マウスの好中球の遊走と浸潤の検出

要約

ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。

要約

好中球は、自然免疫系の主要なメンバーであり、病原体および病理的炎症反応に対する宿主防御において極めて重要な役割を果たす。好中球は、サイトカインとケモカインの指導を介して炎症部位にリクルートすることができます。好中球の圧倒的な浸潤は、関節リウマチ(RA)のような無差別組織損傷を引き起こす可能性があります。腹膜滲出物から単離された好中球は、規定の化学誘引剤、N-ホルミル-メット・レウフェ(fMLP)、インビトロイントランスウェルまたはジグモンドチャンバーアッセイに応答する。空気袋実験は、生体内のリポ多糖(LPS)に対する好中球の走化力を評価するために使用することができる。アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルはRA研究で頻繁に使用され、抗骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)または抗好中球エラスターゼ(NE)抗体を有する関節切片の免疫組織化学的染色は、十分に確立された測定方法である好中球浸潤。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療法を発見するために使用することができる。

概要

好中球は最も豊富な白血球であり、ヒト1の白血球集団全体の50〜70%^を占める。好中球は、急性炎症時の主要な応答者の1つである。好中球は、組織常駐細胞^2、3、4によって放出されるサイトカインおよびケモカインの誘導を介して炎症部位にリクルートすることができるが、これは好中球と血管内皮細胞⁵の表面上の細胞接着分子との相互作用によって媒介される。好中球は、防御をホストする基礎であり、活性酸素種(ROS)および他の組織損傷分子^3、6の放出を介して組織に損傷を与える強力な能力のために、病理的炎症反応の役割を果たす。

これまでの研究では、マウスまたはヒトからの好中球分離プロトコルをいくつか記載している。Ohら、ヒト好中球を全ヒト血液⁷から単離する密度勾配分離法を実証した。しかし、マウスの血液から十分な好中球の分離は、血液量が少ないため困難である。あるいは、マウス腹膜液から多数の純粋で生存可能なマウス好中球を引き出し、これらの精製された好中球は、好中球浸潤、移行、走化、酸化バースト、サイトカインおよび好中球細胞外トラップ(NET)産生^を含む細胞機能エクスビボのいくつかの側面を調べるためにex vivoを使用することができる。トランスウェルアッセイ⁹またはジグモンドチャンバーアッセイ^10,11は、インビトロで好中球移行を評価するために使用することができる。エアポーチモデルは、生体内の好中球の移動および浸潤を評価するために使用されます。皮下エアポーチモデルは、炎症性細胞の遊散を研究するのに便利な生体内動物モデルである。

従来、好中球は炎症の急性期における病原体排除物質と考えられていた。しかし、最近の知見は、好中球が特殊な機能のかなりの多様性を実行する複雑な細胞であることを示しています。好中球は、急性損傷および修復、腫瘍形成、自己免疫応答、および慢性炎症^12、13などの多くのプロセス^を調節することができる。好中球はまた、適応免疫応答を調節し、B細胞およびT細胞^14、15を調節することができる。好中球の大幅な不足は、ヒトの死亡率または重度の免疫不全をもたらし、マウスの好中球の枯渇は死亡につながるが、臓器中の好中球の過剰な活性化または募集は、関節リウマチ(RA)および全身性エリテマトーシス(SLE)6などのいくつかの免疫疾患を引き起こす。好中球は、RA患者の滑液中で最も豊富な細胞である。好中球は、軟骨侵食を悪化させる分解を介して、骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)および好中球エラスターゼ(NE)の過剰な量を生成します。MPOは、主に好中球¹⁶の顆粒に発現するペルオキシダーゼ酵素である。NEは、関節軟骨破壊¹⁷に関連している。MPOおよびNEは、RA患者の組織における好中球移動および浸潤の状態を評価するために使用することができる。

本稿は、インビボとインビトロの両方で誘導される正常な好中球の移動を評価する3つの従来の方法と、マウス関節特異的炎症モデルにおける病理学的好中球の浸潤を提供する。

プロトコル

すべての実験手順は、北京中華医学大学動物ケアおよび使用委員会によって審査され、承認されました.

注:C57BL/6マウス(7〜8週齢)を使用した。

1. 好中球の分離

1. 腹膜滲出細胞の取得
   1. ddH₂Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。
      注:マウスの数をN、(2N+1)mLの溶液をあらかじめ溶解し、濾過する必要があります。
   2. 70%エタノールでワークスペースをスプレーします。インスリンインジェクターを使用して、1 mLのペプトン溶液と排出気泡を描画します。
   3. マウス1回につき1mLのペプトン溶液の最初の腹腔内注射を行う。
      1. 片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。
         注:好ましい注射位置は、腹部の左下または右象限の側面にあります。
      2. 試薬を迅速に注入する。インスリンインジェクターを使用して各マウスの腹腔に1 mLを注入する。
         注:針と皮膚の間の角度は、腸や他の臓器を傷つけられないように、約15〜30°でなければなりません。
   4. 炎症反応を一晩で発症させる。12時間後、第1の注射と同様に第2の注射を行う。
   5. 2回目の注射の3時間後、ガス麻酔室で5分間5分間のイソフルランを2L/分の速度で完全に麻酔し、麻酔したマウスをチャンバーから取り出し、子宮頸部脱臼によって犠牲にした。
      注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。
      注: 以下のすべての手順は、組織培養フードで処理する必要があります。
   6. マウスに70%エタノールを噴霧する。無菌プラスチックパッドの上にマウスを置き、針で手足を固定します。
   7. 下腹部の真ん中に水平切開(約1cm)を作るために外科用具の無菌セットを使用する。上腹部の皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部の正中線に沿って切断し、無傷の腹膜を露出させる。
   8. 30 G x 1/2 インチ針で 5 mL の無菌 RPMI-1640 完全培地を腹腔に注入します。針の縁を上に向けて腹膜を通して針を挿入し、ボリューム全体を注入します。
   9. パッドを左右に振って5分間、腹部を数回やさしくマッサージします。
   10. 腹部の横のスペースに23 G x 1 1/4インチの針を注入します。腹部の液体(~5mL)を抽出し、50mLの遠心管に回収します。
       注:好中球が活性化した場合は、できるだけ早くチューブを氷の上に置きます。
   11. 完全な培地の別の5 mLを注入し、腹皮から残りの細胞を除去するために手順を繰り返す。50 mL遠心管で腹膜液をプールします。
   12. プールされた腹膜液を室温(RT)で10分間400 x gで遠心します。
   13. 上清を捨てます。RPMI-1640完全培地の1 mLで細胞を再懸濁します。
       注:好中球の活性化を避けるために渦を起かないでください。
2. 好中球の単離
   1. 作製した70.2%濃度勾配培地(例えば、パーコール)の4 mLを15mL遠心管に加える。
   2. 慎重に15 mL遠心管の鋭いピペットの先端と管の端に沿って70.2%の密度勾配媒体に作製した54.8%の密度勾配媒体の4 mLを重ね合わせなさい。
      注: 54.8% 密度勾配媒体と 70.2% 密度勾配媒体の間のインターフェースを乱さないように注意してください。
   3. 54.8%密度勾配培地層の上に1mLの腹膜細胞懸濁液を慎重に重ね、鋭利なピペットチップを用いてゆっくりと重ねられます(図1A)。
      注: セルサスペンションと54.8%密度勾配媒体との間のインターフェースを乱さないように注意してください。
   4. 1,500 x gでの遠心分離機(ブレーキをかけずに22°Cで30分間)
   5. 54.8% 密度勾配媒体の界面で好中球を集め、70.2% 密度勾配培地層 (図 1B) を新しいチューブに集めます。
   6. 採取した細胞にRPMI-1640完全培地1mLを加え、数回穏やかにピペットで細胞を慎重に再懸濁させる。RTで10分間100xgで遠心分離し、慎重に上清を取り除きます。
   7. 洗浄手順(ステップ1.2.6)を1回繰り返します。
   8. ペレットに0.5 mLの培養培地を加え、数回穏やかにピペットで細胞を再懸濁します。50 μLのアリコートを使用して、自動血液分析装置を使用して細胞をカウントします。

2. 好中球移動アッセイ

1. トランスウェルアッセイ⁹またはジグモンドチャンバーアッセイによる好中球移行を、前述の^10,11で測定する。

3. エアポーチアッセイ

1. 初のエアインジェクション
   1. 0日目、ガス麻酔室で3分間のイソフルランを5%のマウスを2L/分の速度で完全に麻酔し、2%のイソフルランを0.5L/分の速度で1回の呼吸単位で各マウスの麻酔を維持する。
      注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。
   2. 5 mLシリンジに取り付けられた0.22μmのフィルターを使用して、3 mLの殺菌空気を得ます。
   3. 麻酔マウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、26 G x 3/8インチ針を使用して3 mLの滅菌空気を皮下に注入します。
   4. 治療後、マウスを呼吸ユニットから取り出す。マウスが動き始めるまで、マウスが生きていることを確認します。
2. 第2空気注入
   1. 3日目に、セクション3.1で説明したように、エアポーチを維持するために、以前に確立されたエアポケットに殺菌空気の追加3 mLを注入します。
3. 治療
   1. 6日目、6時間前に、エアポーチに異なる治療を注入する。陰性コントロールとして1 mLのリン酸緩衝生理食塩基(PBS)を注入する。1 μg/mL LPS の 1 mL を、局所炎症を誘発する陽性コントロールとして注入します。
   2. ガス麻酔室で5%のイソフルランを2L/分の速度で3分間完全に麻酔し、各マウスの麻酔を2%のイソフルランを2%の速度で単一の呼吸単位に維持する。
      注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。
   3. 各エアポーチについて、1 mLの洗浄バッファーでエアポーチを洗浄し、15 mL遠心管で炎症性の滲出液を回収します。2 mLの洗浄バッファー2xでエアポーチを洗浄し、同じ遠心管内に炎症性滲出液を回収する。
   4. RTで10分間100xgで遠心分離し、上清を捨て、1 mLの洗浄バッファーに細胞を再懸濁します。 自動血液分析装置を用いて細胞を数えて好中球比を定量化する。
      注 : 図2の代表的な結果を参照してください。

4. アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルの誘導

1. 少なくとも5秒の渦を引くことによってフロイントのアジュバント(CFA)を中断し、インスリンインジェクターに100μLの懸濁液を引き込む。
   注:私たちは、無菌性を確保するために実験で完全に新しいCFAを使用することをお勧めします。
2. ステップ3.1.1で説明したマウスを麻酔する。
3. 選択した足にマークを付け、20 μLのCFAを足首の関節空間に注入します。選択した足の4つの関節のスポット(合計で80μL)に20 μLの懸濁液を注入します。
4. マウスを呼吸ユニットから取り出し、処理したマウスを新しいチャンバーに入れます。マウスを監視して、動く能力を取り戻すまで呼吸していることを確認します。
5. 3日毎に、ポケット厚さゲージを用いて足首関節径を測定して関節径を評価する(図3A)。
6. 3日ごと、関節炎の採点基準により関節炎の重症度を評価する(図3C):0、正常、紅斑および腫脹の証拠はない。1、最も軽度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、眼底または足首関節に限定;2、中等度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、足首から眼底に及ぶ;3、重度の関節炎、紅斑および中等度の腫脹は、足首から中足関節に及ぶ;4、最も重度の関節炎、紅斑および重度の腫脹は、四肢の足首、足および数字、またはアンキローシスを包含する。

5. 関節部の免疫学的染色

1. 共同分離
   1. イソファフルランで麻酔後の子宮頸部脱臼を用いてセクション4でマウスを屠殺する。マウスに70%エタノールを噴霧する。
   2. 後ろ足から皮と筋肉の一部をピンセットとハサミで取り除きます。70%エタノールで関節をスプレーし、ペーパータオルを使用して筋肉の残りの部分を削除します。
   3. RTで2日間4%パラホルムアルデヒドで足首関節を固定し、RTで1ヶ月間10%EDTAで関節を脱灰し、毎週培地を交換します。
   4. 組織をパラフィンに埋め込み、4μmの厚さの組織切片を準備します。
      1. 液体パラフィンの特定のボリュームでマークされた金型に組織を配置します。簡単に冷却します。
      2. 厚さを4μmに設定し、マイクロトームでスライスをカットします。43°Cの水浴でフロートセクション。
      3. セクションをスライドに取り付け、スライドをオーブンのオーブンに2時間2時間置きます。今後の使用のために、-20 °Cでスライドを保存してください。
2. サフラニンOと関節部の高速緑色染色
   メモ:RTでは、次の染色手順を実施しています。
   1. ステップ5.1.4.3のスライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次の洗浄を行います:5分(3x)のキシレン、2分(2x)の100%エタノール、2分の95%エタノール、2分の70%エタノール、3分間の水道水の50%エタノール。
   2. 0.1%の速いグリーン溶液で5分間のグリーン溶液を染色し、10sの1%酢酸でリンス。
   3. 0.1%のサフラニンO染色液で20分間染色します。スライドを2分間95%エタノール(2x)、100%エタノール2分(2x)、キシレンを2分(2x)に浸します。
   4. 組織切片を取り付け、顕微鏡下で組織を観察する。
      注 : 図4Aの代表的な画像を参照してください。
3. 好中球を可視化する免疫体化学的染色
   1. パラフィンの部分を78°Cで2時間焼きます。スライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次のワッシュを行います:15分(2x)のキシレン、5分(2x)の100%エタノール、5分間の95%エタノール、5分間の80%エタノール、3分間の_H2O、3分間のPBS。
      注: この手順の実行中は、スライドを乾かさないで下します。
   2. 浸透性バッファーの 1 滴を加えます。37 °Cの湿度制御トレイにセクションをインキュベートします。
   3. PBSで3分間(3倍)のスライドをすすいでください。組織を直接すすぐいは避けてください。
   4. 圧力ボイラーを使用して熱誘導抗原エピトープの検索を行います。
      1. ラック内にスライドを配置します。取得バッファで満たされた圧力ボイラーにスライドを浸します。
      2. 電子レンジに圧力ボイラーを置きます。電子レンジを600Wに設定し、スライドを10分間加熱します。
      3. 沸騰後、90°Cに冷却するためにボイラー内のスライドを保ちます。スライドを取り出し、PBSで3分間(3倍)すすいでください。
   5. クエンチ内因性ペルオキシダーゼ活性を、RTで_3%H2O2で15分間RTで調製し、PBS中の3分間(3x)のリンススライドを行った。
   6. 疎水性ペンでサンプルの周りに大きな円を輪郭を描き、サンプルに触れないようにします。湿度制御チャンバー内の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を37°Cで60分間ブロックします。
   7. ブロックソリューションを削除します。各セクションに50μLのPBS希釈一次抗体を素早く加える。次いで、湿度制御されたトレイ内のスライドを一晩4°Cでインキュベートする。
      注: 異なる抗体に対しては、異なる希釈率が使用されます(MPO の場合は 1:25、NE の場合は 1:20)。
   8. 2日目にトレイを取り出し、RTに30分間放置します。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。
   9. 50 μLのPBS希釈二次抗体を組織に加える。
      注: MPO の場合は 1:1,000、NE の場合は 1:1,500 という異なる希釈率が適用されました。
   10. 37 °Cの湿度制御トレイで30分間滑り込みます。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。
   11. 希釈3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液で5分間開発。暗い色が生まれた場合は反応に目を光らせておく。蒸留水でスライドをすすいでください。
   12. 10分間ヘマトキシリンのスライドをカウンターステインし、スライドを水道水で5分間リンスします。
   13. 3sの酸性アルコール超高速分化溶液中でリンス。その後、水道水で10分間すすいます。
   14. RTで次のワッシュにスライドを浸す:5分間80%エタノール、5分の95%エタノール、5分間の100%エタノール、15分(2x)のキシレン。取り付けソリューションでカバースリップを修正します。顕微鏡で組織を観察する。
       注 : 図4Bの代表的なイメージを参照してください。

結果

腹膜滲出細胞はマウスの洗浄液から採取した。細胞をRPMI-1640完全培地の1 mLで再懸濁し、2段階(54.8%/70.2%)に重ね合わせた不連続な密度勾配(図1A)、および30分間の1,500 x gで遠心分離し(≥95%、~1 x¹⁰⁷好中球/マウス)下界面から回収した(図1B)。

空...

ディスカッション

末梢血^7、骨髄および組織¹⁸からの高度に精製された好中球の詳細なプロトコルは、長い間利用可能であった。ここでは、成熟した好中球がさらなる抗炎症および抗酸化研究のために不活性化されたままである腹膜液¹⁹から好中球を分離する方法を採用する。

空気ポーチ実験を用い、LPSによる好中球のインビボの浸潤を...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Fast Green Solution	Solarbio	8348b	Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining Solution	Solarbio	8348a	Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0	Sigma	324506	Sterile
100% Ethanol	Beijing Chemical Works
100% Methanol	Beijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube	Falcon	14-959-53A
23 G x 1 1/4" Needle	BD	305120
26 G x 3/8" Needle	BD	305110
3% bovine serum albumin (BSA)			Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2			Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018
30 G x 1/2" Needle	BD	305106
30% H2O2	Beijing Chemical Works
5 mL Syringe	BD	Z683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube	Falcon	14-432-22
50% Ethanol			Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% Percoll			Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% Ethanol			Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% Percoll			Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% Ethanol			Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% Ethanol			Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution	Beyotime	C0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase Antibody	Abcam	ab208670
Anti-Neutrophil Elastase Antibody	Abcam	ab21595
Automatic Hematology Analyzer	Sysmex	XS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/ml	sigma	1002036152
Cover Slip	CITOGLAS	10212432C
Dial Thickness Gauge	Mitutoyo	7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL	Sigma	Z606340
Foetal Bovine Serum (FBS) Premium	PAN	P30-1302
Gas Anesthesia System	ZS Dichuang	ZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	PPLYGEN	C1309	This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Hematoxylin Staining Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit	Solarbio	G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100×	Invitrogen	1514022
Percoll	GE Healthcare	10245207	Density gradient medium
Permeabilization Buffer			Mix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1×			Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10×			Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose Peptone	Oxoid	1865317
Retrieval Buffer			Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHC			Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHC			Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758
RPMI-1640 Complete Medium			RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL	BD	328421
Slide	CITOGLAS	10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP)			Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch Assay			Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
Xylene	Beijing Chemical Works