Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine eisfreie Kryokonservierungsmethode für große Mengen von Rattenhepatozyten, bei der Primärzellen mit kryoprotektiven Mitteln in geringer Konzentration vorinkubiert und in großen Tröpfchen verglast werden.

Zusammenfassung

Die Vitrifizierung ist eine vielversprechende eisfreie Alternative zur klassischen Slow-Freezing (bei ca. 1 °C/min) Kryokonservierung biologischer Proben. Die Vitrifizierung erfordert extrem schnelle Kühlraten, um den Übergang von Wasser in die Glasphase zu erreichen und gleichzeitig eine schädliche Eisbildung zu vermeiden. Obwohl die Vorinkubation mit kryoprotektiveN (CPA) die kritische Abkühlrate biologischer Proben reduzieren kann, sind in der Regel hohe Konzentrationen erforderlich, um eine eisfreie Kryokonservierung durch Verglasung zu ermöglichen. Infolgedessen wird die Verglasung durch CPA-Toxizität behindert und auf kleine Proben beschränkt, die schnell gekühlt werden können. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen durch die Verglasung von Tröpfchen überwunden werden können. Mit dieser neuartigen Methode werden Zellen zunächst mit einer niedrigen intrazellulären CPA-Konzentration vorinkubiert. Durch die Nutzung einer schnellen osmotischen Dehydrierung konzentriert sich das intrazelluläre CPA direkt vor der Vitrifizierung, ohne dass toxische CPA-Konzentrationen vollständig ausgeglichen werden müssen. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durchgeführt und mit kontinuierlicher hoher Durchsatzerzeugung von großen Tröpfchen integriert, die in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese eisfreie Kryokonservierungsmethode mit minimaler CPA-Toxizität eignet sich für große Zellmengen und führt zu einer erhöhten Hepatozytenlebensfähigkeit und Metabolisierungsfunktion im Vergleich zur klassischen langsam gefrierenden Kryokonservierung. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für eine erfolgreiche Bulk-Droplet-Verglasung im Detail.

Einleitung

Verlust der Zelllebensfähigkeit und metabolische Funktion nach Kryokonservierung von Hepatozyten ist immer noch ein großes Problem, das klinische Anwendungen begrenzt^1,2,3. Die Benchmark-Methode der Hepatozyten-Kryokonservierung ist das langsame Einfrieren, das durch Vorinkubation der Hepatozyten mit CPA (Dimethylsulfoxid [DMSO], Glucose und Albumin) und anschließender kontrollierter Rate gefriert (bei ca. 1 °C/min) kryogene Temperaturen^4,5. Trotz vieler gemeldeter Optimierungen bleiben CPA-Toxizität zusammen mit schädlichen osmotischen Ungleichgewichten beim Einfrieren und mechanischer Belastung der Eisbildung grundlegende Nachteile des langsamen Einfrierens^6,7.

Vitrifizierung bietet einen Vorteil gegenüber langsamem Einfrieren, da Verletzungen durch Eisbildung durch einen direkten Phasenübergang des Wassers in den Glaszustand⁶vollständig vermieden werden. Um jedoch die Glasübergangstemperatur von reinem Wasser (-137 °C) zu erreichen, muss das Wasser in einer Größenordnung von einer Million Grad Celsius pro Sekunde (d. h. der kritischen Abkühlrate) gekühlt werden, um eine Eisbildung über der Glasübergangstemperatur 8 zu vermeiden. . Die Zugabe von CPAs kann die kritische Kühlrate senken und die Glasübergangstemperatur wässriger Lösungen^{erhöhen 9}. Doch auch bei hohen CPA-Konzentrationen (z.B. 40% v/v DMSO oder höher) sind für eine erfolgreiche Verglasung^8,9dennoch schnelle Abkühlraten erforderlich.

Die erforderlichen Kühlraten und hohen CPA-Konzentrationen führen zu zwei großen Nachteilen der Verglasung. Um eine schnelle Kühlung zu ermöglichen, müssen die Proben zunächst eine geringe thermische Masse haben. Zweitens müssen CPAs langsam eingeführt und vollständig zwischen den intra- und extrazellulären Kompartimenten⁶ausgeglichen werden, um hohe CPA-Konzentrationen zu erreichen und gleichzeitig osmotische Verletzungen zu vermeiden. Dies erhöht die Expositionszeit von Zellen gegenüber toxischen CPAs. Zusammen macht dies die Verglasung zu einem umständlichen Prozess, der auf ein paar kleine Proben (Mikroliter) gleichzeitig beschränkt ist. Als mögliche Lösung für diese Beschränkungen wurde die Tröpfchenverglasung vorgeschlagen. Durch die Exposition von winzigen zellbeladenen Tröpfchen (Nanolitern) gegenüber flüssigem Stickstoff wird die Kühlrate deutlich erhöht, was eine erhebliche Reduktion der CPA-Konzentration^10,11,12 ermöglicht. ^,13,14. Obwohl mehrere hochfrequente Tröpfchen-erzeugungserzeugende Düsen potenziell gleichzeitig verwendet werden könnten, begrenzt die extrem kleine Tröpfchengröße den Durchsatz auf Mikroliter pro Minute¹⁰, was eine effiziente Verglasung großer Zellen verhindert. Volumen mit um Magnituden höheren Verarbeitungsraten in der Größenordnung von Millilitern pro Minute.

Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen der Vitrifizierung durch Bulk-Droplet-Vitrifizierung¹⁵überwunden werden können. Diese neuartige Methode nutzt eine schnelle osmotische Dehydrierung, um eine intrazelluläre CPA-Konzentration von 7,5 % v/v Ethylenglykol und DMSO unmittelbar vor der Vitrifizierung zu konzentrieren, wodurch die vollständige Ausgleichung toxischer CPA-Konzentrationen entfällt. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durch eine kurze Exposition der Hepatozyten bei einer hohen extrazellulären CPA-Konzentration durchgeführt. Obwohl diese Exposition eine schnelle osmotische Dehydrierung verursacht, ist es zu kurz, als dass die hohe CPA-Konzentration in die Zellen diffundieren könnte. Unmittelbar nach der Dehydrierung werden die Zellen in Tröpfchen geladen, die direkt in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese Methode eliminiert die Notwendigkeit einer vollständigen intrazellulären Aufnahme hoher CPA-Konzentrationen, während die hohe extrazelluläre CPA-Konzentration die Verglasung großer Tröpfchen ermöglicht, was zu hohen Durchsatzvolumina mit minimaler CPA-Toxizität führt.

Tröpfchenverglasung verbessert die direkte und langfristige Lebensfähigkeit nach der Konservierung, sowie Morphologie und metabolische Funktion der primären Rattenhepatozyten im Vergleich zur klassischen Kryokonservierung durch langsames Einfrieren¹⁵. Dieses Manuskript enthält die methodischen Details für die Massentropfenverglasung von primären Rattenhepatozyten.

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Protokoll

Die primären Hepatozytenisolationen für dieses Protokoll wurden vom Cell Resource Core (CRC) am Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA durchgeführt. Das Tierprotokoll (#2011N000111) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital genehmigt.

1. Bulk-Droplet-Vitrifikation

1. Bereiten Sie die Verglasungslösungen vor.
   1. Fügen Sie 40 mg Rinderserumalbumin (BSA) zu 17,0 ml der Lösung der University of Wisconsin (UW) hinzu, um Vitrifizierungslösung 1 (V1) herzustellen. Sterilfilter der V1-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und lagern bei 4 °C.
      HINWEIS: UW ist eine häufig verwendete Organkonservierungslösung. Es enthält 50 g/L Hydroxyethylstärke, 35,83 g/L Lactobionsäure, 3,4 g/L Kaliumphosphat monobasic, 1,23 g/L Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 17,83 g/L-Raffinose-Pentahydrat, 1,34 g/L Adenosin, 0,136 g/L Allopurinol, 0,992 g/L Totalglutathion, 5,61 g /L Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.
   2. Kombinieren Sie 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml Ethylenglykol (EG), 40 mg BSA und 5,48 g Saccharose zur Verglasungslösung 2 (V2). Sterilfilter der V2-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter. 3,5 ml steril gefilterte V2-Lösung in eine 3 ml Spritze geben und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Um die Auflösung der CPAs zu erleichtern, werden Lösungen in größeren Mengen als erforderlich vorbereitet.
2. Bereiten Sie die Bulk-Droplet-Verglasungsapparat.
   1. Um die Mischnadel vorzubereiten, schneiden Sie zuerst entlang einer Seite der äußeren grauen Hülse der Mischnadel und biegen Sie dann die Hülse auf, um sie von der Mischnadel zu entfernen.
   2. Schieben Sie zwei 25 mm Silikonschläuche über die Einlässe der Mischnadel und sichern Sie ihre Position mit Kleber (Abbildung 1A).
   3. Schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 20 mm (d. h. die Länge der inneren Mischhelix) wie in Abbildung 1Adargestellt.
      HINWEIS: Die Mischnadellänge ist proportional zum Volumen innerhalb der Nadel und kann daher geändert werden, um die Belichtungszeit der Hepatozyten gegenüber der Lösung mit hoher CPA-Konzentration zu steuern.
   4. Setzen Sie den Trennausgang der Mischnadel in eine 20 G Injektionsnadel ein (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die Größe der Injektionsnadel beeinflusst die Tröpfchengröße.
   5. Sterilisieren Sie die Mischnadelbaugruppe durch Autoklavieren.
   6. Füllen Sie einen sterilen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Sterilisieren Sie die Außenseite des Dewar mit Isopropanol, bevor Sie den Dewar in eine sterile laminare Flusszellkulturhaube legen.
      HINWEIS: Eine Kontamination ist ein wichtiger Aspekt bei der direkten Exposition der Tröpfchen gegenüber flüssigem Stickstoff. Obwohl im aktuellen Protokoll keine Kontamination mit nicht sterilisiertem flüssigem Stickstoff vorlag, kann flüssiger Stickstoff gefiltert oder bestrahlt werden, um bei Bedarf die Sterilität zu gewährleisten¹⁶.
   7. Legen Sie einen Trichter mit dem gleichen Außendurchmesser wie der Innendurchmesser des flüssigen Stickstoffs Dewar in ein 50 ml konisches Rohr ein, um die Tröpfchensammelvorrichtung zu erstellen (Abbildung 1C-E).
   8. Tauchen Sie die Tröpfchensammelvorrichtung in den flüssigen Stickstoff ein, indem Sie sie langsam in ihrer endgültigen vertikalen Position mit großen Zangen nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass das konische Rohr in einer vertikalen Position am unteren Rand des Dewar stagniert (Abbildung 1D-E).
      HINWEIS: Der Trichter sollte in das konische Rohr eingelegt bleiben und auf dem konischen Rohr ruhen. Der Flüssigstickstoffgehalt sollte 1 cm unter der Einlasshöhe des Trichters liegen, wie in Abbildung 1Ddargestellt.
   9. Montieren Sie eine Spritzenpumpe in einer vertikalen Position an der Wand der Zellkulturhaube, indem Sie eine Schnur von den Füßen der Spritzenpumpe an Schrauben binden, die aus der Zellkultur-Haubenwand herausragen.
   10. Legen Sie den flüssigen Stickstoff Dewar mit der Tröpfchensammelvorrichtung unter die vertikal montierte Spritzenpumpe (Abbildung 1E).
3. Vorinkubation mit CPAs.
   1. Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Trypan blauen Ausschluss und nehmen 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten.
      HINWEIS: Der sanfte Umgang mit Hepatozyten in suspension ist entscheidend, um den Zelltod zu verhindern.
   2. Zentrifuge bei 50 x g für 5 min ohne Bremse.
   3. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Hepatozyten in 3,4 ml V1-Lösung wieder aus.
   4. 3 min auf Eis bebrüten.
   5. Fügen Sie den Hepatozyten 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.
   6. 3 min auf Eis bebrüten.
   7. Fügen Sie die Hepatozyten nochmals 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.
   8. 3,5 ml in eine 3 ml Spritze geben.
4. Vitrifizierung durchführen.
   1. Setzen Sie die Spritze mit vorbebrühten Hepatozyten und die V2-Lösungsspritzen auf den Spritzenpumpenadapter.
   2. Befestigen Sie zwei weibliche Luer-Verriegelungs-Rohr-Widerhaken-Adapter an den Spritzen und schieben Sie die Silikonschläuche der Mischnadel-Baugruppe über die Widerhakenarmaturen(Abbildung 1F).
   3. Legen Sie die gesamte Baugruppe in die Spritzenpumpe (Abbildung 1E).
   4. Drei Min. nach der letzten Zugabe von DMSO und EG zu den Hepatozyten starten Sie die Pumpe bei 2 ml/min.
   5. Stoppen Sie die Pumpe, nachdem dem flüssigen Stickstoff alle Hepatozyten zugesetzt wurden.

2. Kryogene Lagerung

1. Punktieren Sie 10 kleine Löcher im Deckel eines 50 ml konischen Rohres mit einer 20 G Nadel und wickeln Sie die Außenseite des Deckels mit einem flexiblen Film, wie in Abbildung 1Bdargestellt. Dadurch entsteht ein Ventil, das das Entweichen von verdampfendem flüssigem Stickstoff ermöglicht.
2. Um die verglasten Hepatozytentröpfchen zu sammeln, entfernen Sie zuerst den Trichter aus dem flüssigen Stickstoff Dewar. Als nächstes verwenden Sie lange Zangen, um das konische Rohr zu nehmen, das die Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff enthält, und gießen Sie langsam den überschüssigen flüssigen Stickstoff aus dem konischen Rohr aus.
3. Schließen Sie das konische Rohr mit dem durchlöcherten Deckel und legen Sie das geschlossene konische Rohr mit verglasten Hepatozytentröpfchen direkt wieder in den flüssigen Stickstoff Dewar.
4. Übertragen Sie das konische Rohr aus dem flüssigen Stickstoff in einen flüssigen Stickstoffdampf-Kryotank.

3. Wiedererwärmung der verglasten Hepatozytentröpfchen

1. Bereiten Sie die Rewarming-Lösung vor.
   1. 17,13 g Saccharose in 100 ml DMEM Hepatozytenkulturmedien auflösen, um die Rewarminglösung zu finden. Steriler Filter der Rewarming-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und warm auf 37 °C.
2. Die Hepatozyten aufwärmen.
   1. Nehmen Sie die konische Röhre mit verglasten Hepatozyten aus dem Kryotank und transportieren Sie sie in einem flüssigen Stickstoff Dewar zur Zellkulturhaube.
   2. Lösen Sie die Kappe leicht und legen Sie das konische Rohr wieder in den flüssigen Stickstoff.
   3. Die verglasten Hepatozytentröpfchen in ein leeres Becherglas geben, sofort die warme (37 °C) Aufwärmlösung hinzufügen und sofort 10 s rühren.
      HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um das Einfrieren während des Erneuten Aufwärmens zuvermeiden. Je nach Studienbedarf können einige bis alle verglasten Tröpfchen auf einmal wieder aufgewärmt werden.
3. Entladen Sie die Wiederaufwärmlösung.
   1. Teilen Sie die Rewarminglösung mit Hepatozyten über zwei 50 ml konische Rohre.
   2. Zentrifugieren Sie die beiden konischen Rohre für 2 min bei 100 x g bei 4 °C ohne Bremse.
   3. Saugen Sie den Überstand an, um ein Gesamtvolumen von 12,5 ml unter Verwendung der Graduierungsmarke des konischen Rohrs als Referenz zu lassen, und fügen Sie 12,5 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 50 % zu verdünnen.
   4. Die Hepatozyten wieder aufsetzen und 3 min auf Eis brüten.
   5. Fügen Sie 25 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 25% zu verdünnen.
   6. Zentrifuge für 5 min bei 50 x g bei 4 °C ohne Bremse.
   7. Den Überstand ansaugen und die Hepatozyten in 2 ml des gewünschten Kulturmediums für den Einsatz wieder aussetzen.
      HINWEIS: Die Zentrifugation des Dichtegradienten kann verwendet werden, um tote Hepatozyten auf Wunsch aus der Zellsuspension zu entfernen.

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Ergebnisse

Frisch isolierte primäre Hepatozyten aus fünf verschiedenen Rattenlebern wurden für einen direkten Vergleich der Massentropfenverglasung mit der klassischen Kryokonservierung unter Verwendung der in der^{Literatur 4 berichteten herausragenden Slow-Freezing-Protokolle verwendet. 5}. Kurz gesagt, die Hepatozyten wurden in UW mit BSA (2,2 mg/ml), Glukose (333 mM) und DMSO (10% v/v) ergänzt und mit einem kontrollierten Gefrierschrank eingefroren. Nach der Lagerung ...

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Diskussion

Die Kryokonservierung von Hepatozyten durch langsames Einfrieren führt zu verminderter Lebensfähigkeit und metabolischer Funktion. Vitrifikation bietet eine vielversprechende Alternative für die klassische Kryokonservierung, da Gefrierverletzungen vollständig vermieden werden⁹. Eine Vorinkubation mit CPAs ist jedoch erforderlich, um die kritische Kühlrate⁸zu senken. Folglich wird die Verglasung durch die CPA-Toxizität¹⁷ behindert und auf kleine...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-435
Beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution	Bridge to Life	BUW-001
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP	Cole-Parmer	EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank	Chart Industries	MVE 800
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate	Life Technologies	12800-082
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	107-21-1
Extra long forceps	Fisher Scientific	10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure	Fisher Scientific	06-443-18
Fishing line	Stren	SOFS4-15
Liquid nitrogen	Airgas	7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1	Grainger	3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel	ThermoFisher	4252-0100
Needle 20 ga	Becton Dickinson (BD)	305175
Parafilm M - Flexible film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Razor Blade	Fisher Scientific	12-640
Spatula	Cole-Parmer	EW-06369-18
Steriflip sterile filter	Fisher Scientific	SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S5-500
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container	ThermoFisher	2122