生物信息学方法与实验验证的集成，了解诺奇信号在卵巢癌中的作用

摘要

生物信息学是处理大规模数据集的有用方法。通过实施生物信息学方法，研究人员可以快速、可靠、高效地获得有见地的应用和科学发现。本文介绍了生物信息学在卵巢癌研究中的运用。它还通过实验成功验证了生物信息学的发现。

摘要

槽口信令是一种高度保守的调节途径，涉及许多细胞过程。这种信号通路调节不良通常会导致对适当发育的干扰，甚至在某些情况下可能导致癌症的启动或进展。由于该通路具有复杂和通用的功能，因此可以通过许多不同的方法进行广泛的研究。其中，生物信息学提供了一种无可否认的成本效益、平易近人和用户友好的研究方法。生物信息学是从大规模数据集中提取较小信息片段的有用方法。通过实施各种生物信息学方法，研究人员可以快速、可靠、高效地解释这些大型数据集，从而产生有见地的应用和科学发现。在这里，提出了一个协议，用于整合生物信息学方法，以研究Notch信号在卵巢癌中的作用。此外，生物信息学的发现通过实验验证。

引言

Notch 信号通路是高度保守的途径，对生物体内的许多发育过程非常重要。Notch信号在细胞增殖和自我更新中起着重要作用，Notch信号通路的缺陷可导致多种癌症^{1、2、3、4、5、6。}在某些情况下，Notch信号通路与组织生长和癌症以及细胞死亡和肿瘤抑制⁷相关联。多个 Notch 受体 （NOTCH 1⁄4） 和 co_u2012 活化剂主谋 （MAML 1⁄3）， 所有功能各不相同，增加了额外的复杂性级别。虽然Notch信号通路在功能方面是复杂的，但其核心通路在^{分子基础8}上是简单的。Notch受体充当由细胞外和细胞内区域组成的跨膜蛋白^9。与Notch受体细胞外区域结合的配体促进蛋白溶性裂解，使Notch细胞内域（NICD）被释放到细胞核中。然后，NICD 绑定到 co_u2012 活化剂主谋以激活下游基因表达¹⁰。

近年来，Notch信号显示，在不同物种^6、11的几种癌症的起始和进展中，Notch信号扮演着各种角色。例如，Notch信号与涉及人类NOTCH1基因¹²的肿瘤发生有关。最近，NOTCH2、NOTCH3、类似三角洲的3（DLL3）、Mastermind_u2012样蛋白1（MAML1）以及含有蛋白17（ADAM17）的脱粒蛋白和金属蛋白酶域被证明与卵巢癌有强烈关联，特别是与^患者13的整体存活率较差有关。

随着实验和患者相关数据量的不断增加，对可用数据的分析需求也不断增加。现有数据分散在出版物中，它们可能提供不一致甚至相互矛盾的结论。随着近几十年来新技术（如下一代测序）的发展，可用数据量呈指数级增长。虽然这代表了科学的快速发展和继续生物学研究的机会，但评估公开数据对解决研究问题的意义是一个巨大的挑战^。我们相信生物信息学是从大规模数据集中提取较小信息片段的有用方法。通过实施各种生物信息学方法，研究人员可以快速、可靠、高效地解释这些大型数据集，从而获得有见地的发现。这些发现可能从确定潜在的新药物治疗靶点或疾病生物标志物，到个性化患者治疗^15、16。

生物信息学本身正在迅速发展，随着技术进步席卷医学和生物科学，方法也在不断变化。目前，常见的生物信息学方法包括利用可公开访问的数据库和软件程序来分析DNA或蛋白质序列，识别具有特殊相关性或重要性的基因，并通过功能基因组学确定基因和基因产物的相关性^。虽然生物信息学领域当然不限于这些方法，但这些对于帮助临床医生和研究人员管理生物数据以造福于整个患者具有重要意义。

本研究旨在突出几个重要的数据库及其用于研究Notch信号通路。NOTCH2，NOTCH3，及其co_u2012活化剂MAML1被用作数据库研究的例子。这些基因的使用，因为Notch信号通路在卵巢癌的重要性已经得到证实。对检索到的数据的系统分析证实了Notch信号在卵巢癌中的重要性。此外，由于Notch信号在物种间保存良好，因此证实果蝇黑色素素和主脑的过度表达可以诱发果蝇卵巢中的肿瘤，支持数据库发现和Notch信号在卵巢癌中的重要和保守作用。

研究方案

1. 基因组谱的临床结果预测

注:PRECOG门户（precog.stanford.edu）访问来自165个癌症表达数据集的公开数据，包括基因表达水平和患者临床结果¹⁷。它特别提供 Meta_u2012Z 分析，该分析包含大型数据集，在 39 种癌症类型中提供不同基因的 Z_u2012 分数，以指示患者的总体存活率。差和好存活率分别由正数和负 Z_u2012 分数值表示。

1. 使用学术附属电子邮件创建帐户以访问此数据库。输入与帐户关联的电子邮件地址和密码。
2. 单击Meta-Z 分析标题下方的"查看详细信息"按钮。
3. 将感兴趣的基因输入搜索栏。
4. 使用位于屏幕底部的滚动条获取特定癌症类型的兴趣生存 Z 得分。

2. CSIOVDB

注:数据库（csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html）是由新加坡癌症科学研究所开发的微阵列数据库，用于研究卵巢癌^。该数据库包含来自不同肿瘤部位的癌变数据以及正常的卵巢组织数据。此外，CSIOVDB提供Kaplan_u2012Meier生存图，用不同的基因表达水平评估患者存活率。CSIOVDB可用于研究基因表达水平与卵巢癌阶段/等级之间的关联。

1. 输入感兴趣的基因，然后单击"搜索"按钮。
2. 单击"疾病状态"选项卡。
   注:此选项卡提供卵巢癌疾病状态中感兴趣的目标基因的基因表达的汇总统计数据。
3. 单击"信息学"选项卡。
   注:此选项卡提供主要卵巢癌组织学中感兴趣的目标基因的基因表达的汇总统计数据。
4. 单击"临床病理参数"选项卡。
   注:此选项卡提供不同卵巢癌阶段、等级和临床反应与Mann-Whitney测试的基因表达水平的比较。
5. 单击"生存"选项卡。
   注:此选项卡布提供卡普兰-迈尔与整体生存和无疾病生存相关的绘图。对于这个数据库，无疾病生存被认为是进展和无复发生存^18。在此选项卡下，也发现了"总体生存和无疾病生存"的多变量分析。多变量分析比较与卵巢癌预后（阶段、等级、手术脱压、组织学、年龄）和感兴趣的基因相关的特征。
6. 单击"子类型"选项卡。
   注:此选项卡提供卵巢癌分子亚型中感兴趣的基因表达水平的汇总统计数据和 Mann-Whitney 测试。此选项卡普兰-迈尔图与卵巢癌分子亚型感兴趣的基因的整体生存和无疾病生存相关。

3. 正常组织和肿瘤组织的基因表达（GENT）

注:GENT门户（医学\u2012基因组.kribb.kr/GENT）由韩国生物科学与生物技术研究所（KRIBB）开发和维护^19。它收集了 16，400 个（U133A;241 个数据集）和 24，300 个（U133plus2;306 个数据集）公开可用的样本。标准化后，GENT提供不同组织的基因表达数据，进一步分为肿瘤和正常组织。

1. 单击屏幕顶部的"搜索"选项卡。
2. 在标记为 1 的部分中。关键字，从下拉菜单中选择术语的基因符号，在关键字部分的空白区域输入感兴趣的基因的基因符号，然后选择"类型"选项的组织。
3. 单击 1 底部的"搜索"按钮。关键字部分。根据U133A和U122Plus2平台，显示不同癌症类型正常和肿瘤组织中基因表达的汇总图。
   注: 选择摘要图顶部的数据筛选选项以挑出要研究的特定数据库是可选的。
4. 单击"结果数据下载"旁边的链接，访问有关基因表达值、组织类型和数据源的详细信息。

4. 广泛研究所癌细胞系百科全书

注:CCLE（portals.broadinstitute.org/ccle）由博德研究所创建，提供947个人类癌细胞系的基因组谱和突变^20。

1. 将所需基因输入搜索栏，然后单击"搜索"按钮。
2. 在标记为"选择数据集"的部分中，单击下拉菜单中的mRNA 表达式 （RNAseq）选项。
   注:其他选项包括mRNA表达（Affy），阿喀琉斯shRNA击倒，和复制号码。
3. 单击"切换所有跟踪"按钮。从右侧的灰色框中选择感兴趣的组织类型。向下滚动到屏幕底部，然后单击"下载 mRNA"表达式按钮。
4. 打开下载的文本文档。将所有文本复制并粘贴到工作表 1中。复制工作表 1中的所有文本。
5. 单击电子表格软件工作表 2 选项卡中电子表格底部的工作表。右键单击"A"列，选择"粘贴特殊"，然后在工作表 2 中选择"转置"选项。
6. 将文本转换为表 2上的两列后，单击"排序和筛选"选项标题的下拉箭头，然后选择"筛选"选项。标记为Gene的标题区域中将显示一个箭头。单击箭头并键入感兴趣的组织类型。
   注: 此步骤将筛选所有数据，仅显示感兴趣的组织类型的基因表达水平。

5. cBioPortal

注:cBioPortal（www.cioportal.org）是在纪念斯隆凯特林癌症中心（MSK）开发的，访问、分析和可视化大规模癌症基因组数据^21，22。具体来说，这个门户允许研究人员搜索基因改变和信令网络。

1. 使用登录页上的查询，单击标记为"选择研究"的"部分"下感兴趣的器官/组织。选择感兴趣的特定研究，然后点击"按基因查询"按钮。
2. 在标记为"选择基因组配置文件"的部分中，从三个选项中进行选择:突变、来自 GISTIC 的假定复制数更改或mRNA 表达式。进一步选择相应的数据从下拉菜单选择患者/病例集。
3. 在"输入基因"的查询框中输入目标基因符号。单击"提交查询"按钮。
4. 单击页面顶部的"网络"选项卡以检索所需的基因网络。
   注: 信令网络是彩色编码的。输入的基因由具有厚边框的种子节点指示。每个基因由一个红色圆圈表示，红色圆的颜色强度反映其突变频率。基因由不同颜色的线条连接。棕色线条表示"在同一成分中"，表示参与同一生物成分。蓝线表示"反应"，表示基因反应。绿线表示"状态变化"，表明一个基因可能导致另一个基因的状态变化。
5. 单击图像顶部的"文件"选项卡以选择"保存为图像 （PNG）"以进行网络映像下载。

6. 用所需的基因型和DAPI染色切除果蝇

注:收集具有所需基因型的雌性果蝇，然后解剖苍蝇卵巢，进行DAPI染色成像程序。

1. 准备飞行股票tj-Gal4，Gal80ts/CyO;UAS-NICD-GFP/TM6B， w_;UAS-mam.A;w[1118]使用NICD过度表达（tj-Gal4，Gal80ts/+）创建苍蝇;UAS-NICD-GFP/+）和NICD和mam-over-表达（tj-Gal4，Gal80ts/UAS-mam.A;UAS-NICD-GFP/+功能。
2. 应用时空基因表达靶向（TARGET）技术控制时空基因表达^23。在18°C下提高苍蝇直到成年，然后在解剖前用酵母转移到29°C48小时。
   注:tj-Gal4只能在较高温度下驱动UAS表达，当Gal80ts的抑制得到缓解时。解剖前加入酵母可扩大卵巢的收获。
3. 将 3 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na₂HPO₄， 1.8 mM KH₂PO₄） 放入胚胎收集盘中。使用 CO₂垫对苍蝇进行麻醉。
4. 选择雌性苍蝇，然后用一对解剖钳小心地抓住苍蝇的下胸，并将其浸入胚胎收集盘中的1x PBS溶液中。使用第二对钳子捏下腹部，轻轻拉释放内脏。
5. 识别一对卵巢，并从苍蝇体内分离。打破位于卵巢后端的肌肉护套，并分离卵巢。
   注:为了达到更高质量的染色效果，需要分离卵子并打破肌肉护套。
6. 将卵巢放入含有 500 μL 1x PBS 的 1.5 mL 离心管中。管应留在冰上，直到收集所有卵巢。
7. 取出 1x PBS，将 0.5 mL 的固定溶液（4% 甲醛）放入管中。将管子放在螺母上 10 分钟。
8. 从管子中取出固定溶液，并将其处理在合适的废物容器中。使用 1 mL 的 1x PBT （1x PBS 补充 0.4% Triton™ X-100） 洗卵巢 3x 15 分钟。
9. 丢弃最终的PBT洗涤，加入1 mL的PBTG（0.2%牛血清白蛋白，5%正常山羊血清在1xPBT），以防止非特异性结合。
   注: 对于 DAPI 染色，可以跳过此步骤，但对于抗体染色至关重要。详细的免疫性化学染色可以在贾等人^24。
10. 将 150 μL 的 DAPI （10 μg/mL） 放入管中，进行 10~15 分钟的螺母。丢弃 DAPI 并使用 1 mL 的 1x PBT 清洗卵巢 10 分钟。使用 1x PBS 取出 PBT 并洗涤 2 次 10 分钟。
11. 去除多余的PBS，直到大约300 μL的PBS留在管与卵巢。使用200μL移液器将卵巢上下移，以释放卵子室。
12. 轻轻旋转管，并小心地删除尽可能多的1x PBS溶液，而无需去除卵巢。将 120 μL 的安装溶液（1 g n-丙基甘酸、5 ml 10X PBS、40 ml 甘油和 5 ml dH₂O）放入管中。
    注:安装溶液是粘性的，因此很难将120μL的安装溶液完全转移到管中。为了缓解此问题，可以使用 1，000 μL 移液器尖端将三滴安装溶液添加到管中。
13. 从 200 μL 移液器尖端上拆下约 0.33 mm，并使用新切割的移液器尖端将安装解决方案放在显微镜玻璃玻片上。
14. 轻轻地将盖玻片玻璃放在安装溶液上，用透明指甲油密封盖玻片的边缘。
    注:拍摄共聚焦图像时，需要密封盖玻璃的边缘，以防止蛋室在安装溶液中流动。
15. 使用以下设置使用共聚焦显微镜获取图像:物镜 = 10 倍放大倍率;数值孔径 = 0.8;DAPI 发射波长 = 410×513 nm。

结果

使用 PRECOG 门户的步骤 1 中提及的程序，在卵巢癌中获得了NOTCH2、NOTCH3和MAML1的 Z 得分（分别为 1.3、2.32、1.62）。 负Z\u2012分值表明三个基因表达水平高的患者总体存活率较差。使用电子表格软件的条件格式，Z\u2012score 值如图1中的彩色条形图所示。

CSIOVDB数据库被用来确认这些发现。使用步骤2、NOTCH2、NOTCH3和MAML...

讨论

由于利用生物信息学的方法和方法不计其数，因此有许多数据库可在线供公众使用。可以从每个数据库中提取大量信息，但有些数据库最适合特定目的，例如根据某些输入评估患者存活率。对从不同数据库检索到的数据进行系统分析，可以令人信服地产生重要的科学发现。

目前的分析侧重于Notch信号在卵巢癌中的作用，通过生物信息学方法的利用。例如，PRECOG门户数据库上的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens