检查胡萝卜体瘦素信号的实验方法及其对呼吸控制的影响

摘要

我们的研究侧重于胡萝卜素体 （CB） 中的瘦素信号对低氧通气反应 （HVR） 的影响。进行了"功能丧失"实验，测量瘦素在CB变性后对HVR的影响，在CB中瘦素受体过度表达后测量HVR的"功能增益"实验。

摘要

脂肪细胞产生的激素瘦素是一种有效的呼吸兴奋剂，在保护肥胖的呼吸功能方面可能起着重要作用。胡萝卜体（CB）是周围缺氧敏感性的关键器官，表达瘦素受体（LepR^b）的长功能异形，但瘦素信号在控制呼吸中的作用尚未完全阐明。我们检查了C57BL/6J小鼠在基线和CB脱液后输液前后的低氧通气反应（HVR）（1）;（2） 在LepR^b- 缺乏肥胖的 db/db小鼠在基线和后 LepR^b在 CB 的过度表达。在C57BL/6J小鼠中，瘦素增加HVR，瘦素对HVR的影响被CB变性所废除。在db/db小鼠中，CB 中的 LepR^b表达式增强了 HVR。因此，我们得出结论，瘦素在CB的作用，以增强对缺氧的反应。

引言

脂肪细胞产生激素瘦素作用下丘脑抑制食物摄入量和增加代谢率。在我们的^{实验室1，2}和其他^{研究者3，4}进行的研究表明，瘦素增加高充气通气反应（HVR），防止瘦素的肥胖通气不足缺乏肥胖症。然而，大多数肥胖者有高血浆瘦素水平，并表现出对^{激素5，6，7，8}的代谢和呼吸作用的阻力。对瘦素的抗药性是多因素的，但血脑屏障（BBB）对瘦素的渗透性有限，是主要原因。我们建议，瘦素作用于BBB以下的周围缺氧敏感性的关键器官，胡萝卜体（CB），以捍卫肥胖者的呼吸。CB表示瘦素受体LepR^b的长功能等形，但CB在瘦素呼吸效应中的作用尚未充分^{阐明9，10。}

我们的方法的目的是检查瘦素信号在CB对HVR的影响。我们的基本原理是:（a） 在小鼠体内注入瘦素，并注入完整的胡萝卜体和脱粒胡萝卜体，然后进行HVR测量;（a） 进行功能丧失实验，将瘦素注入小鼠体内;（b） 缺乏 LepR^b的db/db小鼠的功能实验增益，其中我们仅在 CB 中测量了在基线和后表达 LepR^b的 HVR。我们技术的优点是，我们在睡眠和觉醒期间，在无节制的无麻醉小鼠身上进行了所有实验。以前的研究者要么在^麻醉9下进行实验，要么在^睡眠10号期间没有测量瘦素的效果。此外，我们的研究是首次利用上述CB中选择性LepR^b表达的函数方法的独特增益。

在广义上，我们的方法可以概括到CB中表达的其他受体及其在低氧敏感性中的作用。调查人员可以将配体注入感兴趣的受体，并在基线和CB变性后测量HVR。作为一种补充方法，在CB和HVR测量中，可以使用本手稿中描述的技术在过度表达之前和之后过度表达感兴趣的受体。

研究方案

所有实验协议均已获得机构动物护理和使用委员会（MO18M211）的批准。

1. 瘦素输液

注:为了检查瘦素对呼吸的影响，我们通过渗透泵在瘦C57BL/6J小鼠中注入瘦素，以提高肥胖小鼠的循环瘦素水平。

1. 渗透泵制备
   1. 称重空泵以检查已装载溶液的净重量。
   2. 将瘦素（5毫克/mL）加入渗透泵（1 μL/h，3天）。用小型注射器（1 mL）填充泵。加注后，用提供的钝尖 27 仪表填充管关闭泵。
      注:注射器和连接管应无气泡。
   3. 加注后，再次称重泵以检查溶液的净重量。
   4. 将瘦素泵分皮插入间盖区域。
      注:如果您想立即开始输注，在37°C无菌盐水中孵育预填充泵至少4至6小时（最好是过夜）。

2. 缺氧通气反应 （HVR）

注:热中性条件消除环境温度冷却带来的压力因素，并显著改变小鼠的新陈代谢。因此，所有呼吸测量应在热中性条件下（t = 30 °C）使用新生儿培养^箱12（图1A）。全身胸腔（WBP）已用于所有测量。所有动物都应适应大气胸腔和假颈领，在HVR测量前进行3-5天的脉搏血氧测量记录。HVR记录在上午10点至下午5点之间。HVR在睡眠期间被抑制，因此可以在睡眠和静^醒13时单独测量。为了确保在HVR测量期间动物的特定睡眠-觉醒阶段，EEG/EMG电极应植入EEG/EMG头部，如前^所述14。动物应该被允许恢复至少72小时后，头山。睡眠暂存应在 5 s 的周期内执行。NREM 睡眠由占据超过 50% 的慢波脑电图活动识别。安静的觉醒表现在无运动的情况下的阿尔法脑电图活动。REM睡眠由主要α和ta EEG活动在EMG上肌肉张力降低的情况下识别。通常，在 HVR 气体挑战期间不会观察到 REM 睡眠。

1. HVR 记录协议
   1. 使用以下尺寸的 WBP 造型室:内径 80 mm、高度 50.5 mm 和体积 0.4 L。WBP 室由两个腔室、密封室和参考室以及一个圆形平台组成，用于放置鼠标^14（图 1B）。腔室内的流入和流出由维持大气压力的正负压力源控制。此控件可在造型室中创建稳定的偏置流，并防止_CO2保持。有关WBP设置的更多详细信息，请参阅埃尔南德斯和^同事15。
   2. 在将鼠标放入 WBP 之前，测量室内温度和室内的相对湿度。
   3. 测量体重和直肠温度。
   4. 将血氧表环绕在鼠标的脖子上（以前应将区域进行测量）。
   5. 将鼠标放在 WBP 内，确保腔室完全密封，以避免空气泄漏。
   6. 等待大约 30 分钟，直到鼠标安静且腔室的音量恒定。
   7. Normoxia:30分钟后，如果鼠标安静，开始记录呼吸信号和周围氧饱和度（SpO_2）在诺莫夏相（21% FiO₂在1分压）20分钟，使用LabChart 7 Pro（版本7.2）。
   8. 缺氧:在静默20分钟后，开始记录急性缺氧_和SpO2的第一周期。对于缺氧阶段，使动物暴露于由10%O₂和3%CO₂组成的恒定混合气体流中，持续5分钟。
      1. 在缺氧的前30秒，混合气体通过基座的2个小侧端口流经腔室，使FiO₂从21%（压力1atm时）降至10%。
      2. 初始 30 秒后，关闭 WBP 腔室的一个小侧端口，并在 10% FiO₂的恒定缺氧处保持记录 5 分钟。
         注:在缺氧时使用10%O₂和3%CO₂的混合物，以保持eucapnea^11。
   9. 缺氧5分钟后，通过切换流入源，将小鼠再次暴露在室内空气中（压力为1atm时为21%FiO_2）。
   10. 等待至少30分钟，直到下一次诺莫夏记录，以便从以前的缺氧暴露中恢复，以避免通气性滚降现象（即，在^缺氧16期间集中抑制呼吸）。
       注:在每只鼠标中重复三次缺氧/缺氧循环，以确保测量的可重复性。根据我们的经验，由于通气适应（滚降现象），应避免额外的（在给定一天超过3次）缺氧暴露。
   11. 在实验结束时，通过在腔室底部的一个小侧口中插入注射器，将1 mL室空气注入3次，校准WBP腔室（鼠标仍在内部）。
   12. 再次测量室内温度，与里面的动物一起测量。
   13. 打开腔室并测量鼠标的直肠温度，然后再将其放回家庭笼子。
2. HVR 计算
   1. 以 1，000 Hz（每个通道的采样频率）对 HVR 计算的所有信号进行数字化。
      注:WBP潮汐体积分析在实验室图7中基于德洛博和芬^方程17进行。所需的变量包括小鼠直肠温度和腔室温度（HVR 测量前后）、相对湿度和腔室气体常数。此常数是校准阶段 1 mL 空气喷射后 WBP 压力偏转的结果。有关更多详情，请参阅埃尔南德斯和同事¹⁵。
   2. 计算德洛博和芬方程后，将潮汐体积 （Vt） 室通道乘以常数。
   3. 为分析选择录像
      1. 诺莫夏:只选择稳定呼吸与恒定的潮量部分。避免靠近鼠标移动的部分。
      2. 缺氧:_{当O2水平从21%}下降到10%时，丢弃前30秒，选择30秒到2分钟的10%O₂暴露（90秒间隔）。在此间隔内，仅选择具有稳定呼吸且具有恒定潮汐量的部分。避免靠近鼠标移动的部分。如果在每个周期中至少选择 10 s 的缺氧，则分析是可靠的。
         注:由CB控制的chemoreflex的外围组件^{在16、18、19}的曝光前1-2分钟占主导地位。在第二阶段，在2分钟至5分钟的缺氧暴露之间，外围和中央元件都发挥作用。最后，第三阶段，>5分钟，的特点是通气不足（滚降现象），主要由中央化学受体控制。我们的经验表明，由于气流源中的手动开关，小鼠在缺氧的博览会上经常醒着。
   4. 选择后，使用公式V_E = 呼吸速率X潮汐体积，在规范和缺氧条件下计算平均分钟通气（V_E）。
   5. 计算诺莫夏和缺氧条件下的平均SpO_2。
   6. 使用公式 HVR = （V_E （10% O₂） - V_E （21%O₂） / （SpO₂ （10% O₂） = SpO₂ （21% O₂）手动计算 HVR。
      注:在 C57BL/6J 小鼠中，用于瘦素输液的渗透泵可能会损害颈部环的准确 SpO₂信号检测。在这种情况下，HVR 基于在规范和低氧条件下的 FiO₂值（HVR = +V_E / +FiO₂¹¹） 进行计算。

3. 胡萝卜体变性或胡萝卜气突神经解剖（CSND）

注:我们进行了手术和化学变性联合一周分开，因为手术变性本身并不能消除缺氧的化学变性。

1. 手术准备
   1. 对成年雄性C57BL/6J小鼠执行所有手术。消毒所有手术器械。使用无菌手术手套、注射器和棉尖施用器。
   2. 用鼻锥麻醉雄性C57BL/6J小鼠，用1-2%的异常胶，放置一个温暖的毯子，以防止体温过低。无卢兰经过仔细的分级，使呼吸速率保持在1赫兹（60次呼吸/分钟）。手术前麻醉的充分性将通过呼吸频率、无运动和可听到的噪音、对触觉刺激无反应以及前肢或后肢踏板退步反射来评估。
   3. 在腹内服用布丙诺啡（0.05毫克/千克），以防止疼痛不适。去除颈部腹腔区域的头发，用βdine和酒精对该区域进行消毒。
   4. 为了防止角膜干燥，在麻醉期间用无菌的眼药膏润滑小鼠的眼睛。
2. CSND 程序
   第1阶段:手术变性
   1. 中线切口后，通过切除结缔组织和脂肪组织，暴露常见胡萝卜动脉的分叉。
   2. 识别低光泽神经，这通常是非常突出的，然后抬起它，露出紧接着的光泽神经。使用微型弹簧剪刀双边分离胡萝卜体神经。
   3. 用 6-0 丝质缝合关闭切口。
   4. 施用1 mL的正常盐水皮下，以防止脱水。
   5. 将小鼠安置在恢复室中，并每15分钟监测它们的行为，最初1小时，直到小鼠恢复意识，以保持胸腔性。老鼠完全康复后，将它们送回家中的笼子。在接下来的3天里，每天对老鼠进行两次监测。如果小鼠表现出任何疼痛迹象（例如，食欲下降、烦躁不安），则给予额外的丁丙诺啡。
      第 2 阶段:化学变性
   6. 手术后一周，在从光鲜神经到CB颅杆的分枝点，用乙醇中稀释2%酚的溶液涂漆胡萝卜动脉。手术后应提供相同的术后护理，如上述手术变性部分所述。
      注:对于假手术组，除胡萝卜气动神经切除外，执行相同的程序。
   7. 让动物在HVR测量前恢复5-7天。

4. 使用腺病毒载体（Ad-LepR^b）与控制 （Ad-LacZ） 在 CB 中表达 LepR^b

1. Ad-LepR^b和Ad-LacZ悬架
   1. 将带有腺病毒的小鼠（Ad-LepRb-GFP，2-5x10¹⁰ pfu/mL 用于过度表达，Ad-Lacz，1 x 10¹⁰ pfu/mL 用于控制）转移到 CB 区域。
   2. 在4°C的冰箱中浸入冰中的小瓶，将Matrigel基质解冻过夜。
   3. 在1:5（Matrigel基质的1μL和双联应用腺病毒的4μL）中轻轻悬浮在液体Matrigel基质中的腺病毒。
   4. 始终在冰上保持病毒悬浮液，直到在CB中应用。
2. 手术准备
   1. 使用与 CSND 协议相同的手术器械。
   2. 麻醉LepR^b-缺乏db/db小鼠，使用鼻锥体使用 2-2.5% 的异常鲁兰，并将动物放在温暖的毯子上，以防止体温过低。无卢兰经过仔细的分级，使呼吸速率保持在1赫兹（60次呼吸/分钟）。麻醉的充分性将由呼吸频率、无运动和可听到的噪音、对触觉刺激无反应以及前肢或后肢踏板退步反射来评估。
   3. 内腹管内管理丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。
   4. 去除颈部腹腔区域的头发，并按照 CSND 协议对区域进行 βdine 和酒精消毒。
   5. 为了防止角膜干燥，在麻醉期间用无菌的眼药膏润滑小鼠的眼睛。
3. CB的腺病毒治疗
   1. 根据 CSND 协议中所述，公开 CB，并将病毒悬浮液的 5 μL 双边应用到 CB 区域。
   2. 等待2-3分钟，直到液体母凝胶基质变成凝胶。确认病毒悬浮液凝结后，用6.0丝缝合关闭切口。
4. 手术后
   1. 将小鼠安置在恢复室中，并每15分钟监测它们的行为，最初1小时，直到小鼠恢复意识，以保持胸腔性。老鼠完全康复后，将它们送回家中的笼子。在接下来的3天里，每天对老鼠进行两次监测。如果小鼠表现出任何疼痛迹象（例如，食欲下降、烦躁不安），则给予额外的丁丙诺啡。
   2. 根据需要在腹内施用布丙诺啡（0.05毫克/千克），以防止术后期间出现疼痛不适。
   3. 在腺病毒转染后9天测量HVR。

结果

连续输注瘦素显著增加瘦C57BL/6J小鼠的HVR，从0.23升至0.31 mL/min/g/g/-FiO_2（P <0.001，^图2）11。 CSND废除了HVR的瘦素诱导增加（图2），而瘦素输液后假手术组未观察到CSND对HVR的衰减效应。

LepR b 在LepR^b缺乏肥胖db/db小鼠的 CB 中的 LepR^b表达导致 HVR 显著增加，从 0.05 mL/min/g/μSpO

讨论

我们研究的主要重点是检查瘦素信号在CB中的呼吸效应。已经开发了几种协议来评估瘦素在机械方式中的作用。首先，通过仔细定量HVR在缺氧暴露的前2分钟，分析了CB对HVR的具体贡献。第二，通过两种互补的方法考察了CB在瘦素介导的呼吸控制调节中的相关性。在瘦野生型小鼠中，瘦素水平低，在基线和连续输液后测量HVR;实验在CB变性后重复。在LepR^b-缺陷db/db小鼠中，HV...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Insulin Syringes	BD Biosciences	309311
1x PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023	500 ml
Ad-Lacz	Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)		1x1010 pfu/ml
Ad-LepRb-GFP	Vector Biolabs	ADV-263380	2-5x1010 pfu/ml
Anesthetic cart	Atlantic Biomedical
Betadine	Purdue Products Ltd.	12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	0.3mg/ml
C57Bl/6J	Jackson laboratory	000664	Mice Strain
Cotton Gauze Sponges	Fisherbrand	22-362-178
db/db	Jackson laboratory	000697	Mice Strain
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Isoflurane	Vetone	502017
Lab Chart	Data Science International (DSI)		Software
Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
Micro Spring Scissors	World Precision Instruments (WPI)	14124
Mouse Ox Plus	STARR Life Sciences Corp.		Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor	STARR Life Sciences Corp.	015022-2	Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber	Data Science International (DSI)	PLY3211
Ohio Care Plus Incubator	Ohmeda	HCHD000173
Operating Scissors	World Precision Instruments (WPI)	501753-G	Straight
Osmotic Pump	Alzet	1003D	1ul per hour, 3 days
Phenol	Sigma-Aldrich	P4557
Recombinant Mouse Leptin protein	R&D systems	498-OB-05M	5mg
Saline	RICCA Chemical	7210-16	0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture	DemeTech	DT-639-1	Silk, size 6-0
Thermometer	Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)	EW 20250-91