazını büyük çömeçler kullanarak son dikey konumuna yavaşça bastırarak sıvı nitrojene batırın. Konik tüpün Dewar'ın alt kısmında dikey bir pozisyonda olduğundan emin olun (Şekil 1D−E).
      NOT: Huni konik tüpüzerinde takılı ve istirahat kalmalıdır. Sıvı azot seviyesi Şekil 1D'degösterildiği gibi hunin giriş yüksekliğinin 1 cm altında olmalıdır.
    9. Şırınga pompasının ayaklarından hücre kültürü başlık duvarından çıkan vidalara bir ip bağlayarak hücre kültürü başlığının duvarına dikey bir pozisyonda bir şırınga pompası monte edin.
    10. Sıvı nitrojen Dewar'ı damlacık toplama cihazıile dikey olarak monte edilmiş şırınga pompasının altına yerleştirin(Şekil 1E).
  3. EBM'lerle ön kuluçka.
    1. Taze izole sıçan hepatositleri elde ettikten sonra, Trypan mavi dışlama ile stok konsantrasyonu saymak ve almak 40 milyon canlı hepatosit.
      NOT: Süspansiyon içinde hepatositlerin nazik kullanımı hücre ölümünü önlemek için çok önemlidir.
    2. Frensiz 5 dk için 50 x g santrifüj.
    3. Süpernatant'ı aspire edin ve hepatositleri V1 çözeltisinin 3,4 mL'sinde yeniden askıya alın.
    4. 3 dakika buz üzerinde kuluçka.
    5. Hepatositlere 150 μL DMSO ve 150 μL EG ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    6. 3 dakika buz üzerinde kuluçka.
    7. Yine hepatositlere 150 μL DMSO ve 150 μL EG ekleyin ve hafifçe karıştırın.
    8. 3 mL şırıngada 3,5 mL yükleyin.
  4. Vitrifikasyon gerçekleştirin.
    1. Şırıngayı önceden kuluçkaya yatan hepatositler ve V2 solüsyonu ile şırınga pompası adaptörüne takın.
    2. Şırıngalar için iki kadın Luer kilit hortumu barb adaptörleri takın ve diken parçaları(Şekil 1F)üzerinde karıştırma iğne montaj silikon boru slayt.
    3. Tüm montajı şırınga pompasına yerleştirin (Şekil 1E).
    4. DMSO ve EG'nin hepatositlere son ilavesinden sonra üç dk, pompayı 2 mL/dk'dan başlatın.
    5. Sıvı nitrojene tüm hepatositler eklendikten sonra pompayı durdurun.

2. Kriyojenik depolama

  1. Şekil1B'degösterildiği gibi, 20 G iğne kullanarak 50 mL konik bir tüpün kapağında 10 küçük delik açın ve kapağın dışını esnek bir filmle sarın. Bu artık sıvı azot buharlaşma kaçış sağlayan bir vana oluşturur.
  2. Vitrifiye hepatosit damlacıkları toplamak için, ilk sıvı azot Dewar hunisi çıkarın. Daha sonra, sıvı nitrojen damlacıkları içeren konik tüp almak ve yavaş yavaş konik tüp aşırı sıvı azot dökmek için uzun forceps kullanın.
  3. Konik tüpü delinmiş kapakla kapatın ve kapalı konik tüpü doğrudan sıvı nitrojen Dewar'a vitrifiye hepatosit damlacıklarıyla yerleştirin.
  4. Konik tüpü sıvı nitrojenden sıvı nitrojen buharı kriyotankına aktarın.

3. Vitrifiye hepatosit damlacıklarının yeniden ısıtılmış

  1. Isınma çözeltisini hazırlayın.
    1. 100 mL DMEM hepatosit kültür medyasında 17.13 g sakaroz çözünerek yeniden ısınma çözeltisi yapın. Steril filtre 0.22 μm filtre ve 37 °C sıcak kullanarak rewarming çözeltisi.
  2. Hepatositleri ısıt.
    1. Konik tüpü kriyoktan vitrifiye hepatositlerle alın ve sıvı nitrojen Dewar ile hücre kültürüne taşıyın.
    2. Kapağı hafifçe gevşetin ve konik tüpü sıvı nitrojene geri koyun.
    3. Vitrifiye hepatosit damlacıklarını boş bir kabın üzerine ekleyin, anında sıcak (37 °C) yeniden ısınma solüsyonu ekleyin ve hemen 10 s'lik karıştırın.
      NOT: Isınma sırasında donma önlemek için hızlı bir şekilde çalışmakönemlidir. Çalışma gereksinimlerine bağlı olarak, tüm vitrifiye damlacıklar birkaç aynı anda yeniden ısıtılabilir.
  3. Yeniden ısınma çözeltisini boşaltın.
    1. Isınma çözeltisini hepatositlerle iki 50 mL konik tüpe bölün.
    2. Frensiz 4 °C'de 100 x g'de 2 dk'lık iki konik tüpü santrifüj edin.
    3. Konik tüpün mezuniyet işaretini referans olarak kullanarak toplam 12,5 mL hacim bırakmak için süpernatantı aspire edin ve yeniden ısınma çözeltisini %50'ye seyreltmek için konik tüp başına 12,5 mL buz gibi dMEM ekleyin.
    4. Hepatositleri yeniden askıya alın ve 3 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    5. Isınma çözeltisini %25'e seyreltmek için konik tüp başına 25 mL buz gibi DMEM ekleyin.
    6. Frensiz 4 °C'de 50 x g'de 5 dk santrifüj.
    7. Supernatant aspire ve kullanım için istenilen kültür ortamı2 mL hepatositler resuspend.
      NOT: Yoğunluk gradyan santrifüj, istenirse hücre süspansiyonundaki ölü hepatositleri çıkarmak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Beş farklı sıçan karaciğerinden taze izole primer hepatositler, literatürde bildirilen üstün yavaş dondurma protokolleri kullanılarak toplu damlacık vitrifikasyonunun klasik kriyopreservation ile doğrudan karşılaştırılması için kullanılmıştır4, 5. Kısacası, hepatositler UW'de BSA (2.2 mg/mL), glikoz (333 mM) ve DMSO (%10 v/v) ile takviye edildi ve kontrollü bir dondurucu kullanılarak donduruldu. -196 °C'de muhafaza edildikten sonra nu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hepatositlerin yavaş donma sonucu ile kriyopreservation azaltılmış canlılık ve metabolik fonksiyon. Vitrifikasyon klasik kriyopreservation için umut verici bir alternatif sunuyor, dondurucu yaralanma tamamen kaçınılır gibi9. Ancak, kritik soğutma oranını düşürmekiçin EBM'ler ile kuluçka öncesi 8 gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon CpA toksisitesi17 tarafından engellenir ve küçük numune hacimleri ile sınırlıdır. Bu sı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali çıkarları beyan. Dr. de Vries, Weng, Toner, Tessier ve Uygun'un bu çalışmayla ilgili geçici patent başvuruları vardır. Dr. Uygun, organ koruma teknolojisini geliştirmeye odaklanmış organ çözümlerine finansal bir ilgi sahiptir. Tüm araştırmacının çıkarları, çıkar çatışması politikalarına uygun olarak MGH ve Partners HealthCare tarafından yönetilir.

Teşekkürler

ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK096075, R01DK107875 ve R01DK114506) ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) gelen finansman büyük ölçüde kabul edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok TipsFisher Scientific14-823-435
BeakerSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW Cold Storage SolutionBridge to LifeBUW-001
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PPCole-ParmerEW-45508-12
Cryogentic stroage tank / CryotankChart IndustriesMVE 800
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvateLife Technologies12800-082
Ethylene GlycolSigma-Aldrich107-21-1
Extra long forcepsFisher Scientific10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closureFisher Scientific06-443-18
Fishing lineStrenSOFS4-15
Liquid nitrogenAirgas7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder FunnelThermoFisher4252-0100
Needle 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - Flexible filmSigma-AldrichP7793-1EA
Razor BladeFisher Scientific12-640
SpatulaCole-ParmerEW-06369-18 
Steriflip sterile filterFisher ScientificSE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS5-500
Syringe PumpNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen ContainerThermoFisher2122

Referanslar

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 152hepatositprimer hepatosit izolasyonudamlac k vitrifikasyonkriyopreservationkriyoprotektif ajanh cresel dehidratasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır