从产后小鼠小脑中纯化Promin-1+干细胞

摘要

这里演示的是一种高效且经济高效的方法，用于从产后小鼠小脑中纯化、培养和分化白质干细胞。

摘要

大多数小脑神经元产生于两个胚胎干细胞利基:一个红唇壁，它产生所有的小脑外皮谷类神经元，和一个心室区利基，它产生抑制性GABAergic Purkinje细胞，这是构成深小脑核和伯格曼胶质的神经元。最近，第三个干细胞利基被描述为从心室区利基的继发生殖区。这种利基的细胞由细胞表面标记素-1定义，并定位为产后小脑的白质。这个利基占晚期出生的分子层GABAergic间神经元以及产后生成的小脑星细胞。除了他们的发育作用，这个利基正在获得翻译的重要性，其参与神经退化和肿瘤发生。由于缺乏有效的纯化技术，这些细胞的生物学一直难以破译。这里演示的是净化、培养和分化这些产后小脑干细胞的有效方法。

引言

小脑长期以来一直被认为是协调自愿运动的主要神经元回路^1。它接收来自神经轴的宽条输入，包括来自外围的感知信息，从而微调电机输出和协调运动。最近，它还被牵连到通过可能使用类似的信息处理网络^{22，3，43,4}来调节认知和情感。

成人小脑由外小脑皮层和内白质组成。在这些结构内穿插的是深内回核。与神经系统的其他部分类似，小脑的发展是由多能祖细胞（干细胞）的增殖推动的，这些细胞迁移并分化以产生这种组织良好的结构。在早期发育（E10.5_E13.5）中，围绕发育的第四个心室的心室干细胞利基产生GABAergic神经元（即珀金耶细胞、卢加罗细胞、高尔基细胞）以及伯格曼利亚^{55、6、7、8。6,7,8}

在发育后期（产后第一周），红唇中的第二个干细胞利基产生MATH1和内丁表达的祖体，产生兴奋颗粒神经元^9,109，10，11，12。^,11,12最近，第三个干细胞利基被描述^13。这些细胞表达prominin-1（也称为CD133），一种膜覆盖的糖蛋白，定义肠道和造血系统14、15、16的干细胞子集。^14,15,16体内命运图显示，这些干细胞在前三个产后周内产生关键的分子层间神经元（即篮子细胞和斯特拉特细胞）以及星细胞。过去，在体外研究这些细胞是很困难的，因为先前的方法需要昂贵且耗时的技术（即荧光激活细胞分拣[FACS]），这些技术依赖于promin-1染色12、13、17。^12,13,17该协议描述了一种基于免疫磁性的方法，用于分离这些干细胞，然后可以很容易地培养和分化。

研究方案

所有动物实验都符合NIH的《实验室动物护理和使用指南》（2011年），并经西北大学IACUC（IS00011368议定书）批准。

1. 准备解决方案

1. 制备由无菌酚类红含量Dulbecco的磷缓冲盐水（DPBS）制成的组织分离溶液，包括木瓜素（100 U/ml）、半胱氨酸（0.2毫克/毫升）和DNase（250 U/ml）。
2. 制备DNase溶液稀释100毫克的DNase I（一瓶）的嗜血粉在50 mL的H₂O.混合良好，并过滤库存溶液。准备 10 mL 股票等号。将一个库存管划分为 0.5 mL 单次使用等号。将这些单次使用等号储存在-80°C。
3. 制备磁柱缓冲液X:0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA溶液，制备磁分离试剂。
4. 要制备神经球体介质，请使用含有青霉素/链霉素的神经底质与L-谷氨酰胺，并补充2%B27，20 ng/mL人类重组表皮生长因子（EGF），和20 ng/mL人类重组基本纤维细胞生长因子（bFGF）。
5. 要制备分化介质，请使用神经基础介质，并补充10纳克/mL分化因子血小板衍生生长因子（PDGF-AA）或10纳克/mL白血病抑制因子（LIF）和2%B27。
6. 使用超低附件 12 孔 （3.5 厘米²） 和 6 孔 （9.6 厘米²） 培养板。

2. 小脑剖面

1. 用同一个麻醉小鼠小狗（ P3 - P7 ），并用手术剪刀斩首。
2. 用70%乙醇喷洒分离的小狗头部。
3. 将每头转移到一个空无菌的10厘米培养皿中。使用微切切剪刀分离皮肤，然后沿着中线运行剪刀下垂来去除头骨。
4. 使用#7钳子，从脑干中开始剥下头骨。使用铲子小心地抬起大脑，保持小脑完好无损，并将大脑转移到一个新鲜的无菌10.0厘米的盘子中，含有15 mL的冰冷汉克斯平衡盐溶液（HBSS）溶液。
5. 将包含大脑的盘子放在解剖显微镜下。使用精细的#5钳，从小脑中取出脑和大型血管，并使用铲子将小脑从脑干中分离出来。
6. 将小脑转移到含有5.0 mL冰冷HBSS溶液的15 mL离心管中。用 5.0 mL 的 HBSS 冲洗和除掉 3x 来清洗小脑。
   注:每个小脑应放置在自己的管进一步处理。

3. 细胞悬浮制剂

1. 最后冲洗后，加入5 mL的木瓜素组织分离溶液（基于以前的工作^{13，18），}已预热至37°C。^13,在水浴中，在37°C下孵育组织15分钟。使用螺母混合器或手动将管上下反转 3x-5x，缓慢混合内容。
2. 准备一个宽直径（普通玻璃移液器）和窄直径巴斯德移液器（通过加热在Bunsen燃烧器上加热进行抛光），如前所述^的19。
3. 用 5 mL 的 HBSS 溶液清洗组织 3x，避免在用手破坏时失去组织。
4. 取出最后一次 HBSS 洗涤，并在组织中加入 5 mL DPBS 溶液，其中含有 250 μL 的 DNase 溶液。使用宽直径巴斯德移液器三分10倍至15倍，分离组织。轻轻地执行此步骤，以避免气泡的形成。
5. 然后在水浴中以37°C孵育泥浆10分钟，通过倒置和拉直管混合。
6. 使用直径缩小的巴斯德移液器进一步三分组织浆料 10 倍。如果仍有大块组织，用移液器尖端轻轻按压管底部的纸巾，然后继续移液，直到细胞达到细悬浮液。
7. 在37°C下孵育组织10分钟，重复以前的混合步骤。

4. 干细胞免疫标签

1. 将离心机管放在冰上，并在接下来的步骤中使用冰冷溶液。通过40μm细胞滤网将分离的细胞应变到50mL离心管中。使用 10.0 mL 的 HBSS 解决方案在过滤器顶部，以确保细胞通过此附加解决方案中的网格。
2. 将过滤的电池转移到新鲜的15 mL离心管中，在4°C下以300 x g将电池悬浮液离心10分钟。小心使用真空吸气器吸气并完全丢弃上清剂。
3. 在160μL的磁柱缓冲液中重新悬浮颗粒。要在磁标前获得单细胞悬浮液，通过 30 μm 尼龙网通过细胞来去除细胞团块，否则会堵塞柱子。
4. 在每个15 mL管中加入40μL的抗promin-1微珠，在冰箱中混合和孵育15分钟，以便抗体与promin-1表达细胞结合。
5. 通过加入1.0~2.0 mL的柱缓冲器X和300 x g的离心机清洗细胞10分钟。
6. 在柱形缓冲器 X 的 1.0 mL 中重新悬浮颗粒。
   注:如果在用1.0 mL柱缓冲器X重新悬浮颗粒后看到小团块，则应使用巴斯德移液器的尖端小心去除它们，否则这些团块可以在细胞分拣过程中阻塞磁柱。

5. 磁柱制备、细胞分拣和电镀

注:必须同时执行不同基因型条件（疾病与控制）的磁分离，因为任何延迟都可能影响神经球形态。

1. 通过将磁柱放置在暴露于磁场的磁支架上，准备磁柱。使用 500 μL 缓冲液 X 冲洗一次，将滴入离心机管中的缓冲液进行丢弃。
   注:为每个实验准备新鲜的磁柱缓冲器X;如果不是，那么干细胞产量将很低。
2. 将标记的细胞悬架应用于列。收集包含未标记的细胞的流道，这些细胞主要由小脑神经元/胶质混合细胞组成新鲜的15 mL管（图1A）。
3. 用 500 μL 的缓冲器 X 清洗柱 3x（每次洗涤大约需要 2⁄4 分钟）。
   注:富含小脑颗粒神经元的小脑神经元/胶质混合培养物可以作为这种纯化步骤的有用副产品。
4. 从磁场中取出柱，放入 1.5 mL 管中。将1.0 mL培养介质（神经球介质）添加到柱中，并将柱塞推入柱中，将标有promin-1珠子的细胞冲出一个新的1.5 mL猎鹰管中。
5. 为了提高prominin-1标记细胞的纯度，按照步骤5.1_5.4将洗脱的细胞传递给第二列。
6. 用血细胞计对细胞进行计数。典型的产量是每小脑10⁷个细胞。根据下游实验所需的密度，将细胞板板板板板（6 或 12 孔）板。

6. 神经球和分化的传递

1. 在神经球介质（5，000个细胞/井）的超低附着12孔板上对promin-1标记的干细胞进行板子。
2. 7-10天后，细胞分裂以产生球形浮动神经球（原发神经球）。
   注:在这个实验中，在数量上扩大的次神经球被生成供进一步使用。初级神经球群不用于这些实验，因为它们可能包含污染细胞，这些细胞没有干细胞特性，并且可以与神经球团合在一起。
3. 对于传路，使用1.0 mL移液器尖端将主神经球与培养介质一起转移到15 mL无菌离心管。在300 x g的离心下将神经球圈中丸5分钟，并丢弃上清液。
4. 在含有帕辛或0.05%胰蛋白溶液的组织分离介质中重新悬浮颗粒。在37°C孵育10分钟。
5. 将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。将细胞悬浮在神经球介质5mL中，并用塑料巴斯德移液器机械分离细胞，缓慢上下移液10倍。
6. 如前面所述，在神经球介质中对细胞（再次）进行板盘。在培养7~10天后，该板应富含继发性神经球。
   注:这些培养物可以通过高达8倍具有良好的效率，之后神经球的大小往往较小，暗示增殖减少。
7. 在血细胞计上计数细胞，并针对未来在多D-Lyine涂层板（6 或12孔）上进行实验，将细胞作为最佳数量。
8. 要分化干细胞，除向颗粒添加分化介质外，通过离心收集神经球从第二通道到第八通道。
   注:经过7天的体外，干细胞分化成神经元、星细胞和寡核细胞，通过用神经元标记β-III图布林、星形标记GFAP和寡核糖体制造者O4染色来证明。

结果

Prominin-1阳性产后小脑干细胞在神经球介质中形成神经球，富含生长因子（EGF和bFGF）。这些神经球对promin-1染色呈阳性，这是用于分离的标记，也是其他干细胞标记物（如内丁和GFAP^13）的污渍（图1）。干细胞标记表达在整个培养过程中保持，最多8个通道^20。当退出生长因子时，在LIF和PDGF-AA（支持神经元和胶质分化^21，22

讨论

在产后生命的前3周，Prominin-1表达的小脑干细胞存在于潜在的白质中。它们的增殖受到由Purkinje细胞¹⁷支持的声波刺猪通路的严格控制。这些干细胞/祖细胞有助于后来出生的GABAergic间神经元，称为篮子细胞和斯特拉特细胞。这些间神经元存在于分子层中，它们突触到Purkinje细胞上，并通过GABAergic抑制^{13、17、2317,}雕刻PC地形¹³和功?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05%Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25300054	0.05%
2% B27	Gibco; Thermo Fisher Scientific	17504001
2 mM EDTA solution	Corning	46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads	Miltenyi Biote	130-092-333
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
Column MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Culture plates ultra - low attachment	Corning	3473
Cysteine	Sigma	C7880
DNase	Sigma	D4513-1VL	250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline	Thermo Fisher Scientific	14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS	Gibco	14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor	Promega	G507A	20 ng/mL
Human recombinant Epidermal Growth Factor	Promega	G502A	20 ng/mL
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158
l-glutamine	Gibco	25030081
Microscopy	Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
Mouse anti-Prominin-1	Affymetrix eBioscience	14-1331	1 in 100
Nestin	Abcam	ab27952	1 in 200
Neurobasal medium	Thermo Fisher	25030081
O4	Millopore	MAB345
Papain	Worthington	LS003126	(100 U/mL)
Platelet- Derived Growth Factor	Sigma	H8291	10 ng/mL
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Rabbit anti-tubulin, b-III	Sigma	T2200	1 in 500
Rabit anti-GFAP	Dako	Z0334	1 in 500
Separation columns-MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Sterile cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 μm