אינטגרציה של גישות ביואינפורמטיקה ואימותים ניסיוניים כדי להבין את תפקיד האיתות החריץ בסרטן השחלות

Summary

ביואינפורמטיקה היא דרך שימושית לעיבוד ערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של ביואינפורמטיקה גישות, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות להשיג בקשות תובנה ותגליות מדעיות. מאמר זה ממחיש את הניצול של ביואינפורמטיקה במחקר סרטן השחלות. הוא גם מאמת בהצלחה ממצאים בביואינפורמטיקה באמצעות ניסויים.

Abstract

איתות מדרגה הוא מסלול רגולציה שהוא שימור מאוד המעורב בתהליכים סלולאריים רבים. דיסרגולציה של מסלול זה איתות לעתים קרובות מוביל הפרעות עם התפתחות נאותה ואולי גם לגרום לחניכה או התקדמות של סרטן במקרים מסוימים. בגלל מסלול זה משרת פונקציות מורכבות תכליתי, זה יכול להיות למד באופן נרחב באמצעות גישות שונות רבות. מתוך אלה, ביואינפורמטיקה מספק שיטת לימוד חסכונית בעלות חסכונית, נגישה וידידותית למשתמש. ביואינפורמטיקה היא דרך שימושית לחלץ פיסות מידע קטנות יותר מערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של גישות שונות בביואינפורמטיקה, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות לפרש אלה מערכות נתונים גדולות, מניב יישומים תובנה ותגליות מדעיות. כאן, פרוטוקול מוצג לאינטגרציה של ביואינפורמטיקה גישות לחקור את התפקיד של איתות חריץ בסרטן השחלות. יתרה מזאת, ממצאי ביואינפורמטיקה מאומתים באמצעות ניסויים.

Introduction

מסלול איתות חריץ הוא מסלול שמרו במיוחד כי חשוב עבור תהליכים התפתחותיים רבים בתוך אורגניזמים ביולוגיים. איתות חריץ הוכח לשחק תפקיד משמעותי התפשטות התא והתחדשות עצמית, פגמים במסלול איתות חריץ יכול להוביל לסוגים רבים של סרטן^1,2,3,4,5,6. בנסיבות מסוימות, מסלול איתות חריץ נקשר הן גידול רקמות סרטן, כמו גם מוות תאים ודיכוי הגידול⁷. קולטנים מרובים (חריץ 1-4) ו co\u2012activator המוח (MAML 1-3), כולם עם פונקציות מגוונות, להוסיף רמה נוספת של מורכבות. בעוד מסלול איתות חריץ מתוחכם מבחינת פונקציות, מסלול הליבה שלה הוא פשוט על בסיס מולקולרי⁸. קולטנים חריץ לפעול כמו חלבונים חלבון טראנסממברנלי המורכב של מסחטות אזורים תאיים⁹. ליגאל באזור החילוץ של קולטני חריץ מקלה על מחשוף הנוגד חרדה, אשר מאפשר את התחום הבין-תאיים (NICD) להשתחרר לתוך הגרעין. NICD לאחר מכן נקשר co\u2012activator המוח כדי להפעיל ביטוי גנים במטה¹⁰.

בשנים האחרונות, איתות חריץ הוכח לשחק במגוון תפקידים בייזום והתקדמות של מספר סוגים של סרטן על פני זנים שונים^6,11. לדוגמה, איתות מדרגה מקושר לטומגנזה המעורב בNOTCH1 הגן האנושי¹². לאחרונה, the NOTCH2, NOTCH3, דלתא-כמו 3 (DLL3), מאסטר מראה כגון חלבון 1 (MAML1), ו מתפורר ומטאלויואז מטאומאו2012 המכילים חלבון 17 (ADAM17) גנים הוכחו להיות משויכים באופן מאוד לסרטן השחלות, במיוחד עם ההישרדות הכוללת המסכן של חולים¹³.

ככל שכמות הנתונים הניסיוניים והמטופלים מגדילה ברציפות, הביקוש לניתוח של הנתונים הזמינים גדל גם כן. הנתונים הזמינים מפוזרים על-פני פרסומים, והם עשויים לספק ממצאים לא עקביים או אפילו סותרים. עם התפתחות הטכנולוגיה החדשה בעשורים האחרונים, כגון רצפי הדור הבא, כמות הנתונים הזמינים גדל אקספוננציאלית. למרות שהדבר מייצג התקדמות מהירה במדע והזדמנויות למחקר ביולוגי מתמשך, הערכת המשמעות של נתונים זמינים לציבור לפתרון שאלות מחקר היא אתגר גדול¹⁴. אנו מאמינים שביואינפורמטיקה הוא דרך שימושית לחלץ פיסות מידע קטנות יותר מערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של גישות שונות בביואינפורמטיקה, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות לפרש אלה מערכות נתונים גדולות, מניב גילויים תובנה. גילויים אלה עשויים לנוע מתוך זיהוי של מטרות הטיפול הפוטנציאלי תרופה חדשה או ביוארקרס מחלות, לטיפולים אישיים המטופל^15,16.

ביואינפורמטיקה עצמה מתפתחת במהירות, והגישות משתנות באופן תמידי כהתקדמות טכנולוגית מנקה את המדע הרפואי והביולוגי. כיום, גישות נפוצות של ביואינפורמטיקה כוללות ניצול של מסדי נתונים ותוכנות נגישים לציבור לניתוח DNA או רצפי חלבונים, לזהות גנים של רלוונטיות מסוימת או חשיבות, ולקבוע את הרלוונטיות של גנים ומוצרים גנטיים דרך גנומיקה תפקודית¹⁶. למרות שהשדה של הביואינפורמטיקה הוא בהחלט לא מוגבל גישות אלה, אלה הם משמעותיים לסייע לרופאים וחוקרים לנהל נתונים ביולוגיים לטובת החולים כולה.

מחקר זה נועד להדגיש מספר מסדי נתונים חשובים השימוש שלהם למחקר על מסלול איתות חריץ. NOTCH2, NOTCH3, וMAML1 co\u2012activator שלהם שימשו כדוגמאות למחקר במסד הנתונים. גנים אלה שימשו כי החשיבות של מסלול איתות חריץ בסרטן השחלות כבר אומת. ניתוחים שיטתית של נתונים מאוחזרים אישר את החשיבות של איתות חריץ בסרטן השחלות. בנוסף, כיוון איתות חריץ הוא שימור היטב על פני מינים, זה אושר כי הביטוי oversopהילה melanogaster Nicd ו המוח יחד יכול לגרום לגידולים בשחלות drosophila ילה , תמיכה בממצאים מסד הנתונים ואת התפקיד משמעותי ושמרו של איתות חריץ בסרטן השחלות.

Protocol

1. חיזוי של תוצאות קליניות מפרופילים גנומית (PRECOG)

הערה: הפורטל הקדם (precog.stanford.edu) ניגש לנתונים זמינים לציבור מתוך 165 ביטוי סרטן מערכות נתונים, כולל רמות ביטוי גנטי ותוצאות קליניות החולה¹⁷. זה מספק במיוחד את מmeta\u2012z ניתוח, אשר משלבת מערכות נתונים גדולים כדי לספק הציונים של Z\u2012scores גנים שונים ב 39 סוגי סרטן לציון ההישרדות הכללית החולה. שיעורי ההישרדות העניים והטובים מצוינים על-ידי ערכי ניקוד חיוביים ושליליים של Z\u2012score בהתאמה.

1. צור חשבון בעל מייל המזוהה עם השכלה אקדמית כדי לגשת למסד נתונים זה. הזן את כתובת הדוא ל והסיסמה המשויכים לחשבון.
2. לחץ על הלחצן ' הצג פרטים ' הממוקם מתחת לכותרת הניתוח Meta-Z .
3. הקלט את גן העניין בסרגל החיפוש .
4. השתמש בפס הגלילה הממוקם בחלק התחתון של המסך כדי לקבל את Z-ציון ההישרדות עבור סוג הסרטן הספציפי של עניין.

2. CSIOVDB

הערה: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) הוא מסד נתונים microarray שפותחה על ידי המכון למדעי הסרטן של סינגפור ללמוד סרטן השחלות¹⁸. מסד נתונים זה מכיל נתונים של קרצינומות מאתרי גידולים שונים, כמו גם שחלות נורמלי נתונים רקמת השחלה. בנוסף, CSIOVDB מספק את מגרשי ההישרדות של Kaplan\u2012Meier אייר כדי להעריך הישרדות החולה עם רמות ביטוי גנים דיפרנציאלי. CSIOVDB ניתן להחיל כדי לחקור את הקשר בין רמות ביטוי גנים וסרטן השחלות שלבים/ציונים.

1. הגן הקלט של עניין, ולאחר מכן לחץ על לחצן חיפוש .
2. לחצו על הכרטיסייה ' מצב מחלה '.
   הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום של ביטוי גנים של הגן היעד של העניין במצבי סרטן השחלות מחלות.
3. לחץ על הכרטיסייה היסטולוגיה .
   הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום של ביטוי גנים של הגן היעד של עניין היסטוגיות סרטן השחלות הגדולות.
4. לחץ על הכרטיסייה של הפרמטרים הפתולוגיים הקליפיקו .
   הערה: כרטיסיה זו מספקת השוואה בין רמות ביטוי הגן בין שלבים שונים של סרטן השחלות, ציונים, ותגובות קליניות עם בדיקות מאן-ויטני.
5. לחץ על הכרטיסייה הישרדות .
   הערה: כרטיסיה זו מספקת מגרשים של קפלן-מאייר הקשורים להישרדות והישרדות כוללת ללא מחלות. עבור מסד הנתונים הזה, הישרדות ללא מחלות נחשב מהלך-והישרדות ללא מופע חוזר¹⁸. ניתוחים multivariate עבור הישרדות כולל הישרדות ללא מחלות מצויים גם תחת כרטיסיה זו. הניתוחים סטטיסטי להשוות תכונות המתייחסות התחזיות סרטן השחלות (שלב, כיתה, כירורגי debulking, היסטולוגיה, גיל) ואת הגן של עניין.
6. לחצו על הכרטיסייה ' תת-סוג '.
   הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום ובדיקות מאן-ויטני לרמת הביטוי של גן העניין בתתי-סוגי מולקולרית של סרטן השחלות. כרטיסיה זו מספקת גם מגרשים של קפלן-מאייר הקשורים הישרדות כוללת ונטולת מחלות של הגן של עניין תת מולקולרי של סרטן השחלות.

3. ביטוי גנים על פני רקמה נורמלית וסרטניים (GENT)

הערה: הפורטל החדש (רפואי \ u2012genome. kribb. re. kr/גנט) מפותח ומתוחזק על ידי מכון המחקר של מדעי הביולוגיה בביוכימיה וביוטכנולוגיה (KRIBB)¹⁹. היא אוספת 16,400 (U133A; 241 datasets) ו 24,300 (U133plus2; 306 datasets) מדגמים זמינים לציבור. לאחר הסטנדרטיזציה, GENT מציע נתונים ביטוי גנים על פני רקמות מגוונות, אשר מחולקים עוד לתוך הגידול ורקמות נורמלי.

1. לחצו על הכרטיסייה ' חיפוש ' בחלק העליון של המסך.
2. במקטע המסומן 1. מילת מפתח, בחר את סמל הגן עבור התנאים מהתפריט הנפתח, הקלט את סמל הגן של הגן של עניין באזור הריק של מקטע מילות המפתח , ובחר רקמות עבור אפשרות סוג .
3. לחץ על לחצן החיפוש בתחתית ה -1. סעיף מילות מפתח . הוא מציג את גרפים הסיכום של ביטוי גנטי ברקמות נורמלי וגידולים של סוגי סרטן שונים מבוסס על U133A ו U122Plus2 פלטפורמות.
   הערה: היא אופציונלית כדי לבחור את האפשרות סינון נתונים בחלק העליון של גרף הסיכום כדי לבודד מסד נתונים מסוים כדי ללמוד.
4. לחץ על הקישור לצד הורדת נתונים תוצאה כדי לגשת למידע המפורט אודות ערכי ביטוי הגנים, סוגי הרקמות ומקורות הנתונים.

4. האנציקלופדיה הרחבה של סרטן המכון (CCLE)

הערה: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) נוצר על ידי המכון הרחב ומספק פרופילים גנומית ומוטציות של 947 האדם תאים הסרטן האנושי²⁰.

1. הקלט את הגנים הרצויים לתוך סרגל החיפוש ולאחר מכן לחץ על לחצן החיפוש .
2. במקטע שכותרתו בחירת ערכת נתונים, לחץ על האפשרות ביטוי Mrna (rnaseq) מהתפריט הנפתח.
   הערה: אפשרויות אחרות כוללות את הביטוי mrna (Affy), שרין אכילס הסתרה והעתק מספר.
3. לחץ על לחצן החלף את כל העקבות . בחר את סוג הרקמה המעניינים מהתיבה האפורה שבצד ימין. גלול מטה לתחתית המסך ולחץ על לחצן ביטוי mRNA הורד .
4. פתח את מסמך הטקסט שהורדת. העתק והדבק את כל הטקסט לגיליון 1. העתק את כל הטקסט שבגיליון 1.
5. לחץ על הגיליון בכרטיסיה גיליון הגיליון האלקטרוני גליון 2 בחלק התחתון של הגיליון האלקטרוני. לחץ לחיצה ימנית על העמודה A , בחר הדבקה מיוחדתולאחר מכן בחר באפשרות ' בצע חילוף ' בגיליון 2.
6. לאחר החלפת הטקסט בשתי עמודות בגיליון 2, לחץ על החץ הנפתח כדי למיין את כותרת האפשרות & סינון ולאחר מכן בחר באפשרות המסנן . חץ יופיע באזור הכותרת הנקרא גן. לחץ על החץ ולהקליד את סוג הרקמה של עניין.
   הערה: שלב זה יסנן את כל הנתונים ויציג רק את רמות ביטוי הגנים של סוג הנייר המעניין.

5. ביוביוטל

הערה: ביוביוטל (www.cioportal.org) פותחה במרכז הסרטן בבית החולים הגדול (msk), וכניסה, מנתחת, ומדמיין נתונים גנומית של סרטן בקנה מידה רחב^21,22. באופן ספציפי, הפורטל הזה מאפשר לחוקרים לחפש שינויים גנטיים ורשתות איתות.

1. באמצעות השאילתה בדף הנחיתה, לחץ על האברים/רקמות העניין תחת המקטע המסומן בחירת מחקרים. בחר את מחקר מסוים של עניין, ואז להכות את השאילתה על ידי כפתור הגן.
2. במקטע שכותרתו בחירת פרופילים גנומית, בחר מתוך שלוש האפשרויות: מוטציות, העתקה מספר שינויים במספר Gisticאו mrna ביטוי. בחרו עוד נתונים מתאימים מהתפריט הנפתח לבחירת ערכת מטופלים/אירועים.
3. הזן את סמלי הגן היעד בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על לחצן שלח שאילתה .
4. לחץ על הכרטיסייה רשת בחלק העליון של הדף כדי לאחזר את רשת הגנים הרצויה.
   הערה: רשת האיתות מסומנת בצבע. הגנים הנכנסים מצוינים באמצעות צמתי seed עם גבול עבה. כל גן מיוצג על-ידי עיגול אדום, ועוצמת הצבע של העיגול האדום משקפת את תדר המוטציה שלו. גנים מחוברים על ידי קווים צבעוניים שונים. משמעות הקווים החומים "באותו מרכיב", המציינת את המעורבות באותו מרכיב ביולוגי. , הקווים הכחולים מתכוונים "מגיבים". מציינים תגובות גנים הקווים הירוקים מתכוונים "שינוי המדינה", ומציע כי גן אחד עלול לגרום לשינוי מדינה של גן אחר.
5. לחצו על הכרטיסייה ' קובץ ' בחלק העליון של התמונה כדי לבחור ' שמור כתמונה (PNG) ' להורדת תמונת רשת.

6. חיתוך דרוסופילה בעזרת גנוטיפים הרצויים וצביעת dapi

הערה: לאסוף את הנקבה הפילה עם גנוטיפים הרצוי, ולאחר מכן לנתח את השחלות לטוס לעבור את ההליכים של dapi הצביעת עבור הדמיה.

1. הכינו לטוס מניות tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; א-אמא. א; ו- w [1118] כדי ליצור זבובים עם nicd-ביטוי יתר (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) ו nicd ואת אמא-אוברהביטוי (TJ-Gal4, Gal80ts/uas-אמא. A; יכולות UAS-NICD-GFP/+).
2. החל את ביטוי הגנים הזמני והאזורי המכוון (TARGET) כדי לשלוט בביטוי הגן הזמני של המונח²³. להעלות זבובים ב 18 ° צ' עד הבגרות, ואז לעבור 29 ° צ' עבור 48 h עם שמרים לפני חיתוך.
   הערה: tj-Gal4 יכול לנהוג ביטוי uas רק בטמפרטורות גבוהות יותר, כאשר העיכוב על ידי Gal80ts הוא הקלה. תוספת של שמרים לפני הניתוח מגדיל את השחלות לקציר.
3. מקום 3 מ ל של 1 x פוספט באגירה מלוחים (PBS) (137 מ"מ, 2.7 mM KCl, 10 מ"מ Na₂hpo₄, 1.8 mm KH₂הפו₄) בתוך צלחת אוסף העובר. השתמש בלוח CO₂ כדי להחטיף את הזבובים.
4. בחר זבוב נקבה, ולאחר מכן בזהירות לתפוס את בית החזה התחתון של לעוף באמצעות זוג של מלקחיים מבתר ולהטביע אותו לתוך פתרון ה-PBS 1x בצלחת אוסף העובר. השתמש זוג שני של מלקחיים כדי לצבוט את הבטן התחתונה ולמשוך בעדינות כדי לשחרר את האיברים הפנימיים.
5. לזהות ולנתק את זוג השחלות מהגוף לעוף. שבור את נדן השרירים הממוקם בקצה האחורי של השחלות והפרד את האושתנים.
   הערה: הפרדת האושתנים ושבירת מעטפת השרירים נדרשת כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה יותר.
6. מניחים את השחלות בצינור צנטריפוגה 1.5 mL המכיל 500 μL של 1x PBS. הצינור צריך להישאר על הקרח עד כל השחלות נאספים.
7. הסר את ה-PBS 1 x ומקום 0.5 mL של פתרון תיקון (4% פורמלדהיד) לתוך השפופרת. מניחים את הצינור על הנוטור. במשך 10 דקות
8. הסר את פתרון התיקון מהצינור והיפטר ממנה במיכל פסולת מתאים. השתמש 1 mL של 1x PBT (1x PBS בתוספת 0.4% טריטון™ X-100) כדי לשטוף את 3x השחלות עבור 15 דקות.
9. להשליך את הכביסה PBT הסופי ולהוסיף 1 מ ל של PBTG (0.2% בסרום שור, 5% סרום עז רגיל ב-1x PBT) כדי למנוע איגוד ספציפי.
   הערה: ניתן לדלג על שלב זה לצביעת DAPI, אך היא חיונית לצביעת נוגדנים. כתמים אימונוהיסטוכימיה מפורטת ניתן למצוא ג ' יה ואח '²⁴.
10. מקום 150 μL של DAPI (10 μg/mL) בצינור במשך 10 עד 15 דקות הרוטציה. להיפטר DAPI ולשטוף את השחלות 1 x עבור 10 דקות באמצעות 1 mL של 1x PBT. הסר את ה-PBT ושטוף את 2x עבור 10 דקות באמצעות 1x PBS.
11. הסר את העודפים PBS עד כ 300 μL של PBS נשאר בצינור עם השחלות. Pipet השחלות למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות הפיפטה 200 μL, כדי לשחרר את תאי הביצה.
12. בעדינות לסובב את הצינור בזהירות להסיר את הפתרון הגדול 1x PBS ככל האפשר מבלי להסיר את השחלות. מקום 120 μL של פתרון הרכבה (1 גרם n-פרופיל, 5 מ ל של 10X PBS, 40 מ ל של גליצרול ו 5 מ ל של dH₂O) לתוך הצינור.
    הערה: פתרון ההרכבה הוא דביק, כך קשה להעביר בדיוק 120 μL של הרכבה הפתרון לתוך צינור. כדי להקל על בעיה זו, ניתן להשתמש בתשר של 1,000 μL להוספת שלוש טיפות של פתרון הרכבה לתוך השפופרת.
13. להסיר כ 0.33 מ"מ מ-200 μL מתוך הטיפ להשתמש בקצה הפיפטה החדש כדי למקם את פתרון ההרכבה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ.
14. בעדינות למקם את הזכוכית coverslip על הפתרון הרכבה ולאטום את הקצוות של שובר הכיסוי עם לק שקוף שקופה.
    הערה: איטום קצות זכוכית העטיפה נדרש כדי למנוע מתאי הביצית לזרום בתוך הפתרון הגובר בעת נטילת תמונות מיקוד.
15. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות ההגדרות הבאות: העדשה האובייקטיבית = 10x הגדלה; הצמצם מספריים = 0.8; פליטת DAPI באורך גל = 410-513 ננומטר.

תוצאות

באמצעות ההליך שהוזכר בשלב 1 באמצעות הפורטל PRECOG the Z-ציונים של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות הושגו (1.3, 2.32, 1.62, בהתאמה). הערכים השליליים של Z\u2012score מציינים את ההישרדות הכללית המסכנה של חולים עם רמות ביטויים גבוהים של שלושת הגנים. באמצעות עיצוב מותנה של תוכנת הגיליון האלקטרו?...

Discussion

מאחר וקיימות אינספור גישות ושיטות לניצול הביואינפורמטיקה, ישנם מספר מאגרים הזמינים באופן מקוון לציבור הרחב. ניתן להפיק שפע של מידע מכל אחד ממסדי הנתונים הללו, אך חלקם מתאימים במיוחד למטרות מסוימות, כגון הערכת הישרדות מטופלים המבוססת על כניסות מסוימות. ניתוחים שיטתיים של נתונים מאוחזרים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens