JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Résumé

Les neutrophiles sont un membre important du système immunitaire inné et jouent un rôle central dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes et les réactions inflammatoires pathologiques. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de cytokines et de chemokines. L’infiltration écrasante des neutrophiles peut mener aux dommages aveugles de tissu, tels que dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les neutrophiles isolés de l’exsudation péritonéale répondent à un chimioattractant défini, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro dans les essais de chambre de Transwell ou de Zigmond. L’expérience de poche d’air peut être employée pour évaluer la chimiotaxis des neutrophiles vers le lipopolysaccharide (LPS) in vivo. Le modèle de souris de l’arthrite adjuvant-induite (AA) est fréquemment employé dans la recherche de RA, et la coloration immunohistochemical des sections articulaires avec des anticorps anti-myeloperoxidase (MPO) ou anti-neutrophile d’élastase (NE) est une méthode bien établie pour mesurer neutrophile infiltration. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Introduction

Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et représentent 50 à 70 % de l’ensemble de la population de globules blancs chez l’homme1. Les neutrophiles sont l’un des principaux intervenants pendant l’inflammation aigue. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de la direction des cytokines et des chimiokines libérées par les cellules de tissu-résident2,3,4, qui est médiée par les interactions entre les molécules d’adhérence cellulaire à la surface des neutrophiles et des cellules endothéliumvasculaires 5. Les neutrophiles sont fondamentaux pour accueillir la défense et jouent un rôle dans les réactions inflammatoires pathologiques en raison de leur capacité puissante à endommager les tissus par la libération d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’autres molécules tissulairesnuisibles 3,6.

Des études antérieures ont décrit plusieurs protocoles d’isolement des neutrophiles de souris ou d’humains. Oh et coll. ont démontré une méthode de séparation de gradient de densité pour isoler les neutrophiles humains du sang humain entier7. Cependant, l’isolement des neutrophiles suffisants du sang de souris est difficile en raison du petit volume sanguin. Alternativement, un grand nombre de neutrophiles purs et viables de souris peuvent être obtenus du fluide péritonéal de souris, et ces neutrophiles purifiés peuvent être employés ex vivo pour examiner plusieurs aspects des fonctions cellulaires ex vivo, y compris l’infiltration de neutrophile, migration, chemotaxis, burstoxydative, cytokine et neutrophil extracellulaire de production (NET)8. Transwell analyse9 ou Zigmond essais de chambre10,11 peut être utilisé pour évaluer la migration neutrophile in vitro. Le modèle de poche d’air est utilisé pour évaluer la migration et l’infiltration des neutrophiles in vivo. Le modèle sous-cutané de poche d’air est un modèle animal in vivo commode pour étudier la migration des cellules inflammatoires.

Traditionnellement, les neutrophiles étaient considérés comme des éliminateurs pathogènes dans les phases aigues de l’inflammation. Cependant, les résultats récents ont prouvé que les neutrophiles sont des cellules compliquées qui exécutent une variété significative de fonctions spécialisées. Neutrophils peuvent réguler de nombreux processus tels que les blessures et la réparation aigus, tumorigenesis, réponse auto-immune, et l’inflammation chronique12,13. Les neutrophiles modulent également les réponses immunitaires adaptatives et peuvent réguler les cellules B et les lymphocytes T14,15. La pénurie substantielle de neutrophiles entraîne la mortalité ou une grave immunodéficience chez l’homme et l’épuisement des neutrophiles chez la souris entraîne une mortalité, tandis qu’une activation ou un recrutement excessif de neutrophiles dans les organes provoque plusieurs maladies immunitaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’érythématatus systémique (SLE)6. Les neutrophiles sont les cellules les plus abondantes dans le liquide synovial des patients atteints de PR. Les neutrophiles produisent des quantités excessives de myeloperoxidase (MPO) et d’élastase de neutrophile (NE) par dégradation, ce qui exacerbe l’érosion du cartilage. MPO est une enzyme peroxidase principalement exprimée dans les granules de neutrophiles16. NE est associé à la destruction du cartilage articulaire17. MPO et NE pourraient être utilisés pour évaluer l’état de la migration des neutrophiles et l’infiltration dans le tissu des patients atteints de PR.

Cet article fournit trois méthodes conventionnelles pour évaluer la migration des neutrophiles normaux induits in vivo et in vitro, aussi bien que l’infiltration des neutrophiles pathologiques dans un modèle d’inflammation joint-spécifique de souris.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Beijing.

REMARQUE : Des souris C57BL/6 (7-8 semaines) ont été employées.

1. Isolement de Neutrophile

  1. Acquisition de cellules exsudatrices péritonéaux
    1. Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction du nombre de souris.
      REMARQUE : Définir le nombre de souris en tant que N, (2N-1) mL de solution doit être dissous et filtré à l’avance.
    2. Vaporiser l’espace de travail avec 70% d’éthanol. Utilisez un injecteur d’insuline pour dessiner 1 ml de solution de peptone et des bulles de décharge.
    3. Effectuer la première injection intrapéritonéale de 1 ml de solution peptone par souris.
      1. Prenez la souris en position tête baissée d’une main. Désinfecter le point d’injection avec des boules de coton imbibées d’alcool.
        REMARQUE : La position d’injection préférée réside dans l’aspect latéral du quadrant inférieur gauche ou droit de l’abdomen.
      2. Infuser les réactifs rapidement. Injecter 1 mL dans la cavité péritonéale de chaque souris avec l’injecteur d’insuline.
        REMARQUE : L’angle entre l’aiguille et la peau doit être d’environ 15 à 30 degrés pour éviter de blesser l’intestin ou d’autres organes.
    4. Laisser la réponse inflammatoire se développer pendant la nuit. Après 12 h, effectuez la deuxième injection de la même manière que la première injection.
    5. Trois heures après la deuxième injection, anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 5 min dans une chambre d’anesthésie gazeuse à une vitesse de 2 L/min. Retirez les souris anesthésiées de la chambre et sacrifiez-les par luxation cervicale.
      REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés.
      REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être traitées dans une hotte de culture tissulaire.
    6. Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol. Poser la souris sur un tampon en plastique stérile et fixer les membres avec des aiguilles.
    7. Utilisez un ensemble stérile d’outils chirurgicaux pour faire une incision horizontale (1 cm) au milieu du bas-ventre. Soulevez la peau du haut de l’abdomen avec des forceps et coupez le long de la ligne médiane de l’abdomen et exposez la paroi péritonéale intacte.
    8. Injecter 5 ml de RPMI-1640 stérile milieu complet dans la cavité abdominale avec une aiguille de 30 G x 1/2 po. Insérez l’aiguille à travers la paroi péritonéale avec le bord bevé de l’aiguille vers le haut et injectez tout le volume.
    9. Secouez le tampon horizontalement pendant 5 min. Massez doucement l’abdomen plusieurs fois.
    10. Injecter une aiguille de 23 G x 1 1/4 po dans l’espace latéral de l’abdomen. Extraire le liquide abdominal (5 ml) et le ramasser dans un tube centrifugeuse de 50 ml.
      REMARQUE : Placez les tubes sur la glace dès que possible en cas d’activation du neutrophile.
    11. Injecter un autre 5 ml de milieu complet et répéter la procédure pour enlever les cellules restantes du péritoine. Mettre en commun le liquide péritonéal dans le tube de centrifugeuse de 50 ml.
    12. Centrifuger le liquide péritonéal mis en commun à 400 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
    13. Jetez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de RPMI-1640 milieu complet.
      REMARQUE : Ne pas vortex pour éviter l’activation de neutrophiles.
  2. Isolement des neutrophiles
    1. Ajouter 4 ml de milieu de gradient de densité fraîchement préparé de 70,2 % (p. ex., Percoll) dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
    2. Recouvrez soigneusement 4 ml de milieu de gradient de densité fraîchement préparé de 54,8 % sur le milieu de gradient de densité de 70,2 % lentement le long du bord du tube avec des pointes pointues de pipette dans le tube de centrifugeuse de 15 ml.
      REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de perturber l’interface entre le milieu de gradient de densité de 54,8 % et le milieu de gradient de densité de 70,2 %.
    3. Superposez soigneusement la suspension péritonéale de 1 ml sur la couche moyenne de gradient de densité de 54,8 % lentement avec des pointes pointues de pipette (Figure 1A).
      REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de perturber l’interface entre la suspension cellulaire et le milieu de gradient de densité de 54,8 %.
    4. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 30 min à 22 oC sans freinage.
    5. Recueillir les neutrophiles à l’interface du milieu de gradient de densité de 54,8 % et les couches moyennes de gradient de densité de 70,2 % (figure 1B) jusqu’à un nouveau tube.
    6. Ajouter 1 ml de RPMI-1640 milieu complet aux cellules recueillies et soigneusement resuspendre les cellules en pipetting doucement plusieurs fois. Centrifugeuse à 100 x g pendant 10 min à RT et retirez soigneusement le supernatant.
    7. Répétez l’étape de lavage (étape 1.2.6) une fois.
    8. Ajouter 0,5 ml de milieu de culture à la pastille et resuspendre les cellules en tapotage doucement plusieurs fois. Prenez un aliquot de 50 L pour compter les cellules à l’aide d’un analyseur d’hématologie automatique.

2. Neutrophile migration d’assay

  1. Mesurer la migration des neutrophiles partranswell 9 ou Zigmond chambre d’assay comme décrit précédemment10,11.

3. Air pouch assay

  1. Première injection d’air
    1. Le jour 0, anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 3 min dans une chambre d’anesthésie gazeuse à une vitesse de 2 L/min, et maintenir l’anesthésie de chaque souris dans une seule unité respiratoire avec 2% d’isoflurane à une vitesse de 0,5 L/min.
      REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés.
    2. Utilisez un filtre de 0,22 m fixé à une seringue de 5 ml pour obtenir un volume d’air stérilisé de 3 ml.
    3. Soulevez la peau arrière de la souris anesthésiée à l’aide d’une pince à épiler et injectez sous-cutanée 3 ml d’air stérilisé à l’aide d’une aiguille de 26 G x 3/8 po.
    4. Après le traitement, retirer les souris de l’unité respiratoire. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles sont vivantes jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer.
  2. Deuxième injection d’air
    1. Le jour 3, injectez 3 ml d’air stérilisé de plus dans la poche d’air précédemment établie pour soutenir la poche d’air décrite à la section 3.1.
  3. Traitement
    1. Le jour 6, 6 h avant le sacrifice, injectez différents traitements dans la poche d’air. Injecter 1 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS) comme un contrôle négatif. Injecter 1 ml de 1 G/mL LPS comme le contrôle positif pour induire l’inflammation locale.
    2. Anesthésier entièrement les souris avec 5% d’isoflurane pendant 3 min dans une chambre d’anesthésie à gaz à une vitesse de 2 L/min, et maintenir l’anesthésie de chaque souris dans une seule unité respiratoire avec 2% d’isoflurane à une vitesse de 0,5 L/min. Préparer tampon de lavage selon le tableau des matériaux.
      REMARQUE : Une profondeur suffisante de l’anesthésie est assurée en pinçant les orteils avant de déplacer les souris de la chambre à l’unité respiratoire unique. Les jambes ne doivent pas bouger lorsque les orteils sont pincés.
    3. Pour chaque sachet d’air, laver la poche d’air avec 1 ml de tampon de lavage et recueillir l’exsudat inflammatoire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Laver la poche d’air avec 2 ml de tampon de lavage 2x et recueillir l’exsudat inflammatoire dans le même tube de centrifugeuse.
    4. Centrifugeuse à 100 x g pendant 10 min à RT. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon de lavage. Compter les cellules pour quantifier le rapport neutrophile à l’aide de l’analyseur d’hématologie automatique.
      REMARQUE : Voir les résultats représentatifs à la figure 2.

4. Induction du modèle de souris adjuvant-induite (AA) de souris

  1. Suspendre l’adjuvant complet de Freund (CFA) en vortexant au moins 5 s, puis tirer 100 l de suspension dans un injecteur d’insuline.
    REMARQUE : Nous vous recommandons d’utiliser un CFA complètement nouveau dans des expériences pour assurer la stérilité.
  2. Anesthésiez les souris telles que décrites à l’étape 3.1.1.
  3. Marquez la patte choisie et injectez 20 ll de CFA dans l’espace articulaire de la cheville. Injecter 20 ll de suspension en quatre taches périarticulaires sur la patte choisie (80 l au total).
  4. Retirez les souris de l’unité respiratoire et mettez les souris traitées dans une nouvelle chambre. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles respirent jusqu’à ce qu’elles retrouvent la capacité de se déplacer.
  5. Tous les 3 jours, évaluez le diamètre de l’articulation en mesurant le diamètre de l’articulation de la cheville à l’aide d’une jauge d’épaisseur de poche (Figure 3A).
  6. Tous les 3 jours, évaluer la gravité de l’arthrite selon le critère de notation de l’arthrite (figure 3C) : 0, normal, aucune preuve d’érythème et de gonflement; 1, l’arthrite la plus douce, l’érythème et l’enflure douce confinées aux goudrons ou à l’articulation de cheville ; 2, arthrite modérée, érythème et gonflement doux s’étendant de la cheville aux tarsales ; 3, arthrite grave, érythème et gonflement modéré s’étendant de la cheville aux joints métatarsiaux ; 4, l’arthrite la plus grave, l’érythème et l’enflure grave englobent la cheville, le pied et les chiffres, ou l’ankylose du membre.

5. coloration immunohistochimique des sections articulaires

  1. Isolement conjoint
    1. Sacrifiez la souris dans la section 4 en utilisant la dislocation cervicale après anesthésie avec l’isoflurane. Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol.
    2. Retirer la peau et une partie du muscle de la patte postérieure à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux. Vaporiser l’articulation avec 70% d’éthanol et enlever le reste des muscles à l’aide d’un essuie-tout.
    3. Fixez l’articulation de la cheville dans 4% de paraformaldéhyde pendant 2 jours à RT. Décalcifier l’articulation dans 10% EDTA pendant 1 mois à RT et changer le moyen hebdomadaire.
    4. Enclenchez le tissu dans la paraffine et préparez des sections de tissu de 4 m d’épaisseur.
      1. Placer le tissu dans un moule marqué avec un certain volume de paraffine liquide. Refroidir brièvement.
      2. Fixer l’épaisseur à 4 m et couper les tranches sur un microtome. Sections de flotteur dans un bain d’eau de 43 oC.
      3. Monter les sections sur des toboggans et les mettre dans le four à 70 oC pendant 2 h. Pour une utilisation future, conservez les toboggans à -20 oC.
  2. Safranin O et coloration verte rapide des sections communes
    REMARQUE : Les étapes de coloration suivantes sont effectuées à RT.
    1. Placez les glissières de l’étape 5.1.4.3 dans un rack et effectuez les lavages suivants pour se réhydrater à RT : xylène pour 5 min (3x), 100% éthanol pour 2 min (2x), 95% d’éthanol pour 2 min (2x), 70% d’éthanol pour 2 min, et 50% d’éthanol pour 15 min. Laver dans l’eau courante du robinet pendant 3 min.
    2. Tache dans la solution verte rapide de 0.1% pendant 5 min. Rincer dans 1% acide acétique pendant 10 s.
    3. Tache dans la solution de coloration safranine O de 0,1 % pendant 20 min. Immerger les lames dans les lavages suivants : 95 % d’éthanol pour 2 min (2x), 100 % d’éthanol pour 2 min (2x) et xylène pendant 2 min (2x).
    4. Montez les sections de tissu et observez les tissus au microscope.
      REMARQUE : Voir les images représentatives dans la figure 4A.
  3. Coloration immunohistochimique pour visualiser les neutrophiles
    1. Cuire les sections de paraffine pendant 2 h à 78 oC. Placez les lames dans une grille et effectuez les lavages suivants pour les réhydrater à RT : xylène pendant 15 min (2x), 100 % d’éthanol pour 5 min (2x), 95 % d’éthanol pour 5 min, 80 % d’éthanol pour 5 min, H2O pour 3 min et PBS pendant 3 min.
      REMARQUE : Ne laissez pas sécher les glissières à tout moment pendant cette étape.
    2. Ajouter une goutte de tampon de perméabilisation pour couvrir le tissu. Incuber les sections dans un plateau à humidité contrôlée à 37 oC.
    3. Rincer les diapositives en PBS pendant 3 min (3x). Évitez de rincer directement le tissu.
    4. Effectuer la récupération d’épitope d’antigène induite par la chaleur à l’aide d’une chaudière à pression.
      1. Disposer les glissières dans un rack. Immerger les glissières dans la chaudière à pression remplie d’un tampon de récupération.
      2. Mettre la chaudière à pression sur un four à micro-ondes. Placez le four à micro-ondes à 600 W et chauffez les lames pendant 10 min.
      3. Après l’ébullition, garder les glissières dans la chaudière pour les refroidir jusqu’à 90 oC. Sortez les diapositives et rincez-les en PBS pendant 3 min (3x).
    5. Éteind l’activité endogène peroxidase dans les 3% H2O 2 fraîchementpréparés à RT pendant 15 min. Rincer les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
    6. Décrivez un grand cercle autour de l’échantillon avec un stylo hydrophobe, évitez de toucher l’échantillon. Bloquer avec 3% d’albumine de sérum bovin (BSA) dans une chambre à humidité contrôlée à 37 oC pendant 60 min.
    7. Supprimer la solution de blocage. Ajouter rapidement 50 oL d’anticorps primaires dilués PBS à chaque section. Ensuite, incuber les toboggans dans un plateau à humidité contrôlée à 4 oC pendant la nuit.
      REMARQUE : Différents rapports de dilution sont utilisés pour différents anticorps (1:25 pour LE MPO et 1:20 pour NE).
    8. Le deuxième jour, sortir le plateau et laisser reposer à RT pendant 30 min. Ensuite, rincez les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
    9. Ajouter 50 L d’anticorps secondaires dilués par PBS dans le tissu.
      REMARQUE : Différents ratios de dilution ont été appliqués : 1:1 000 pour MPO et 1:1,500 pour NE.
    10. Incuber les toboggans dans un plateau à humidité contrôlée à 37 oC pendant 30 min. Ensuite, rincez les diapositives en PBS pendant 3 min (3x).
    11. Développer en dilué 3,3'-diaminobenzidine (DAB) solution pendant 5 min. Gardez un œil sur la réaction en cas de développement d’une couleur foncée. Rincer les lames dans de l’eau distillée.
    12. Counterstain les diapositives dans l’hématoxyline pendant 10 s. Rincer les diapositives dans l’eau du robinet pendant 5 min.
    13. Rincer à l’alcool acide solution de différenciation superrapide pour 3 s. Rincer ensuite à l’eau du robinet pendant 10 min.
    14. Immerger les diapositives dans les lavages suivants à RT : 80 % d’éthanol pour 5 min, 95 % d’éthanol pour 5 min, 100 % d’éthanol pour 5 min et xylène pendant 15 min (2x). Fixez le bordereau de couverture avec la solution de montage. Observez le tissu au microscope.
      REMARQUE: Voir les images représentatives dans la figure 4B.

Résultats

Des cellules d’exsudat péritonéal ont été rassemblées du fluide de lavage des souris. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu complet RPMI-1640, superposées sur une double étape (54,8 %/70,2 %) gradient de densité discontinu (Figure 1A), et centrifugé à 1 500 x g pendant 30 min. Les neutrophiles (95 %, 1 x 107 neutrophiles/souris) ont été récupérés à partir de l’interface infér...

Discussion

Des protocoles détaillés de neutrophiles hautement purifiés provenant du sang périphérique7, de la moelle osseuse et des tissus18 sont disponibles depuis longtemps. Ici nous adoptons une méthode d’isoler des neutrophiles du fluide péritonéal19 dans lequel les neutrophiles mûrs restent inactivés pour d’autres études anti-inflammatoires et antioxydantes.

Nous avons utilisé l’expérience de poche d’air pou...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 81430099 et 31500704), international Cooperation and Exchange Projects (numéro de subvention 2014DFA32950), et le programme de recherche de l’Université de médecine chinoise de Beijing ( numéros de subvention BUCM-2019-JCRC006 et 2019-JYB-TD013).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% Fast Green SolutionSolarbio8348bTransfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.1% Safranin O Staining SolutionSolarbio8348aTransfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0Sigma324506Sterile
100% EthanolBeijing Chemical Works
100% MethanolBeijing Chemical Works
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge TubeFalcon14-959-53A
23 G x 1 1/4" NeedleBD305120
26 G x 3/8" NeedleBD305110
3% bovine serum albumin (BSA)Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS
3% H2O2Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kitZSGB-BIOZLI-9018
30 G x 1/2" NeedleBD305106
30% H2O2Beijing Chemical Works
5 mL SyringeBDZ683574
50 mL Conical Polypropylene Centrifuge TubeFalcon14-432-22
50% EthanolMix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O
54.8% PercollMix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS, stand still
70% EthanolMix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O
70.2% PercollMix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS, stand still
80% EthanolMix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O
95% EthanolMix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiation SolutionBeyotimeC0165S
ANTIBODIES
Anti-Myeloperoxidase AntibodyAbcamab208670
Anti-Neutrophil Elastase AntibodyAbcamab21595
Automatic Hematology AnalyzerSysmexXS-800i
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR0332-100G
Complete Freund's Adjuvant, 10 mg/mlsigma1002036152
Cover SlipCITOGLAS10212432C
Dial Thickness GaugeMitutoyo7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mLSigmaZ606340
Foetal Bovine Serum (FBS) PremiumPANP30-1302
Gas Anesthesia SystemZS DichuangZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)PPLYGENC1309This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1ASterile
Hematoxylin Staining SolutionZSGB-BIOZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL3012
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain KitSolarbioG1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)Sigma47729
Penicillin Streptomycin Solution, 100×Invitrogen1514022
PercollGE Healthcare10245207Density gradient medium
Permeabilization BufferMix 100 μL Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1×Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10×PBS, autoclaved
Phosphate Buffer Saline (PBS), 10×Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
POWDER
Proteose PeptoneOxoid1865317
Retrieval BufferMix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0
Retrieval Buffer A Stock for IHCDissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7·H2O) in 200 mL dH2O
Retrieval Buffer B Stock for IHCDissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758
RPMI-1640 Complete MediumRPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mLBD328421
SlideCITOGLAS10127105P-G
SOLUTION
Stock Isotonic Percoll (SIP)Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10×PBS, stand still for 20 min
Wash Buffer in Air Pouch AssayDilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS
XyleneBeijing Chemical Works

Références

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

BiologieNum ro 156neutrophilemigrationarthriteimmunohistochimiepoin on d airchimiotaxie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.