Approche expérimentale pour examiner la signalisation de leptine dans les corps carotides et ses effets sur le contrôle de la respiration

Résumé

Notre étude se concentre sur les effets de la signalisation de leptine dans le corps carotide (CB) sur la réponse ventilatoire hypoxique (HVR). Nous avons effectué des expériences de « perte de fonction » mesurant l'effet de la leptine sur le HVR après la dénervation CB et les expériences de « gain de fonction » mesurant le HVR après surexpression du récepteur de la leptine dans CB.

Résumé

Une hormone produite par l'adipocyte la leptine est un stimulant respiratoire puissant, qui peut jouer un rôle important dans la défense de la fonction respiratoire dans l'obésité. Les corps carotides (CB), un organe clé de la sensibilité hypoxique périphérique, expriment le long isoforme fonctionnel du récepteur de la leptine (LepR^b) mais le rôle de la signalisation de lepin dans le contrôle de la respiration n'a pas été entièrement élucidé. Nous avons examiné la réponse ventilatoire hypoxique (HVR) (1) chez les souris C57BL/6J avant et après l'infusion de leptine à la ligne de base et après la dénervation de CB ; (2) dans LepR^b-déficients obèses souris db/db à la ligne de base et après le lepR^b surexpression dans les CBs. Dans les souris de C57BL/6J, le leptin a augmenté HVR et les effets de la leptine sur HVR ont été supprimés par la dénervation de CB. Chez les souris db/db, l'expression lepR^b en CB a augmenté le HVR. Par conséquent, nous concluons que la leptine agit dans CB pour augmenter les réponses à l'hypoxie.

Introduction

Un adipocyte produit des actes d'hormone de leptine dans l'hypothalamus pour supprimer la prise de nourriture et augmenter le taux métabolique. Les études exécutées dans notre laboratoire^1,2 et par d'autres investigateurs^3,4 ont prouvé que le leptine augmente la réponse ventilatoire hypercapnique (HVR) empêchant l'hypoventilation d'obésité dans la leptine l'obésité déficiente. Cependant, une majorité d'individus obèses ont des niveaux élevés de leptine de plasma et démontrent la résistance aux effets métaboliques et respiratoires de l'hormone^5,6,7,8. La résistance à la leptine est multifactorielle, mais la perméabilité limitée de la barrière hémato-encéphalique (BBB) à la leptine joue un rôle majeur. Nous proposons que la leptine agit au-dessous de BBB dans un organe clé de la sensibilité hypoxique périphérique, les corps carotides (CB), pour défendre la respiration dans les individus obèses. Les CB expriment le long isoforme fonctionnel du récepteur de lepin, LepR^b, mais le rôle de CB dans les effets respiratoires de la leptine n'a pas été suffisamment élucidé^9,10.

Le but de notre méthode était d'examiner l'effet de la signalisation de leptine dans le CB sur HVR. Notre justification était d'effectuer (a) la perte des expériences de fonction infusant la leptine chez les souris avec les corps carotides intacts et les corps carotides denervated suivis des mesures de HVR ; b) gain d'expériences fonctionnelles chez des souris db/db dépourvues de LepR^b, dans lesquelles nous avons mesuré le HVR à la ligne de base et après l'expression de LepR^b exclusivement en CB. L'avantage de nos techniques était que nous avons effectué toutes nos expériences chez des souris non anésiles non retenues pendant le sommeil et l'éveil. Les chercheurs précédents ont effectué leurs expériences sous anesthésie⁹ ou n'ont pas mesuré les effets de la leptine pendant le sommeil¹⁰. En outre, notre étude est la première à utiliser un gain unique de l'approche de fonction avec l'expression sélective de LepR^b dans CB décrit ci-dessus.

Dans le contexte général, notre approche peut être généralisée à d'autres récepteurs exprimés dans CB et leur rôle dans la sensibilité hypoxique. Les investigateurs peuvent infuser un ligand à un récepteur d'intérêt et mesurer le HVR à la ligne de base et après la dénervation de CB. En tant qu'approche complémentaire, un récepteur d'intérêt peut être surexprimé dans les mesures CB et HVR peuvent être effectuées avant et après la surexpression en utilisant notre technologie décrite dans ce manuscrit.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (MO18M211).

1. Infusion de leptin

REMARQUE: Afin d'examiner l'effet de la leptine sur la respiration, nous avons infusé la leptine sous-cutanée dans les souris maigres c57BL/6J par une pompe osmotique pour augmenter les niveaux circulants de leptine à ceux observés chez les souris obèses.

1. Préparation de la pompe osmotique
   1. Peser la pompe vide pour vérifier le poids net de la solution chargée.
   2. Ajouter la leptine (5 mg/ml) à la pompe osmotique (1 l/h pendant 3 jours). Remplir la pompe d'une petite seringue (1 ml). Après le remplissage, fermez la pompe avec le tube de remplissage de 27 jauges à pointe émoussée fourni.
      REMARQUE: La seringue et le tube attenant doivent être exempts de bulles d'air.
   3. Après le remplissage, peser la pompe à nouveau pour vérifier le poids net de la solution.
   4. Insérez la pompe à leptine sous-cutanée dans la zone interscapulaire.
      REMARQUE : Si vous voulez commencer l'infusion immédiatement, incubez la pompe préremplie dans la saline stérile à 37 oC pendant au moins 4 à 6 h (de préférence pendant la nuit).

2. Réponse ventilatoire hypoxique (HVR)

REMARQUE: Les conditions thermoneutres éliminent les facteurs stressants imposés par la température ambiante fraîche et modifient considérablement le métabolisme chez les souris. Par conséquent, toutes les mesures respiratoires doivent être effectuées dans les conditions thermoneutres (t ' 30 oC) à l'aide d'un incubateur néonatal¹² (figure 1A). L'ensemble de la chambre de pléthysmographie du corps (WBP) a été utilisé pour toutes les mesures. Tous les animaux doivent être acclimatés à la chambre de pléthysmographie barométrique et à un collier de cou simulé pour l'enregistrement ultérieur d'oxymétrie d'impulsion pendant 3-5 jours avant les mesures de HVR. HVR est enregistré entre 10 h et 17 h. Le HVR est supprimé pendant le sommeil, c'est pourquoi il peut être mesuré séparément pendant le sommeil et l'éveil tranquille¹³. Pour assurer le stade spécifique de veille-sommeil de l'animal pendant la mesure de HVR, les électrodes d'EEG/EMG devraient être implantées comme headmount d'EEG/EMG comme précédemment décrit^14. Les animaux doivent être autorisés à récupérer pendant au moins 72 h après le front. La mise en scène de sommeil doit être exécutée dans 5 s époques. Le sommeil NREM est reconnu par l'activité eEG à ondes lentes occupant plus de 50% de l'époque. L'éveil tranquille se manifeste par l'activité alpha EEG en l'absence de mouvements. Le sommeil paradoxal est identifié par l'activité prédominante d'Alpha et de theta EEG en présence du tonus musculaire réduit sur EMG. Typiquement, le sommeil paradoxal n'est pas observé pendant les défis de gaz de HVR.

1. Le protocole d'enregistrement HVR
   1. Utilisez la chambre WBP de la taille suivante : diamètre interne de 80 mm, hauteur de 50,5 mm et volume de 0,4 L. La chambre WBP se compose de deux chambres, des chambres scellées et de référence, et d'une plate-forme circulaire pour placer la souris¹⁴ (figure 1B). L'entrée et l'écoulement à l'intérieur de la chambre sont contrôlés par des sources de pression positives et négatives qui maintiennent la pression atmosphérique. Ce contrôle crée un flux de biais régulier dans la chambre et empêche la rétention de CO_2. Pour plus de détails sur la mise en place du WBP, voir Hernandez et ses collègues¹⁵.
   2. Mesurez la température à l'intérieur de la chambre et l'humidité relative dans la pièce avant de placer la souris dans le WBP.
   3. Mesurer le poids corporel et la température rectale.
   4. Placez le collier d'oxymètre autour du cou de la souris (la zone doit être déjà rasée).
   5. Placez la souris à l'intérieur du WBP et assurez-vous que la chambre est complètement scellée afin d'éviter les fuites d'air.
   6. Attendez environ 30 min jusqu'à ce que la souris soit silencieuse et que la chambre soit à un volume constant.
   7. Normoxia: après 30 min, si la souris est silencieuse, commencer à enregistrer les signaux respiratoires et la saturation périphérique de l'oxygène (SpO₂) à la phase normoxia (21% FiO₂ à 1 atm de pression) pendant 20 min, en utilisant LabChart 7 Pro (version 7.2).
   8. Hypoxie: après 20 min de normoxie tranquille, commencer à enregistrer le premier cycle de l'hypoxie aigue et SpO₂. Pour la phase d'hypoxie, exposez les animaux à un flux constant de gaz mixte composé de 10 % O₂ et de 3 % de CO₂ pendant 5 min.
      1. Au cours des 30 premières secondes d'hypoxie, le gaz mixte traverse la chambre via 2 petits ports latéraux à la base permettant au FiO₂ de passer de 21% (à 1 atm de pression) à 10%.
      2. Après les 30 s initiaux, fermez l'un des petits ports latéraux de la chambre WBP et continuez à enregistrer à l'hypoxie constante à 10% FiO₂ pendant 5 min.
         REMARQUE: Le mélange de 10% O₂ et 3% CO₂ à l'hypoxie est utilisé afin de maintenir l'eucapnée¹¹.
   9. Après les 5 min d'hypoxie, exposez la souris à l'air de la pièce à nouveau (21% FiO₂ à 1 atm de pression) en changeant la source d'entrée.
   10. Attendre au moins 30 min jusqu'à ce que le prochain enregistrement normoxia afin de récupérer de l'exposition hypoxique précédente pour éviter le phénomène de repérage ventilatoire (c.-à-d., suppression centrale de la respiration pendant l'hypoxie¹⁶).
       REMARQUE: Répétez les cycles normoxia/hypoxie trois fois dans chaque souris pour assurer la reproductibilité des mesures. D'après notre expérience, les expositions hypoxiques supplémentaires (plus de 3 fois par jour) devraient être évitées, en raison de l'adaptation ventilatoire (phénomène de roll-off).
   11. À la fin de l'expérience, calibrer la chambre WBP (avec la souris est toujours à l'intérieur) en injectant 1 ml d'air de pièce 3 fois avec une seringue branchée dans l'un des petits ports latéraux à la base de la chambre.
   12. Mesurer à nouveau la température dans la chambre avec l'animal à l'intérieur.
   13. Ouvrez la chambre et mesurez la température rectale de la souris avant de la remettre dans sa cage d'origine.
2. Calcul HVR
   1. Numériser tous les signaux pour le calcul HVR à 1 000 Hz (fréquence d'échantillonnage par canal).
      REMARQUE: L'analyse du volume des marées du WBP est effectuée dans le tableau de laboratoire 7 basé sur l'équation¹⁷de Drorbaugh et Fenn. Les variables requises comprennent la température rectale de la souris et la température de la chambre (avant et après la mesure hVR), l'humidité relative et la constante du gaz de chambre. Cette constante résulte de la déviation de la pression WBP après les injections d'air de 1 ml dans la phase d'étalonnage. Pour plus de détails, voir Hernandez et ses collègues¹⁵.
   2. Après avoir calculé l'équation de Drorbaugh et Fenn, multipliez le canal de la chambre de volume de marée (Vt) par la constante.
   3. Sélection d'enregistrements pour l'analyse
      1. Normoxie : sélectionnez uniquement les sections de respiration constante avec un volume de marée constant. Évitez les sections à proximité des mouvements de la souris.
      2. Hypoxie : jetez les 30 premiers s lorsque les niveaux o₂ diminuent de 21 % à 10 %, choisissez des sections de 30 s à 2 min d'exposition à 10 % O₂ (un intervalle de 90 s). Dans cet intervalle, sélectionnez uniquement les sections à respiration constante avec un volume de marée constant. Évitez les sections à proximité des mouvements de la souris. L'analyse est fiable si au moins 10 s d'hypoxie sont sélectionnés dans chaque cycle.
         REMARQUE: La composante périphérique de chemoreflex régi par CB prédomine au cours de la première 1-2 min d'exposition^16,18,19. Au cours de la deuxième phase, entre 2 min et 5 min d'exposition hypoxique, le composant périphérique et central joue un rôle. Enfin, la troisième phase, la 5 min, se caractérise par une hypoventilation (le phénomène de roll-off) régie principalement par des chimiorécepteurs centraux. Notre expérience montre que les souris sont souvent éveillées pendant l'exposition hypoxique en raison des commutateurs manuels dans la source de flux d'air.
   4. Après la sélection, calculer la ventilation minute moyenne (V_E) à des conditions normoxiques et hypoxiques en utilisant la formule V_E - taux respiratoire X volume de marée.
   5. Calculer la moyenne SpO₂ à des conditions de normoxie et d'hypoxie.
   6. Calculez le HVR manuellement à l'aide de la formule HVR (V_E (10 % O₂) - V_E (21 %O₂)) / (SpO₂ (10 % O₂) - SpO₂ (21 % O₂)).
      REMARQUE: Chez les souris C57BL/6J, la pompe osmotique pour l'infusion de leptine peut altérer la détection précise du signal SpO₂ par le col du cou. Dans ce cas, HVR est calculé sur la base des valeurs FiO₂ à des conditions normotiques et hypoxiques comme HVR '_{V E} / 'FiO₂¹¹.

3. Dénervation du corps carotide ou dissection du nerf du sinus carotide (CSND)

REMARQUE: Nous avons exécuté la dénervation chirurgicale et chimique combinée une semaine d'intervalle, parce que la dénervation chirurgicale seule n'abolit pas le chemoreflex hypoxique.

1. Préparation chirurgicale
   1. Effectuer toutes les procédures sur les souris mâles adultes C57BL/6J. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux. Utilisez des gants chirurgicaux stériles, des seringues et des applicateurs à pointe de coton.
   2. Anesthésiez les souris mâles C57BL/6J avec 1-2% d'isoflurane à l'aide d'un cône nasal et placez une couverture chaude pour prévenir l'hypothermie. L'isoflurane est soigneusement titré pour maintenir la fréquence respiratoire à 1 Hz (60 respirations/min). L'adéquation de l'anesthésie avant le début des chirurgies sera évaluée par la fréquence respiratoire, l'absence de mouvements et de bruits sonores, l'absence de réponse aux stimuli tactiles et le réflexe de sevrage de l'avant-membre ou de la pédale postérieure.
   3. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone pour prévenir l'inconfort de la douleur. Enlever les poils à la région ventrale du cou et désinfecter la zone avec de la bétadine et de l'alcool.
   4. Pour prévenir la dessiccation cornéenne, lubrifier les yeux des souris avec un onestorat ophtalmique stérile pendant l'anesthésie.
2. Procédures cSND
   Étape 1 : Dénervation chirurgicale
   1. Après l'incision de midline, exposez la bifurcation des artères carotides communes en enlevant des tissus conjonctifs et du tissu adipeux.
   2. Identifiez le nerf hypoglossal, qui est habituellement très proéminent, et puis soulevez-le vers le haut pour exposer le nerf glossaryngeal immédiatement dessous. Disséquer les nerfs carotides de sinus bilatéralement utilisant des ciseaux de ressort micro.
   3. Fermer l'incision avec 6-0 suture de soie.
   4. Administrer 1 ml de saline normale sous-cutanée pour prévenir la déshydratation.
   5. Loger les souris dans une chambre de récupération et surveiller leur comportement toutes les 15 min pendant 1 h initial jusqu'à ce que les souris reprennent conscience pour maintenir la charge sternale. Renvoyez les souris dans leurs cages d'origine après leur récupération complète. Continuez à surveiller les souris deux fois par jour pendant les 3 prochains jours. Donnez de la buprénorphine supplémentaire si les souris présentent des signes de douleur (p. ex., diminution de l'appétit, agitation).
      Étape 2 : Dénervation chimique
   6. Une semaine après la chirurgie, peindre l'artère carotide avec une solution de 2% de phénol dilué dans l'éthanol au point de ramification du nerf glossopharyngé au pôle crânien du CB. Les mêmes soins postopératoires devraient être fournis après la dénervation chimique comme décrit ci-dessus dans la section chirurgicale de dénervation.
      REMARQUE : Pour un groupe de chirurgie de faux, les mêmes procédures sont exécutées excepté la dissection carotide de nerf de sinus.
   7. Laissez les animaux récupérer pendant 5-7 jours avant les mesures HVR.

4. Expression de LepR^b dans le CB à l'aide d'un vecteur adénoviral (Ad-LepR^b) vs control (Ad-LacZ)

1. Suspension Ad-LepR^b et Ad-LacZ
   1. Transfect les souris avec adénovirus (Ad-LepR^b-GFP, 2-5x10¹⁰ pfu/mL pour la surexpression, Ad-Lacz, 1 x 10¹⁰ pfu/mL pour le contrôle) à la zone CB.
   2. Décongeler la matrice de Matrigel en submergeant le flacon dans de la glace dans un réfrigérateur de 4 oC pendant la nuit.
   3. Suspendre délicatement l'adénovirus dans la matrice liquide de Matrigel à 1:5 (1 l de matrice matrigel et 4 l d'adénovirus appliqué bilatéralement).
   4. Gardez toujours la suspension virale sur la glace jusqu'à ce qu'elle soit appliquée dans le CB.
2. Préparation chirurgicale
   1. Utilisez les mêmes instruments chirurgicaux que le protocole CSND.
   2. Anesthésiez les souris LepR^{b-déficientes} db/db avec 2-2.5% isoflurane utilisant un cône de nez et placez les animaux sur une couverture chaude pour empêcher l'hypothermie. L'isoflurane est soigneusement titré pour maintenir la fréquence respiratoire à 1 Hz (60 respirations/min). L'adéquation de l'anesthésie sera évaluée par la fréquence respiratoire, l'absence de mouvements et de bruits sonores, l'absence de réponse aux stimuli tactiles et le réflexe de retrait de la pédale de l'avant ou de l'arrière-pays.
   3. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone.
   4. Enlever les poils à la région ventrale du cou et désinfecter la zone avec de la bétadine et de l'alcool comme dans le protocole CSND.
   5. Pour prévenir la dessiccation cornéenne, lubrifier les yeux des souris avec un onestorat ophtalmique stérile pendant l'anesthésie.
3. Traitement de l'adénovirus du CB
   1. Exposer les CB tels que décrits dans le protocole cSND et appliquer 5 ll de la suspension virale à la zone CB bilatéralement.
   2. Attendez 2-3 min jusqu'à ce que la matrice liquide Matrigel devienne un gel. Après avoir confirmé que la suspension virale a été congealed, fermez l'incision avec la suture de soie 6.0.
4. Après la chirurgie
   1. Loger les souris dans une chambre de récupération et surveiller leur comportement toutes les 15 min pendant 1 h initial jusqu'à ce que les souris reprennent conscience pour maintenir la charge sternale. Renvoyez les souris dans leurs cages d'origine après leur récupération complète. Continuez à surveiller les souris deux fois par jour pendant les 3 prochains jours. Donnez de la buprénorphine supplémentaire si les souris présentent des signes de douleur (p. ex., diminution de l'appétit, agitation).
   2. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone au besoin pour prévenir l'inconfort de la douleur pendant la période postopératoire.
   3. Mesurez le HVR 9 jours après la transfection de l'adénovirus.

Résultats

L'infusion continue de leptine a considérablement augmenté le HVR chez les souris maigres C57BL/6J de 0,23 à 0,31 ml/min/g/FiO₂ (P lt; 0,001, figure 2)¹¹. CSND a aboli l'augmentation induite par la leptine dans HVR (figure 2), tandis qu'aucun effet atténuant de CSND sur HVR n'a été observé dans le groupe de chirurgie de faux après perfusion de leptine.

L'expression de LepR^b dans le...

Discussion

L'objectif principal de notre étude était d'examiner les effets respiratoires de la signalisation de leptine dans le CB. Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer le rôle de la leptine d'une manière mécaniste. Tout d'abord, la contribution spécifique de CB au HVR a été analysée par la quantification soigneuse du HVR pendant les 2 premières min d'exposition hypoxique. Deuxièmement, la pertinence de cb dans la régulation de la leptine du contrôle de la respiration a été examinée par deux appro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Insulin Syringes	BD Biosciences	309311
1x PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023	500 ml
Ad-Lacz	Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)		1x1010 pfu/ml
Ad-LepRb-GFP	Vector Biolabs	ADV-263380	2-5x1010 pfu/ml
Anesthetic cart	Atlantic Biomedical
Betadine	Purdue Products Ltd.	12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	0.3mg/ml
C57Bl/6J	Jackson laboratory	000664	Mice Strain
Cotton Gauze Sponges	Fisherbrand	22-362-178
db/db	Jackson laboratory	000697	Mice Strain
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Isoflurane	Vetone	502017
Lab Chart	Data Science International (DSI)		Software
Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
Micro Spring Scissors	World Precision Instruments (WPI)	14124
Mouse Ox Plus	STARR Life Sciences Corp.		Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor	STARR Life Sciences Corp.	015022-2	Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber	Data Science International (DSI)	PLY3211
Ohio Care Plus Incubator	Ohmeda	HCHD000173
Operating Scissors	World Precision Instruments (WPI)	501753-G	Straight
Osmotic Pump	Alzet	1003D	1ul per hour, 3 days
Phenol	Sigma-Aldrich	P4557
Recombinant Mouse Leptin protein	R&D systems	498-OB-05M	5mg
Saline	RICCA Chemical	7210-16	0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture	DemeTech	DT-639-1	Silk, size 6-0
Thermometer	Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)	EW 20250-91