Integrazione di approcci bioinformatici e convalide sperimentali per comprendere il ruolo della segnalazione di nota nel cancro ovarico

Riepilogo

La bioinformatica è un modo utile per elaborare set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di approcci bioinformatici, i ricercatori possono ottenere rapidamente, in modo affidabile ed efficiente applicazioni approfondite e scoperte scientifiche. Questo articolo dimostra l'utilizzo della bioinformatica nella ricerca sul cancro ovarico. Convalida anche con successo i risultati della bioinformatica attraverso la sperimentazione.

Abstract

La segnalazione di notch è un percorso normativo altamente conservato coinvolto in molti processi cellulari. La disregolazione di questo percorso di segnalazione spesso porta a interferenze con un corretto sviluppo e può anche provocare l'avvio o la progressione dei tumori in alcuni casi. Poiché questo percorso serve funzioni complesse e versatili, può essere studiato ampiamente attraverso molti approcci diversi. Di questi, la bioinformatica fornisce un metodo di studio innegabilmente efficiente in termini di costi, accessibile e facile da usare. La bioinformatica è un modo utile per estrarre piccole quantità di informazioni da set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di vari approcci bioinformatici, i ricercatori possono interpretare in modo rapido, affidabile ed efficiente questi grandi set di dati, producendo applicazioni approfondite e scoperte scientifiche. Qui viene presentato un protocollo per l'integrazione di approcci bioinformatici per studiare il ruolo della segnalazione notch nel cancro ovarico. Inoltre, i risultati della bioinformatica sono convalidati attraverso la sperimentazione.

Introduzione

Il percorso di segnalazione di Notch è un percorso altamente conservato che è importante per molti processi di sviluppo all'interno di organismi biologici. La segnalazione di notch ha dimostrato di svolgere un ruolo significativo nella proliferazione cellulare e nell'autorinnovamento, e i difetti nel percorso di segnalazione di Notch possono portare a molti tipi di cancro^1,2,3,4^,5,6. In alcune circostanze, la via di segnalazione Notch è stata collegata sia alla crescita dei tessuti e cancro, così come la morte cellulare e la soppressione del tumore⁷. I ricettori multipli di Notch (NOTCH 1-4) e la mente di co-u2012activator (MAML 1-3), tutti con funzioni diverse, aggiungono un ulteriore livello di complessità. Mentre il percorso di segnalazione notch è sofisticato in termini di funzioni, il suo percorso di base è semplice su base molecolare⁸. I recettori Notch agiscono come proteine transmembrane composte da regioni extracellulari e intracellulari⁹. Un legame di ligando con la regione extracellulare dei recettori Notch facilita la scissione proteolitica, che consente al dominio intracellulare di Notch (NICD) di essere rilasciato nel nucleo. Il NICD si lega quindi a co-u2012activator Mastermind per attivare l'espressione genica a valle¹⁰.

Negli ultimi anni, nota segnalazione ha dimostrato di svolgere una varietà di ruoli nell'avvio e progressione di diversi tipi di cancro in diverse specie^6,11. Per esempio, la segnalazione di Notch è stata collegata alla tumorigenesi che coinvolge il gene umano NOTCH1 ¹². Di recente, i geni della proteina 17 (DLL3) simile a un Delta-like, di Mastermind-u2012comee di un dominio disintegre e metalloproteinasi,u2012contenente di proteine 17 (ADAM17) sono stati dimostrati fortemente associati al cancro ovarico, in particolare alla scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti¹³.

Con l'aumentare continua della quantità di dati sperimentali e associati al paziente, aumenta anche la domanda di analisi dei dati disponibili. I dati disponibili sono sparsi tra le pubblicazioni e possono fornire risultati incoerenti o addirittura contraddittori. Con lo sviluppo di nuove tecnologie negli ultimi decenni, come il sequenziamento di nuova generazione, la quantità di dati disponibili è cresciuta in modo esponenziale. Anche se questo rappresenta rapidi progressi nella scienza e opportunità per la continua ricerca biologica, valutare il significato dei dati pubblicamente disponibili per risolvere le questioni di ricerca è una grande sfida¹⁴. Crediamo che la bioinformatica sia un modo utile per estrarre informazioni più piccole da set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di vari approcci bioinformatici, i ricercatori possono interpretare in modo rapido, affidabile ed efficiente questi grandi set di dati, producendo scoperte approfondite. Queste scoperte possono variare dall'identificazione di potenziali nuovi bersagli di terapia farmacologica o biomarcatori della malattia, a trattamenti personalizzati per i pazienti^15,16.

La bioinformatica stessa è in rapida evoluzione e gli approcci sono in continua evoluzione man mano che i progressi tecnologici spazzano la scienza medica e biologica. Attualmente, gli approcci bioinformatici comuni includono l'utilizzo di database e programmi software accessibili al pubblico per analizzare sequenze di DNA o proteine, identificare geni di particolare rilevanza o importanza e determinare la rilevanza dei geni e dei prodotti genici attraverso la genomica funzionale¹⁶. Anche se il campo della bioinformatica non è certamente limitato a questi approcci, questi sono significativi nell'aiutare i medici e i ricercatori a gestire i dati biologici a beneficio dei pazienti nel loro complesso.

Questo studio ha lo scopo di evidenziare diverse importanti banche dati e il loro uso per la ricerca sul percorso di segnalazione di Notch. NOTCH2, NOTCH3, e il loro co-u2012activator MAML1 sono stati utilizzati come esempi per lo studio del database. Questi geni sono stati utilizzati perché l'importanza della via di segnalazione di Notch nel cancro ovarico è stata convalidata. Le analisi sistematiche dei dati recuperati hanno confermato l'importanza della segnalazione di Notch nel cancro ovarico. Inoltre, poiché la segnalazione di Notch è ben conservata tra le specie, è stato confermato che la sovraespressione di Drosophila melanogaster NICD e Mastermind insieme può indurre tumori nelle ovaie della Drosophila, sostenendo i risultati del database e il ruolo significativo e conservato della segnalazione di Notch nel cancro ovarico.

Protocollo

1. Previsione dei risultati clinici dai profili genomici (PRECOG)

NOTA: il portale PRECOG (precog.stanford.edu) accede ai dati disponibili pubblicamente da 165 set di dati sull'espressione del cancro, inclusi i livelli di espressione genica e gli esiti clinici dei pazienti¹⁷. Fornisce in modo specifico l'analisi di Meta-u2012, che incorpora grandi set di dati per fornire i punteggi di diversi geni in 39 tipi di cancro per indicare la sopravvivenza complessiva del paziente. I tassi di sopravvivenza scarsi e buoni sono indicati rispettivamente da valori positivi e negativi del punteggio di z2012.

1. Crea un account con un'email affiliata accademica per accedere a questo database. Immettere l'indirizzo di posta elettronica e la password associati all'account.
2. Fare clic sul pulsante Visualizza dettagli situato sotto l'intestazione di analisi Meta-z.
3. Immettere il gene di interesse nella barra di ricerca.
4. Utilizzare la barra di scorrimento situata nella parte inferiore dello schermo per ottenere il punteggio di sopravvivenza per il tipo di cancro specifico di interesse.

2. CSIOVDB (DBOV)

NOTA: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) è un database di microarray sviluppato dal Cancer Science Institute di Singapore per studiare il cancro ovarico¹⁸. Questo database contiene dati di carcinomi provenienti da diversi siti tumorali e dati normali del tessuto ovarico. Inoltre, CSIOVDB fornisce grafici di sopravvivenza di Kaplan-u2012Meier per valutare la sopravvivenza del paziente con livelli di espressione genica differenziali. CSIOVDB può essere applicato per studiare l'associazione tra i livelli di espressione genica e gli stadi/gradi del cancro ovarico.

1. Immettere il gene di interesse, quindi fare clic sul pulsante Cerca.
2. Fare clic sulla scheda Stato malattia.
   NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive sull'espressione genica del gene bersaglio di interesse per gli stati di malattia da cancro ovarico.
3. Fare clic sulla scheda Istologia.
   NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive sull'espressione genica del gene bersaglio di interesse per le principali istologie del cancro ovarico.
4. Fare clic sulla scheda Parametri Clinico-patologici.
   NOTA: questa scheda fornisce un confronto dei livelli di espressione genica tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche tra diversi stadi, gradi e risposte cliniche con i test Mann-Whitney.
5. Fare clic sulla scheda Sopravvivenza.
   NOTA: questa scheda fornisce i grafici Kaplan-Meier associati alla sopravvivenza complessiva e alla sopravvivenza libera da malattie. Per questo database, la sopravvivenza libera da malattie è considerata sopravvivenza libera da progressione e recidiva¹⁸. In questa scheda si trovano anche analisi multivariate per la sopravvivenza complessiva e la sopravvivenza libera da malattie. Le analisi multivariate confrontano le caratteristiche che riguardano le prognosi del cancro ovarico (stadio, grado, debulking chirurgico, istologia, età) e il gene di interesse.
6. Fare clic sulla scheda Sottotipo.
   NOTA: Questa scheda fornisce statistiche riassuntive e test Mann-Whitney per il livello di espressione del gene di interesse per i sottotipi molecolari del cancro ovarico. Questa scheda fornisce anche trame Kaplan-Meier associate alla sopravvivenza complessiva e alla sopravvivenza libera da malattie del gene di interesse per i sottotipi molecolari del cancro ovarico.

3. Espressione genica sul tessuto normale e tumorale (GENT)

NOTA: Il portale GENT (medicale-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) è sviluppato e mantenuto dal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)¹⁹. Raccoglie 16.400 (U133A; 241 set di dati) e 24.300 (U133plus2; 306 set di dati) campioni disponibili al pubblico. Dopo la standardizzazione, GENT offre dati sull'espressione genica su diversi tessuti, che sono ulteriormente divisi in tessuti tumorali e normali.

1. Fare clic sulla scheda Cerca nella parte superiore dello schermo.
2. Nella sezione con l'etichetta 1. Parola chiave, selezionare il simbolo Gene per i Termini dal menu a discesa, immettere il simbolo genico del gene di interesse nell'area vuota della sezione Parola chiave e selezionare Tessuto per l'opzione Tipo.
3. Fare clic sul pulsante Cerca nella parte inferiore del 1. Sezione Parole chiave. Mostra i grafici di sintesi dell'espressione genica nei tessuti normali e tumorali di diversi tipi di cancro basati sulle piattaforme U133A e U122Plus2.
   NOTA: è facoltativo selezionare l'opzione Filtro dati nella parte superiore del grafico di riepilogo per individuare un database specifico da studiare.
4. Fare clic sul collegamento accanto a Download dei dati dei risultati per accedere alle informazioni dettagliate sui valori dell'espressione genica, sui tipi di tessuto e sulle origini dati.

4. Broad Institute Cancer Cell Line Enciclopedia (CCLE)

NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) è stato creato dal Broad Institute e fornisce profili genomici e mutazioni di 947 linee cellulari del cancro umano²⁰.

1. Immettere i geni desiderati nella barra di ricerca, quindi fare clic sul pulsante Cerca.
2. Nella sezione Seleziona set di dati, fare clic sull'opzione espressione mRNA (RNAseq) dal menu a discesa.
   NOTA: Altre opzioni includono espressione mRNA (Affy), Achille shRNA knockdowne Numero di copia.
3. Fare clic sul pulsante Attiva/disattiva tutte le tracce. Selezionare il tipo di tessuto di interesse dalla casella grigia a destra. Scorrere verso il basso fino alla parte inferiore dello schermo e fare clic sul pulsante Scarica espressione mRNA.
4. Aprire il documento di testo scaricato. Copiare e incollare tutto il testo nel foglio 1. Copiare tutto il testo nel foglio 1.
5. Fare clic sul foglio nella scheda Foglio 2 del foglio di calcolo nella parte inferiore del foglio di calcolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna A, selezionare Incolla speciale, quindi selezionare l'opzione Trasponi nel foglio 2.
6. Una volta che il testo viene trasposto in due colonne sul foglio 2,fare clic sulla freccia a discesa per l'intestazione dell'opzione Ordina e filtra e quindi selezionare l'opzione Filtro. Nell'area dell'intestazione l'etichetta Gene verrà visualizzata una freccia denominata Gene. Fare clic sulla freccia e digitare il tipo di tessuto di interesse.
   NOTA: Questo passaggio filtrerà tutti i dati e visualizzerà solo i livelli di espressione genica per il tipo di tessuto di interesse.

5. cBioPortale

NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) è stato sviluppato presso il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), e accede, analizza e visualizza dati genomici tumorali su larga scala^21,22. In particolare, questo portale consente ai ricercatori di cercare alterazioni genetiche e reti di segnalazione.

1. Utilizzando la query nella pagina di destinazione, fare clic sugli organi/tessuti di interesse nella sezione Seleziona studi. Seleziona il particolare studio di interesse, quindi premi il pulsante Query By Gene.
2. Nella sezione Seleziona profili genomici, selezionare una delle tre opzioni: Mutazioni, Alterazioni del numero di copia putativo da GISTICo espressione mRNA. Selezionare inoltre i dati corrispondenti dal menu a discesa per Seleziona paziente/insieme di casi.
3. Immettere i simboli di gene di destinazione nella casella di query di Immetti gene. Fare clic sul pulsante Invia query.
4. Fare clic sulla scheda Rete nella parte superiore della pagina per recuperare la rete genica desiderata.
   NOTA: la rete di segnalazione è contradtura a colori. I geni immessi sono indicati da nodi di semi con un bordo spesso. Ogni gene è rappresentato da un cerchio rosso e l'intensità del colore del cerchio rosso riflette la sua frequenza di mutazione. I geni sono collegati da linee di colore diverso. Le linee marroni significano "Nello stesso componente", che indica il coinvolgimento nella stessa componente biologica. Linee blu significano "Reagisce con", indicando le reazioni geniche. Linee verdi significano "Cambiamento di Stato", suggerendo che un gene potrebbe causare un cambiamento di stato di un altro gene.
5. Fare clic sulla scheda File nella parte superiore dell'immagine per scegliere Salva come immagine (PNG) per il download dell'immagine di rete.

6. Dissezione della Drosophila con i genotipi desiderati e colorazione DAPI

NOTA: Raccogliere la Drosophila femmina con i genotipi desiderati, quindi sezionare le ovaie di mosca per sottoporsi alle procedure di colorazione DAPI per l'imaging.

1. Preparare le scorte di mosche tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w; UAS-mam.A; e w[1118] per creare mosche con sovraespressione NICD(tj-Gal4, Gal80ts/ ; UAS-NICD-GFP/z) e NICD e mam-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/z) .
2. Applicare la tecnica di targeting per l'espressione genica temporale e regionale (TARGET) per controllare l'espressione genica spatiotemporale²³. Sollevare le mosche a 18 gradi centigradi fino all'età adulta, quindi spostare a 29 gradi centigradi per 48 h con lievito prima della dissezione.
   NOTA: tj-Gal4 può guidare l'espressione UAS solo a temperature più elevate, quando l'inibizione di Gal80ts è alleviata. L'aggiunta di lievito prima della dissezione allarga le ovaie per la raccolta.
3. Mettere 3 mL di 1x fosfato-bufferana (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) in un piatto di raccolta degli embrioni. Utilizzare un pad DI CO₂ per anesizzare le mosche.
4. Scegli una mosca femminile, quindi afferra con cura il torace inferiore della mosca usando un paio di pinze dissetanti e immergila nella soluzione 1x PBS in un piatto di raccolta embrionale. Utilizzare una seconda coppia di pinze per pizzicare l'addome inferiore e tirare delicatamente per rilasciare gli organi interni.
5. Identificare e staccare la coppia di ovaie dal corpo della mosca. Rompere la fala muscolare situata all'estremità posteriore delle ovaie e separare le ovariole.
   NOTA: Per ottenere risultati di colorazione di qualità superiore è necessario separare le ovarioe e rompersi la rottura muscolare.
6. Collocare le ovaie in un tubo di centrifuga di 1,5 mL che contiene 500 -L di 1x PBS. Il tubo deve rimanere sul ghiaccio fino a quando non vengono raccolte tutte le ovaie.
7. Rimuovere il 1x PBS e posizionare 0,5 mL di soluzione fix (4% formaldeide) nel tubo. Posizionare il tubo sul nutatore per 10 min.
8. Rimuovere la soluzione di fissaggio dal tubo e smaltirla in un contenitore di rifiuti adatto. Utilizzare 1 mL di 1x PBT (1x PBS integrato con 0,4% Triton™ X-100) per lavare le ovaie 3x per 15 min.
9. Scartare il lavaggio PBT finale e aggiungere 1 mL di PBTG (0,2% di albumin a siero bovino, siero di capra normale del 5% in 1x PBT) per evitare l'associazione non specifica.
   NOTA: Questo passaggio potrebbe essere saltato per la colorazione DAPI, ma è essenziale per la colorazione degli anticorpi. In Jia et al.²⁴si possono trovare macchie dettagliate di immunohistochimica.
10. Mettete 150 l di DAPI (10 g/mL) nel tubo per una noda di 10/15 minuti. Eliminare il DAPI e lavare le ovaie 1x per 10 min utilizzando 1 mL di 1x PBT. Rimuovere il PBT e lavare 2x per 10 min utilizzando 1x PBS.
11. Rimuovere l'eccesso di PBS fino a quando circa 300 gradi di PBS rimane nel tubo con le ovaie. Convogliare le ovaie su e giù più volte utilizzando una pipetta da 200 l,l, al fine di liberare le camere d'uovo.
12. Ruotare delicatamente il tubo e rimuovere con attenzione il più 1x soluzione PBS possibile senza rimuovere le ovaie. Inserire nel tubo 120 l di soluzione di montaggio (1 g di gallato n-propyl, 5 ml di 10X PBS, 40 ml di glicerolo e 5 ml di dH₂O).
    NOTA: la soluzione di montaggio è appiccicosa, quindi è difficile trasferire esattamente 120 - L di soluzione di montaggio in un tubo. Per alleviare questo problema, è possibile utilizzare una punta di pipetta da 1.000 lun per aggiungere tre gocce di soluzione di montaggio nel tubo.
13. Rimuovere circa 0,33 mm da una punta di pipetta da 200 e utilizzare la punta pipetta appena tagliata per posizionare la soluzione di montaggio su un vetrino di vetro al microscopio.
14. Posizionare delicatamente il vetro dello strizzacco sulla soluzione di montaggio e sigillare i bordi dello slittamento di copertura con smalto trasparente.
    NOTA: È necessario sigillare i bordi del vetro di copertura per evitare che le camere d'uovo scorano all'interno della soluzione di montaggio quando si scattano immagini confocali.
15. Acquisire immagini con un microscopio confocale utilizzando le seguenti impostazioni: obiettivo - ingrandimento 10x; apertura numerica: 0,8; Lunghezza d'onda di emissione DAPI : 410-513 nm.

Risultati

Utilizzando la procedura descritta nel passaggio 1 utilizzando il portale PRECOG, sono stati ottenuti i punteggi di NOTCH2, NOTCH3e MAML1 nel cancro ovarico (rispettivamente 1.3, 2.32, 1.62). I valori negativi di .u2012score indicano la scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti con alti livelli di espressione dei tre geni. Utilizzando la formattazione condizionale del software per fogli di calcolo, i valori di score 2012 vengono visualizzati in un grafico a barre colorate n...

Discussione

Poiché ci sono innumerevoli approcci e metodi per l'utilizzo della bioinformatica, ci sono numerosi database disponibili online per il grande pubblico. Un'abbondanza di informazioni può essere estratta da ciascuno di questi database, ma alcuni sono più adatti per scopi particolari, come valutare la sopravvivenza del paziente sulla base di determinati input. Le analisi sistematiche dei dati recuperati da diverse banche dati individuali possono produrre risultati scientifici importanti.

L'ana...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum	Gibco	16210064	Serum
Embryo dish	Electron Microscopy Sciences	70543-45	Dissection Dish
Nutating mixers	Fisherbrand	88861041	Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B	Dr. Wu-Min Deng at Florida State University	N/A	Fly stock
w*; UAS-mam.A	Bloomington Drosophila Stock Center	#27743	Fly stock
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	#5905	Fly stock
The PRECOG portal	Stanford University	precog.stanford.edu	Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB	Cancer Science Institute of Singapore	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal	Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)	Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research	portals.broadinstitute.org/ccle	Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)	cioportal.org	Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope	Carl Zeiss	ID #M 210491	Examination and image collection of fluorescently labeled specimens