检测小鼠中性粒细胞的迁移和渗透

摘要

在这里，我们提出了三种方法，以评估嗜中性粒细胞迁移和渗透在体内和体外。这些方法可用于发现针对中性粒细胞迁移的有前途的治疗方法。

摘要

嗜中性粒细胞是先天免疫系统的主要成员，在宿主防御病原体和病理炎症反应方面发挥着关键作用。中性粒细胞可以通过细胞因子和化学因子的指导被招募到炎症部位。中性粒细胞的渗透可能导致不分青红皂白的组织损伤，如风湿性关节炎（RA）。从围肠渗出物分离的嗜中性粒细胞对定义的化学吸引剂N-form-Met-Leu-Phe（fMLP）有反应，在Transwell或Zigmond室测定中体外。气囊实验可用于评估中性粒细胞对体内脂多糖（LPS）的化学性评价。佐剂诱发关节炎（AA）小鼠模型常用于RA研究，与抗骨髓过氧化物酶（MPO）或抗中性粒细胞酶（NE）抗体的关节部分的免疫组织化学染色是一种公认的测量方法中性粒细胞渗透。这些方法可用于发现针对中性粒细胞迁移的有前途的疗法。

引言

嗜中性粒细胞是最丰富的白细胞，^占人类白细胞总体的50-70%。中性粒细胞是急性炎症的主要反应者之一。中性粒细胞可以通过组织驻留细胞^2、3、4释放的细胞因子和化学因子的引导，被招募到炎症部位，由中性粒细胞表面的细胞粘附分子和血管内皮细胞⁵的相互作用来调节。中性粒细胞是宿主防御的基础，并在病理炎症反应中发挥作用，因为它们强大的能力通过释放活性氧物种（ROS）和其他破坏组织分子^3，6来破坏组织。

先前的研究描述了小鼠或人类的几种中性粒细胞分离方案。Oh等人演示了一种密度梯度分离方法，将人类嗜中性粒细胞从全人类血液中分离出来^7。然而，由于血量小，很难从小鼠血液中分离足够的嗜中性粒细胞。另外，可以从小鼠嗜虫液中引出大量纯和可行的小鼠中性粒细胞，这些纯化的嗜中性粒细胞可用于检查细胞外功能的几个方面，包括嗜中性粒细胞渗透、迁移、化学毒杆菌、氧化爆裂、细胞因子和中性粒细胞外陷阱（NET）生产^8。Transwell测定⁹或Zigmond室测定^10，11可用于评估嗜中性粒细胞在体外迁移。气囊模型用于评估嗜中性粒细胞在体内的迁移和渗透。皮下气囊模型是研究炎症细胞迁移的方便体内动物模型。

传统上，中性粒细胞被认为是炎症急性阶段的病原体消除剂。然而，最近的发现表明，嗜中性粒细胞是复杂的细胞，执行大量的特殊功能。嗜中性粒细胞可以调节许多过程，如急性损伤和修复，肿瘤发生，自身免疫反应，和慢性炎症^12，13。中性粒细胞还调节适应性免疫反应，并能调节B细胞和T细胞^14，15。中性粒细胞的大量短缺导致人类死亡或严重的免疫缺陷，小鼠的嗜中性粒细胞耗竭导致死亡，而器官中中性粒细胞的过度激活或招募会导致多种免疫疾病，如风湿性关节炎（RA）和系统性红斑狼疮^{（SLE）6。}嗜中性粒细胞是RA患者的阴膜流体中最丰富的细胞。嗜中性粒细胞通过降解产生过量的骨髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞酶（NE），从而加剧软骨侵蚀。MPO是一种过氧化物酶，主要表现在嗜中性粒细胞¹⁶的颗粒中。NE与关节软骨破坏有关^17。MPO和NE可用于评估嗜中性粒细胞迁移和在RA患者组织中渗透的状态。

本文提供了三种常规方法，用于评估在体内和体外诱导的正常嗜中性粒细胞的迁移，以及病理性嗜中性粒细胞在小鼠关节特异性炎症模型中的渗透。

研究方案

所有实验程序均经北京中医药大学动物护理与使用委员会审核通过。

注:使用C57BL/6小鼠（7-8周大）。

1. 中性粒细胞分离

1. 围肠渗出细胞的采集
   1. 在 ddH₂O 中制备新鲜的 10% 蛋白酶肽溶液。根据小鼠数量计算所需的体积。
      注:将小鼠数量设置为N，（2N+1）溶液的mL必须提前溶解和过滤。
   2. 用 70% 乙醇喷洒工作空间。使用胰岛素注射器提取 1 mL 的肽溶液和放电气泡。
   3. 每只小鼠进行1mL的肽溶液的第一次腹内注射。
      1. 用一只手将鼠标放在头向下的位置。用酒精浸泡的棉球消毒注射点。
         注: 首选注射位置位于腹部左下或右象限的横向。
      2. 快速注入试剂。使用胰岛素注射器将1 mL注射到每只小鼠的围腔中。
         注:针头和皮肤之间的角度应约为15~30°，以免损伤肠道或其他器官。
   4. 允许炎症反应在一夜之间发展。12小时后，以与第一次注射相同的方式进行第二次注射。
   5. 第二次注射后三小时，以2L/min的速度在气体麻醉室中用5%异二苯对小鼠进行5分钟的完全麻醉。将麻醉小鼠从腔室中取出，并因宫颈脱位而牺牲它们。
      注:在将小鼠从腔室移到单呼吸单元之前，通过捏脚趾确保麻醉深度。当脚趾被挤压时，双腿不应移动。
      注:以下所有步骤应在组织培养罩中处理。
   6. 用70%乙醇喷洒鼠标。将鼠标放在无菌塑料垫上，用针头固定四肢。
   7. 使用一套无菌手术工具在下腹部中间进行水平切口（±1厘米）。用钳子抬起上腹部的皮肤，沿着腹部的中线切开，露出完整的腹壁。
   8. 用30G x 1/2"针将5 mL的无菌RPMI-1640完整介质注射到腹腔中。将针头插入围网壁，针头的下部边缘朝上，然后注入整个体积。
   9. 水平摇动垫子5分钟，轻轻按摩腹部几次。
   10. 将 23 G x 1 1/4" 针头注射到腹部的横向空间。提取腹部液体（±5 mL），并将其收集在50 mL离心管中。
       注:在中性粒细胞激活的情况下，尽快将管子放在冰上。
   11. 再注射5 mL的完整介质，并重复该过程，从围肠中取出剩余的细胞。将围肠液汇集在 50 mL 离心管中。
   12. 在室温 （RT） 下，以 400 x g将池的围肠液离心 10 分钟。
   13. 丢弃上清液。在 1 mL 的 RPMI-1640 完整介质中重新悬浮细胞。
       注:请勿涡旋以避免中性粒细胞激活。
2. 中性粒细胞的隔离
   1. 在15 mL离心管中加入4 mL的70.2%密度梯度介质（例如Percoll）。
   2. 小心地将4 mL新制备的54.8%密度梯度介质覆盖在70.2%密度梯度介质上，缓慢地沿管边缘，在15 mL离心管中使用尖锐的移液器尖端。
      注意:请小心避免干扰 54.8% 密度梯度介质和 70.2% 密度梯度介质之间的界面。
   3. 小心地将1 mL围层细胞悬浮液缓慢地覆盖在54.8%密度梯度介质层的顶部，使用锋利的移液器尖端（图1A）。
      注意:请小心避免干扰细胞悬浮液和54.8%密度梯度介质之间的界面。
   4. 在 22°C 下以 1，500 x g离心 30 分钟，无需制动。
   5. 在54.8%密度梯度介质和70.2%密度梯度介质层（图1B）的界面处收集嗜中性粒细胞到新管。
   6. 在收集的细胞中加入 1 mL 的 RPMI-1640 完整培养基，并通过轻轻移液多次小心地重新悬浮细胞。在 RT 下以 100 x g离心 10 分钟，并小心地去除上清液。
   7. 重复洗涤步骤（步骤 1.2.6）一次。
   8. 将 0.5 mL 的培养基剂添加到颗粒中，并通过轻轻移液多次重新悬浮细胞。使用自动血液学分析仪以 50 μL 等分法对细胞进行计数。

2. 中性粒细胞迁移测定

1. 测量中性粒细胞迁移通过Transwell测定⁹或Zigmond室测定如前面描述的^10，11。

3. 气囊测定

1. 第一次空气喷射
   1. 第0天，在气体麻醉室以2升/分钟的速度用5%的等值鲁兰对小鼠进行3分钟的完全麻醉，并在一个呼吸单元中保持每只小鼠的麻醉，其中2%的亚曲尼以0.5 L/min的速度。
      注:在将小鼠从腔室移到单呼吸单元之前，通过捏脚趾确保麻醉深度。当脚趾被挤压时，双腿不应移动。
   2. 使用连接到 5 mL 注射器的 0.22 μm 过滤器获得 3 mL 的灭菌空气。
   3. 提起麻醉小鼠的后皮肤，用钳子和皮下注射3 mL的消毒空气使用26G x 3/8"针。
   4. 治疗后，将小鼠从呼吸单元中取出。监测老鼠，以确保它们还活着，直到它们开始移动。
2. 第二次空气喷射
   1. 第 3 天，将另外 3 mL 的灭菌空气注入先前建立的气囊中，以维持第 3.1 节所述的气囊。
3. 治疗
   1. 在牺牲前6小时的第6天，将不同的治疗注射到气囊中。注射1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）作为负对照。注射1 mL 1 μg/mL LPS作为阳性对照，诱导局部炎症。
   2. 以2L/min的速度在气体麻醉室中用5%的亚福兰对小鼠进行3分钟的完全麻醉，并在一个呼吸单元中保持每只小鼠的麻醉，2%的亚福兰以0.5 L/min的速度进行洗涤缓冲液。
      注:在将小鼠从腔室移到单呼吸单元之前，通过捏脚趾确保麻醉深度。当脚趾被挤压时，双腿不应移动。
   3. 对于每个气囊，用1 mL的洗涤缓冲液清洗气囊，并在15 mL离心管中收集炎症渗出物。用2 mL的洗涤缓冲液2x清洗气囊，并在同一离心管中收集炎症渗出物。
   4. 在RT处以100 x g离心10分钟，丢弃上清液，在1mL的洗涤缓冲液中重新悬浮细胞。使用自动血液学分析仪对细胞进行计数以量化中性粒细胞比。
      注:参见图 2 中的代表性结果。

4. 辅助性关节炎 （AA） 小鼠模型的诱导

1. 通过涡旋至少5s来暂停完整的Freund的佐剂（CFA），然后将100μL的悬浮液抽入胰岛素注射器中。
   注意:我们建议在实验中使用全新的CFA，以确保无菌。
2. 如步骤 3.1.1 中所述，麻醉小鼠。
3. 标记所选的爪子，并将 20 μL 的 CFA 注射到脚踝关节空间。将 20 μL 的悬浮液注入所选爪子上的四个外心点（共 80 μL）。
4. 将小鼠从呼吸单元中取出，并将加工过的小鼠放入新腔室。监测小鼠，确保它们呼吸，直到它们恢复移动能力。
5. 每3天，使用袖珍厚度计（图3A）测量脚踝关节直径，评估关节直径。
6. 每3天，按关节炎评分标准评估关节炎严重性（图3C）:0，正常，无红斑和肿胀的证据;1、最轻度关节炎、红斑和轻度肿胀仅限于牙垢或踝关节;2、中度关节炎、红斑和轻度肿胀，从脚踝延伸到牙垢;3、严重关节炎、红斑和中度肿胀，从脚踝延伸到骨关节;4、最严重的关节炎、红斑和严重肿胀包括脚踝、足部和数字，或肢体的安基洛病。

5. 关节部分的免疫性植物化学染色

1. 联合隔离
   1. 使用异法兰麻醉后，在第4节中牺牲小鼠，使用宫颈错位。用70%乙醇喷洒鼠标。
   2. 用钳子和剪刀从后腿上取下皮肤和部分肌肉。用70%乙醇喷洒关节，并用纸巾去除其他肌肉。
   3. 在RT.在10%EDTA中将关节在10%EDTA中分化2天，在4%的甲醛中固定脚踝关节，并在RT上改变中等。
   4. 将组织嵌入石蜡中，并准备4μm厚的组织部分。
      1. 将组织放入具有一定体积的液体石蜡的标记模具中。短暂冷却。
      2. 将厚度设置为 4 μm，并在缩微器上切片。在 43 °C 水浴中浮动部分。
      3. 将部分安装到幻灯片上，并将幻灯片在 70°C 下放入烤箱 2 小时。将来使用时，将幻灯片保存在 -20 °C。
2. 萨夫兰宁O和关节部分的快速绿色染色
   注:在 RT 上执行以下染色步骤。
   1. 将步骤 5.1.4.3 的滑轨放入机架中，在 RT 处进行以下洗涤以补充水合:2 分钟（3 倍）的二甲苯、2 分钟（2x）的 100% 乙醇、2 分钟（2x）的 95% 乙醇、2 分钟的 70% 乙醇和 50% 乙醇 15 分钟的洗涤自来水 3 分钟。
   2. 在 0.1% 快速绿色溶液中染色 5 分钟，在 1% 醋酸中冲洗 10 秒。
   3. 在0.1%沙夫兰宁O染色溶液中染色20分钟。将幻灯片浸入以下处理中:95%乙醇2分钟（2倍），100%乙醇2分钟（2倍），二甲苯2分钟（2倍）。
   4. 安装组织部分，在显微镜下观察组织。
      注:参见图 4A中的代表性图像。
3. 免疫性化学染色，使嗜中性粒细胞可视化
   1. 在 78°C 下烘烤石蜡部分 2 小时。将滑轨放入机架中，在 RT 处执行以下排水以补充水合:二甲苯 15 分钟（2 倍），100% 乙醇 5 分钟（2 倍），95% 乙醇 5 分钟，80% 乙醇 5 分钟，H₂O 3 分钟，PBS 3 分钟。
      注:在此步骤中，请勿让幻灯片随时干燥。
   2. 加入一滴渗透缓冲液以覆盖组织。在 37°C 的湿度控制托盘中孵育部分。
   3. 在 PBS 中冲洗幻灯片 3 分钟（3 次）。避免直接对组织进行下眼部。
   4. 使用压力锅炉执行热诱导抗原表位检索。
      1. 在机架中排列幻灯片。将滑梯浸入充满检索缓冲器的压力锅炉中。
      2. 将压力锅炉放在微波炉上。将微波炉设置为 600 W，将幻灯片加热 10 分钟。
      3. 煮沸后，将滑片放在锅炉中冷却至90°C。拿出幻灯片，在 PBS 中冲洗 3 分钟（3 倍）。
   5. 在RT处新鲜制备的3%H₂O₂中，在PBS中冲洗幻灯片15分钟（3倍）。
   6. 用疏水笔在样品周围勾勒出一个大圆圈，避免接触样品。在37°C的湿度控制室中用3%牛血清白蛋白（BSA）块状60分钟。
   7. 删除阻塞解决方案。快速向每个部分加入50μL的PBS稀释原抗体。然后，在4°C的湿度控制托盘中孵育幻灯片过夜。
      注: 不同的抗体使用不同的稀释比（MPO 为 1:25，NE 为 1:20）。
   8. 第二天，拿出托盘，让它在RT上站立30分钟。然后，在 PBS 中冲洗幻灯片 3 分钟（3 倍）。
   9. 向组织添加50μL的PBS稀释二级抗体。
      注:应用了不同的稀释比:MPO为1:1，000，NE为1:1，500。
   10. 在 37°C 的湿度控制托盘中孵育幻灯片 30 分钟。然后，在 PBS 中冲洗幻灯片 3 分钟（3 倍）。
   11. 在稀释的3，3'-二氨基苯甲酸（DAB）溶液中开发5分钟。留意在深色发展时的反应。在蒸馏水中冲洗幻灯片。
   12. 将滑片在血氧林中再污10秒，在自来水中冲洗幻灯片5分钟。
   13. 在酸性酒精中冲洗3s的超快分化溶液。然后用自来水冲洗10分钟。
   14. 在RT处将滑片浸入以下处理中:80%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，二甲苯15分钟（2倍）。使用安装解决方案修复盖玻片。在显微镜下观察组织。
       注:参见图4B中的代表性图像。

结果

从小鼠的洗漱液中收集围渗出细胞。细胞在 1 mL 的 RPMI-1640 完整介质中重新悬浮，分层到两步 （54.8%/70.2%）不连续密度梯度（图1A），在1，500 x g下离心30分钟。 嗜中性粒细胞（+95%，±1 x 10⁷嗜中性粒细胞/小鼠）从下界面中恢复（图1B）。

进行?...

讨论

从外周血^7，骨髓和组织¹⁸高度纯化的中微粒细胞的详细方案已经提供很长时间。在这里，我们采用一种方法，将嗜中性粒细胞与围肠液¹⁹分离，其中成熟的嗜中性粒细胞保持灭活，以便进一步抗炎和抗氧化研究。

我们使用气囊实验来探索LPS诱导的嗜中性粒细胞在体内的渗透。该方法被提出作为直接测量细胞在体内一般炎症...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Fast Green Solution	Solarbio	8348b	Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution	Solarbio	8348a	Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0	Sigma	324506	Sterile
100% Ethanol	Beijing Chemical Works
100% Methanol	Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube	Falcon	14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle	BD	305120
26 G x 3/8" Needle	BD	305110
3% bovine serum albumin (BSA)			Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2			Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle	BD	305106
30% H2O2	Beijing Chemical Works
5 mL Syringe	BD	Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube	Falcon	14-432-22
50% Ethanol			Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll			Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol			Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll			Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol			Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol			Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution	Beyotime	C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody	Abcam	ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody	Abcam	ab21595
Automatic Hematology Analyzer	Sysmex	XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml	sigma	1002036152
Cover Slip	CITOGLAS	10212432C
Dial Thickness Gauge	Mitutoyo	7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL	Sigma	Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium	PAN	P30-1302
Gas Anesthesia System	ZS Dichuang	ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	PPLYGEN	C1309	This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Hematoxylin Staining Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit	Solarbio	G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100×	Invitrogen	1514022
Percoll	GE Healthcare	10245207	Density gradient medium
Permeabilization Buffer			Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1×			Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10×			Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone	Oxoid	1865317
Retrieval Buffer			Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC			Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC			Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758
RPMI-1640 Complete Medium			RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL	BD	328421
Slide	CITOGLAS	10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP)			Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay			Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene	Beijing Chemical Works