Экспериментальный подход к изучению лептина сигнализации в сонной телах и его влияние на контроль дыхания

Резюме

Наше исследование фокусируется на воздействии лептина сигнализации в сонной артерии (CB) на гипоксической вентиляционной реакции (HVR). Мы провели эксперименты «потеря функции», измеряя влияние лептина на HVR после денервации ЦБ и «выгоды функции» экспериментов, измеряя HVR после переэкспрессии рецептора лептина в ЦБ.

Аннотация

Адипоцит производства гормона лептина является мощным стимулятором дыхания, который может играть важную роль в защите дыхательной функции при ожирении. Сонных тел (CB), ключевой орган периферической гипоксической чувствительности, выразить длительный функциональный изоформы рецептора лептина (LepR^b), но роль лептина сигнализации в контроле дыхания не была полностью выяснена. Мы изучили гипоксический вентиляционный ответ (HVR) (1) у мышей C57BL/6J до и после вливания лептина на базовом уровне и после денервации ЦБ; (2) в LepR^b-дефицитных тучных дБ/дб мышей на базовом уровне и после переэкспрессии LepR^b в CBs. У мышей C57BL/6J, лептин увеличил HVR и эффекты лептина на HVR были отменены денервацией CB. В db/db мышей, LepR^b выражение в CB увеличило HVR. Таким образом, мы делаем вывод, что лептин действует в ЦБ для увеличения реакции на гипоксию.

Введение

Адипоцит производится гормон лептин действует в гипоталамусдляе для подавления прием пищи и увеличение скорости обмена веществ. Исследования, проведенные в нашей лаборатории^1,2 и другими следователями^3,4 показали, что лептин увеличивает гиперкапный вентиляционный ответ (HVR) предотвращения ожирения гиповентиляции в лептине неполноценного ожирения. Тем не менее, большинство людей, страдающих ожирением имеют высокий уровень плазмы лептина и демонстрируют устойчивость к метаболическим и респираторным эффектам гормона^5,6,7,8. Сопротивление лептину является многофакторным, но ограниченная проницаемость гематоэнцефалического барьера (BBB) к лептину играет важную роль. Мы предлагаем, чтобы лептин действует ниже BBB в ключевом органе периферической гипоксической чувствительности, сонных тел (CB), чтобы защитить дыхание у людей с ожирением. ЦБ выражают длинную функциональную изоформу рецептора лептина, LepR^b, но роль ЦБ в респираторных эффектах лептина недостаточно прояснена^9,10.

Целью нашего метода было изучение влияния лептина сигнализации в ЦБ на HVR. Наше обоснование состояло в том, чтобы выполнять (а) потерю функциональных экспериментов, вливающих лептин у мышей с нетронутыми сонной артерией и денерватированными сонной артерией, за которыми следуют измерения HVR; b) увеличение функциональных экспериментов на дб/дб мышах, не хватает LepR^b, в которых мы измеряли HVR на базовом уровне и после выражения LepR^b исключительно в ЦБ. Преимуществом наших техник было то, что мы проводили все наши эксперименты на безудержных безобездененных мышах во время сна и бодрствования. Предыдущие исследователи либо проводили свои эксперименты под наркозом^9, либо не измеряли эффекты лептина во время сна¹⁰. Кроме того, наше исследование является первым использовать уникальный прирост функционального подхода с селективным выражением LepR^b в CB описано выше.

В широком контексте, наш подход может быть обобщен к другим рецепторам, выраженным в ЦБ и их роль в гипоксической чувствительности. Следователи могут наполнить лиганд рецептором интереса и измерить HVR на базовом уровне и после денервации ЦБ. В качестве дополнительного подхода, рецептор интереса может быть перевыражен в CB и HVR измерения могут быть выполнены до и после переэкспрессии с использованием нашей технологии, описанной в этой рукописи.

протокол

Все экспериментальные протоколы были утверждены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (MO18M211).

1. Настой лептина

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы изучить влияние лептина на дыхание, мы влились лептина подкожно в худой C57BL/6J мышей осмотического насоса для повышения циркулирующих уровней лептина для тех, наблюдается в тучных мышей.

1. Осмотическая подготовка насоса
   1. Взвесьте пустой насос, чтобы проверить чистый вес нагруженного раствора.
   2. Добавьте лептин (5 мг/мл) в осмотический насос (1 л/ч в течение 3 дней). Заполните насос небольшим шприцем (1 мл). После заполнения, закрыть насос с при условии, тупой наконечником 27 калибровочных заполнения трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шприц и прикрепленная трубка должны быть свободны от пузырьков воздуха.
   3. После заполнения, взвесить насос еще раз, чтобы проверить чистый вес раствора.
   4. Вставьте насос лептина подкожно в межлопатулярной области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы хотите начать вливание немедленно, инкубировать предварительно заполненный насос в стерильных солевой раствор на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере от 4 до 6 ч (желательно на ночь).

2. Гипоксический вентиляционный ответ (HVR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Термонейтральные условия устраняют стрессовые факторы, налагаемые прохладной температурой окружающей среды, и значительно изменяют обмен веществ у мышей. Таким образом, все дыхательные измерения должны быть выполнены в термонейтральных условиях (т 30 градусов по Цельсию) с помощью неонатального инкубатора¹² (рисунок 1A). Для всех измерений использовалась целая камера плейсмографии (ВБП). Все животные должны быть акклиматизированы к барометрической камере плейсмографии и к фиктивному воротнику шеи для последующей записи оксиметрии пульса в течение 3-5 дней до измерений HVR. HVR записывается между 10 am и 5 PM. HVR подавляется во время сна, поэтому его можно измерить отдельно во время сна и тихого бодрствования^13. Для обеспечения конкретной стадии сна-бодрствования животного во время измерения HVR, ЭЭГ / ЭМГ электроды должны быть имплантированы в качестве ЭЭГ / ЭМГ headmount, как ранее описано¹⁴. Необходимо, чтобы животные восстанавливали не менее 72 ч после ошёл. Постановка сна должна быть выполнена в 5-х эпохах. Сон NREM распознается медленной волновой активностью ЭЭГ, занимающей более 50% эпохи. Тихое бодрствование проявляется в активности альфа-ЭЭГ при отсутствии движений. Rem сон определяется преобладающей альфа и тета ЭЭГ деятельности при наличии снижения мышечного тонуса на ЭМГ. Как правило, REM сон не наблюдается во время hVR газовых проблем.

1. Протокол записи HVR
   1. Используйте камеру WBP следующего размера: внутренний диаметр 80 мм, высота 50,5 мм и объем 0,4 л. Камера WBP состоит из двух камер, герметичных и эталонных камер, а также круговой платформы для размещения мыши¹⁴ (рисунок 1B). Приток и отток внутри камеры контролируются источниками положительного и отрицательного давления, поддерживающими атмосферное давление. Этот контроль создает устойчивый поток смещения в камере и предотвращает удержание CO_2. Для получения более подробной информации о WBP создана, см Эрнандес и коллеги¹⁵.
   2. Измерьте температуру внутри камеры и относительную влажность в помещении до размещения мыши в WBP.
   3. Измерьте массу тела и ректальную температуру.
   4. Положите ошейник оксиметра вокруг шеи мыши (область должна быть предварительно побрился).
   5. Поместите мышь внутри WBP и убедитесь, что камера полностью опечатана, чтобы избежать утечки воздуха.
   6. Подождите около 30 минут, пока мышь не затихнет и камера не будет в постоянном объеме.
   7. Нормоксия: после 30 мин, если мышь тихая, начните записывать дыхательные сигналы и насыщение периферического кислорода (SpO₂) на фазе нормоксии (21% FiO₂ при 1 атме давления) в течение 20 мин, используя LabChart 7 Pro (версия 7.2).
   8. Гипоксия: после 20 мин тихой нормоксии, начать запись первого цикла острой гипоксии и SpO₂. Для фазы гипоксии, подвергать животных к постоянному смешанному потоку газа, состоящий на 10% O₂ и 3% CO₂ в течение 5 мин.
      1. В течение первых 30 сек гипоксии, смешанный газ течет через камеру через 2 небольших боковых портов на базе позволяет FiO₂ упасть с 21% (на 1 атм давления) до 10%.
      2. После первых 30 с, закрыть один из небольших боковых портов камеры WBP и держать запись на постоянной гипоксии на 10% FiO₂ в течение 5 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь 10% O₂ и 3% CO₂ при гипоксии используется для поддержания эвкапнеи¹¹.
   9. После 5 минут гипоксии, подвергать мышь в комнате воздуха снова (21% FiO₂ на 1 атм давления) путем переключения источника притока.
   10. Подождите, по крайней мере 30 минут до следующей записи normoxia для того, чтобы оправиться от предыдущего гипоксического воздействия, чтобы избежать вентилятора свертывания явление (т.е. центральное подавление дыхания во время гипоксии¹⁶).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите циклы нормоксии/гипоксии три раза в каждой мыши, чтобы обеспечить воспроизводимость измерений. По нашему опыту, дополнительные (более 3 раз в данный день) гипоксические воздействия следует избегать, из-за вентиляционной адаптации (явление свертывания).
   11. В конце эксперимента откалибруем камеру WBP (с помощью мыши все еще внутри) путем введения 1 мл комнатного воздуха 3 раза со шприцем, подключенным к одному из небольших боковых портов у основания камеры.
   12. Измерьте температуру в камере снова с животным внутри его.
   13. Откройте камеру и измерьте ректальную температуру мыши, прежде чем поместить ее обратно в домашнюю клетку.
2. Расчет HVR
   1. Оцифровать все сигналы для расчета HVR на уровне 1000 Гц (частота выборки на канал).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ приливного объема WBP выполняется в Lab Chart 7 на основе уравнения Дрорбо и Фенна¹⁷. Требуемые переменные включают температуру прямой кишки мыши и температуру камеры (до и после измерения HVR), относительную влажность, и постоянную камеру газа. Эта константа является результатом отклонения давления WBP после 1 мЛ инъекций воздуха в фазе калибровки. Для получения более подробной информации, см Эрнандес и коллеги¹⁵.
   2. После расчета уравнения Дрорбо и Фенна, умножьте приливный объем (Vt) камерный канал на константу.
   3. Выбор записей для анализа
      1. Нормоксия: выберите только участки устойчивого дыхания с постоянным приливным объемом. Избегайте секций в непосредственной близости от движений мыши.
      2. Гипоксия: отбросить первые 30 с, когда O₂ уровни снижаются с 21% до 10%, выберите разделы от 30 с до 2 мин 10% O₂ воздействия (интервал 90 с). В течение этого интервала выберите только секции с устойчивым дыханием с постоянным приливным объемом. Избегайте секций в непосредственной близости от движений мыши. Анализ является надежным, если по крайней мере 10 с гипоксии выбран в каждом цикле.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Периферийный компонент chemoreflex регулируется ЦБ преобладает в течение первых 1-2 мин воздействия^16,18,19. Во время второй фазы, между 2 мин и 5 мин гипоксического воздействия, как периферийный и центральный компонент играют определенную роль. Наконец, третья фаза, 5 мин, характеризуется гиповентиляцией (феномен свертывания), регулируется преимущественно центральными хеморецепторами. Наш опыт показывает, что мыши часто просыпаются во время гипоксической экспозиции из-за ручных переключателей в источнике воздушного потока.
   4. После отбора вычислите среднее минутное вентиляции (V_E)при нормоксических и гипоксических условиях с помощью формулы V_E и частоты дыхания X приливного объема.
   5. Рассчитайте среднее SpO₂ при нормоксии и гипоксии.
   6. Рассчитайте HVR вручную, используя формулу HVR (V_E (10% O₂) - V_E (21%O₂)) / (SpO₂ (10% O₂) - SpO₂ (21% O₂)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В C57BL/6J мышей, осмотический насос для инфузии лептина может ухудшить точное обнаружение сигнала SpO₂ воротником шеи. В этом случае, HVR рассчитывается на основе значений FiO₂ в нормоксических и гипоксических условиях, как HVR q V_E / »FiO₂¹¹.

3. Сонтидное тело Денервация или рассечение нервов синусовой сомарки (CSND)

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выполнили комбинированную хирургическую и химическую денервацию с одной неделей друг от друга, потому что хирургическая денервация сама по себе не отменяет гипоксического хеморефлекса.

1. Хирургическая подготовка
   1. Выполните все процедуры на взрослых мышах C57BL/6J. Стерилизовать все хирургические инструменты. Используйте стерильные хирургические перчатки, шприцы и хлопчатобумажные аппликаторы.
   2. Обезождение мужчин C57BL/6J мышей с 1-2% изофруран с помощью носового конуса и место теплое одеяло для предотвращения переохлаждения. Изофлуран тщательно титрдляют для поддержания частоты дыхания на уровне 1 Гц (60 вдохов/мин). Адекватность анестезии перед началом операции будет оцениваться по частоте дыхания, отсутствию движений и звуковых шумов, отсутствию реакции на тактильные раздражители и переднюю или заднюю педаль снятия рефлекса.
   3. Администрирование Бупренорфин (0,05 мг/кг) интраперитонеально для предотвращения боли дискомфорта. Удалить волосы в брюшной области шеи и дезинфицировать области с бетадином и алкоголем.
   4. Для предотвращения высыхания роговицы, смазать глаза мышей стерильной офтальмологический мазь во время анестезии.
2. Процедуры CSND
   Этап 1: Хирургическая денервация
   1. После разреза средней линии, разоблачить бифуркации общих сонных артерий, удалив соединительные ткани и жировой ткани.
   2. Определите гипоглоссальный нерв, который обычно очень заметен, а затем поднимите его, чтобы разоблачить глософофальный нерв сразу под ним. Вскрыть сонной синусовых нервов на двусторонней основе с помощью микро пружинных ножниц.
   3. Закройте разрез 6-0 шелковым швом.
   4. Администрирование 1 мл нормального солей подкожно для предотвращения обезвоживания.
   5. Дом мышей в камере восстановления и контролировать их поведение каждые 15 минут в течение первоначального 1 ч, пока мыши не прийти в сознание, чтобы сохранить суровый recumbency. Верните мышей в их домашние клетки после того, как они полностью выздоровеют. Продолжайте следить за мышами два раза в день в течение следующих 3 дней. Дайте дополнительный бупренорфин, если мыши проявляют какие-либо признаки боли (например, снижение аппетита, беспокойство).
      Этап 2: Химическая денервация
   6. Через неделю после операции покрасьте сонную артерию раствором 2% фенола, разбавленным в этаноле в точках ветвления от глософогенного нерва до черепного полюса ЦБ. Такая же послеоперационная помощь должна быть оказана после химической денервации, как описано выше в хирургическом отделении денервации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиктивной группы хирургии, те же процедуры выполняются, за исключением сонной синусовой нерв рассечения.
   7. Пусть животные восстановить в течение 5-7 дней до HVR измерений.

4. Выражение LepR^b в ЦБ с использованием аденовирусного вектора(Ad-LepR^b) против контроля(Ad-Lac)

1. Подвеска Ad-LepR^b и Ad-Lac
   1. Трансфект мышей с аденовирусом(Ad-LepR^b-GFP, 2-5x10¹⁰ pfu/mL для переэкспрессии, Ad-Lacz, 1 х¹⁰ pfu/mL для контроля) в область ЦБ.
   2. Оттепель матрицы Matrigel путем погружения флакона во льду в холодильнике 4 кВ на ночь.
   3. Аккуратно приостановить аденовирус в жидкой матрице Matrigel на 1:5 (1 л матрицы Matrigel и 4 Зл аденовируса применяется на двусторонней основе).
   4. Всегда держите вирусную подвеску на льду до тех пор, пока она не будет применена в ЦБ.
2. Хирургическая подготовка
   1. Используйте те же хирургические инструменты, что и протокол CSND.
   2. Анестезия LepR^b-дефицитный db/db мышей с 2-2,5% изофруран с помощью носового конуса и поместите животных на теплое одеяло, чтобы предотвратить переохлаждение. Изофлуран тщательно титрдляют для поддержания частоты дыхания на уровне 1 Гц (60 вдохов/мин). Адекватность анестезии будет оцениваться по частоте дыхания, отсутствию движений и звуковых шумов, отсутствию реакции на тактильные раздражители и рефлектору снятия педаль передних конечностей или задних конечностей.
   3. Администрировать бупренорфин (0,05 мг/кг) интраперитоне.
   4. Удалите волосы в брюшной области шеи и дезинфицировать области с бетадином и алкоголем, как в протоколе CSND.
   5. Для предотвращения высыхания роговицы, смазать глаза мышей стерильной офтальмологический мазь во время анестезии.
3. Аденовирусное лечение ЦБ
   1. Разоблачить ЦБ, как описано в протоколе CSND, и применить 5 ЗЛ вирусной приостановки в области ЦБ на двусторонней основе.
   2. Подождите 2-3 мин, пока жидкая матрица Matrigel не станет гелем. Подтвердив, что вирусная подвеска была застыла, закройте разрез 6,0 шелковым швом.
4. После операции
   1. Дом мышей в камере восстановления и контролировать их поведение каждые 15 минут в течение первоначального 1 ч, пока мыши не прийти в сознание, чтобы сохранить суровый recumbency. Верните мышей в их домашние клетки после того, как они полностью выздоровеют. Продолжайте следить за мышами два раза в день в течение следующих 3 дней. Дайте дополнительный бупренорфин, если мыши проявляют какие-либо признаки боли (например, снижение аппетита, беспокойство).
   2. Администрирование бупренорфин (0,05 мг/кг) интраперитонево по мере необходимости для предотвращения болезненного дискомфорта в послеоперационный период.
   3. Измерение HVR через 9 дней после трансфекции аденовируса.

Результаты

Непрерывный настой лептина значительно увеличил HVR у худых мышей C57BL/6J с 0,23 до 0,31 мл/мин/г/г/зФиО₂ (P lt; 0.001, Рисунок 2)¹¹. CSND отменила лептин-индуцированное увеличение HVR(Рисунок 2), в то время как никаких ослаблений эффекты CSND на HVR наблюдались...

Обсуждение

Основное внимание в нашем исследовании было уделено изучению респираторных эффектов сигналиции лептина в ЦБ. Для оценки роли лептина в механистической манере было разработано несколько протоколов. Во-первых, конкретный вклад ЦБ в HVR был проанализирован путем тщательной количественно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringes	BD Biosciences	309311
1x PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023	500 ml
Ad-Lacz	Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)		1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP	Vector Biolabs	ADV-263380	2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart	Atlantic Biomedical
Betadine	Purdue Products Ltd.	12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	0.3 mg/mL
C57Bl/6J	Jackson laboratory	000664	Mice Strain
Cotton Gauze Sponges	Fisherbrand	22-362-178
db/db	Jackson laboratory	000697	Mice Strain
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Isoflurane	Vetone	502017
Lab Chart	Data Science International (DSI)		Software
Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
Micro Spring Scissors	World Precision Instruments (WPI)	14124
Mouse Ox Plus	STARR Life Sciences Corp.		Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor	STARR Life Sciences Corp.	015022-2	Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber	Data Science International (DSI)	PLY3211
Ohio Care Plus Incubator	Ohmeda	HCHD000173
Operating Scissors	World Precision Instruments (WPI)	501753-G	Straight
Osmotic Pump	Alzet	1003D	1 μL/h, 3 days
Phenol	Sigma-Aldrich	P4557
Recombinant Mouse Leptin protein	R&D systems	498-OB-05M	5 mg
Saline	RICCA Chemical	7210-16	0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture	DemeTech	DT-639-1	Silk, size 6-0
Thermometer	Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)	EW 20250-91