Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

Resumen

Aquí se muestra un método eficiente y rentable para purificar, cultivar y diferenciar las células madre de la materia blanca del cerebelo del ratón postnatal.

Resumen

La mayoría de las neuronas cerebelosas surgen de dos nichos de tallo embrionario: un nicho de labio rombio, que genera todas las neuronas glutamatérgicas excitatorias cerebelosas, y un nicho de zona ventricular, que genera las células purines gecolégicas inhibitorias, que son neuronas que constituyen los núcleos cerebelosares profundos y Bergman glia. Recientemente, se ha descrito un tercer nicho de células madre que surge como una zona germinal secundaria del nicho de la zona ventricular. Las células de este nicho se definen por el marcador de superficie celular prominina-1 y se localizan a la materia blanca en desarrollo del cerebelo postnatal. Este nicho representa la capa molecular de nacimiento tardío interneuronas GABAérgicas junto con astrocitos cerebelos generados posnatalmente. Además de su papel de desarrollo, este nicho está ganando importancia traslacional en cuanto a su participación en la neurodegeneración y la tumorigenesis. La biología de estas células ha sido difícil de descifrar debido a la falta de técnicas eficientes para su purificación. Aquí se muestran métodos eficientes para purificar, cultivar y diferenciar estas células madre cerebelosas posnatales.

Introducción

El cerebelo ha sido reconocido durante mucho tiempo como un circuito neuronal importante que coordina el movimiento voluntario¹. Recibe la entrada de las amplias franjas de la neuroeje, que incluye información proprioceptiva de la periferia, con el fin de afinar la salida del motor y coordinar el movimiento. Más recientemente, también se ha implicado en la regulación de la cognición y las emociones mediante el uso potencial de redes de procesamiento de información similares^2,3,4.

El cerebelo adulto se compone de una corteza cerebelosa externa y materia blanca interna. Intercalados dentro de estas estructuras son núcleos intracentesis retorcedos profundos. Al igual que el resto del sistema nervioso, el desarrollo del cerebelo es impulsado por la proliferación de células progenitoras multipotentes (células madre) que migran y se diferencian para producir esta estructura bien organizada. En desarrollo temprano (E10.5–E13.5), un nicho de tallo ventricular alrededor del cuarto ventrículo en desarrollo genera neuronas GABAérgicas (es decir, células Purkinje, células Lugaro, células Golgi) junto con Bergmann glia^5,,6,7,8.

Más tarde en desarrollo (semana postnatal uno), un segundo nicho de células madre en el labio rombico genera progenitores QUE expresan MATH1- y Nestin que dan lugar a neuronas de gránulos excitatorios^{99,10,,11,,12.} Recientemente se ha descrito un tercer nicho de células madre¹³. Estas células expresan prominina-1 (también conocida como CD133), una glicoproteína que abarca membranas y define un subconjunto de células madre en el intestino y los sistemas hematopoyéticos^14,,15,,16. El mapeo del destino in vivo muestra que estas células madre generan interneuronas clave de capa molecular (es decir, células de cesta y células estelares), junto con astrocitos, durante las tres primeras semanas postnatales. En el pasado, ha sido difícil estudiar estas células in vitro porque los métodos anteriores han requerido técnicas costosas y que consumen mucho tiempo (es decir, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) que dependen de la tinción de prominina-1^12,13,17. Este protocolo describe un método basado en inmunomagnética para el aislamiento de estas células madre que luego se puede cultivar y diferenciar fácilmente.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2011) y fueron aprobados por la Universidad Northwestern IACUC (Protocolo IS00011368).

1. Preparación de soluciones

1. Preparar la solución de disociación tisular hecha de solución salina tamponada de fosfato de fenol estéril que contiene el fenol (DPBS) con papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) y DNase (250 U/ml).
2. Para preparar la solución de DNase diluir 100 mg del polvo liofilizado de DNase I (una botella) en 50 ml de H₂O. Mezclar bien y filtrar la solución en stock. Prepare alícuotas de stock de 10 ml. Divida un tubo de material en alícuotas de un solo uso de 0,5 ml. Almacene estas alícuotas de un solo uso a -80 oC.
3. Preparar reactivos de separación magnética mediante la preparación del búfer magnético de columna X: 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y solución EDTA de 2 mM.
4. Para preparar los medios de neurosfera, utilice un medio neurobasal que contenga penicilina/estreptomicina con L-glutamina y suplemento con 2% B27, 20 ng/ml factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF), y 20 ng/ml factor de crecimiento básico de fibroblastos humano recombinante (bFGF).
5. Para preparar medios de diferenciación, utilice el medio neurobasal y suplemente con factor diferenciado de 10 ng/ml factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) o factor inhibitorio de leucemia de 10 ng/ml (LIF) y 2% B27.
6. Utilice placas de cultivo de unión ultrabaja de 12 pocillos (3,5 cm²⁾y 6 placas de cultivo (9,6 cm^2).

2. Disección de Cerebellum

1. Anestetizar cachorros de ratón (P3-P7) con isoflurano y decapitar usando tijeras quirúrgicas.
2. Rocíe la cabeza separada de los cachorros con 70% de etanol.
3. Transfiera cada cabeza a un plato de cultivo estéril vacío de 10 cm. Separe la piel usando las tijeras de microdisección, luego retire el cráneo ejecutando las tijeras sagital a lo largo de la línea media.
4. Usando #7 fórceps, despegue los huesos del cráneo comenzando caudalmente desde el tronco encefálico. Levante cuidadosamente el cerebro con una espátula, manteniendo el cerebelo intacto, y transfiera el cerebro a un plato fresco estéril de 10,0 cm que contiene 15 ml de solución de solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks helada.
5. Coloque el plato que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección. Usando #5 fórceps finos, retire las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo y separe el cerebelo del tronco encefálico usando la espátula.
6. Transfiera el cerebelo a un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 5,0 ml de solución HBSS helada. Lavar el cerebelo enrredado y decantar 3 veces con 5,0 ml de HBSS.
   NOTA: Cada cerebelo debe colocarse en su propio tubo para su posterior procesamiento.

3. Preparación de la suspensión celular

1. Después del último enjuague, añadir 5 ml de solución de disociación de tejido a base de papaína (basada en trabajos anteriores^13,,18) que se haya precalentado a 37 oC. Incubar el tejido durante 15 min a 37 oC en un baño de agua. Mezcle lentamente el contenido invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo 3 veces cada 3 minutos, ya sea utilizando un mezclador de nueces o a mano.
2. Prepare una pipeta Pasteur de diámetro ancho (pipeta de vidrio regular) y de diámetro estrecho (pulida al fuego calentando sobre un quemador Bunsen) como se describió anteriormente^19.
3. Lavar el tejido 3x con 5 ml de solución de HBSS, evitando la pérdida del tejido mientras se decanta a mano.
4. Retire el último lavado de HBSS y agregue 5 ml de solución DPBS que contenga 250 ml de solución de DNase al tejido. Disociar el tejido triturando 10x–15x usando la pipeta Pasteur de diámetro ancho. Realice este paso suavemente para evitar la formación de burbujas.
5. A continuación, incubar la suspensión durante 10 minutos adicionales a 37 oC en el baño de agua, mezclando invirtiendo y enderezando el tubo.
6. Utilice la pipeta Pasteur de diámetro reducido para triturar aún más la suspensión de tejido 10x. Si quedan trozos grandes de tejido, presione las piezas de tejido contra la parte inferior del tubo con la punta de la pipeta suavemente y continúe pipeteando hasta que las células alcancen una suspensión fina.
7. Incubar el tejido a 37oC durante 10 min adicionales, repitiendo los pasos de mezcla anteriores.

4. Inmunoetiquetado de células madre

1. Coloque los tubos centrífugos sobre hielo y utilice soluciones heladas para los siguientes pasos. Colar las células disociadas a través de un colador de células de 40 m en un tubo centrífugo de 50 ml. Cubra el filtro con 10,0 ml de solución HBSS para asegurarse de que las celdas pasan a través de la malla en esta solución adicional.
2. Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga fresco de 15 ml y centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 oC. Aspirar y desechar el sobrenadante completamente usando cuidadosamente un aspirador de vacío.
3. Resuspenda el pellet en 160 ml de búfer de columna magnética. Para obtener la suspensión de una sola célula antes del etiquetado magnético, pase las células a través de una malla de nylon de 30 m para eliminar los grumos celulares, que de lo contrario pueden obstruir la columna.
4. Añadir 40 ml de microperlas antiprominina-1 a cada tubo de 15 ml, mezclar e incubar en un refrigerador durante 15 minutos para que el anticuerpo se una a las células que expresan prominina-1.
5. Lave las células agregando 1.0–2.0 mL de tampón de columna X y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Apiratee completamente el sobrenadante.
6. Resuspenda el pellet en 1,0 ml del búfer de columna X.
   NOTA: Si se observan pequeños grumos después de la resuspensión de pellets con 1,0 ml de búfer de columna X, deben retirarse cuidadosamente utilizando una punta de la pipeta Pasteur, de lo contrario estos grumos pueden bloquear la columna magnética durante la clasificación celular.

5. Preparación de columnas magnéticas, clasificación de celdas y chapado

NOTA: La separación magnética de diferentes condiciones de genotipo (enfermedad frente a control) debe realizarse al mismo tiempo, ya que cualquier retraso puede afectar a la morfología de la neuroesfera.

1. Prepare las columnas magnéticas colocándolas en el soporte magnético expuesto al campo magnético. Enjuague la columna una vez con 500 ml de tampón X aplicando el tampón que gotea en un tubo de centrífuga que se va a desechar.
   NOTA: Preparar nuevo búfer de columna magnética X para cada experimento; si no, entonces el rendimiento de las células madre será bajo.
2. Aplique la suspensión de celda etiquetada en la columna. Recoger el flujo que contiene células no etiquetadas que consisten principalmente en células mixtas neuronales/gliales cerebelosas en tubos frescos de 15 ml(Figura 1A).
3. Lavar la columna 3x con 500 l de tampón X (cada lavado tarda alrededor de 2-4 min).
   NOTA: El cultivo mixto neuronal/glial cerebeloso enriquecido con neuronas granulares cerebelosas puede servir como un subproducto útil de este paso de purificación.
4. Retire la columna del campo magnético y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1,0 ml de medio de cultivo (medio de la neurosfera) a la columna y empujar el émbolo en la columna para eliminar las células etiquetadas con cuentas prominina-1 en un tubo de halcón fresco de 1,5 ml.
5. Para mejorar la pureza de las células etiquetadas con prominina-1, pase las células eluidas sobre una segunda columna siguiendo los pasos 5.1–5.4.
6. Cuente las células con un hemocaquímetro. El rendimiento típico es de 10⁷ células por cerebelo. Placar las células en placas de unión ultrabajas (6 o 12 pozos, basado en la densidad requerida para los experimentos aguas abajo).

6. Passaging de las neuroesferas y la diferenciación

1. Placar las células madre con etiqueta prominina-1 en placas de unión ultrabaja 12 pocillos en medio de la neurosfera (5.000 células/pozo).
2. Después de 7-10 días, las células se dividen para producir neuroesferas flotantes en forma de bola (nósferas primarias).
   NOTA: En este experimento, se generan neuroesferas secundarias que se expanden en números para su uso posterior. Las poblaciones de neuroesfera primaria no se utilizan para estos experimentos, ya que pueden contener células contaminantes que no tienen propiedades de células madre y pueden agruparse junto con las neuroesferas.
3. Para el passaging, transfiera las neuroesferas primarias junto con los medios de cultivo utilizando puntas de pipeta de 1,0 ml a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Pellet las neuroesferas por centrifugación a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
4. Resuspenda el pellet en 5 ml de medios de disociación tisular que contenga papaína o solución de trippsina al 0,05%. Incubar a 37oC durante 10 min.
5. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Resuspender las células en 5 ml de medio de la neurosfera y disociar las células mecánicamente utilizando una pipeta Pasteur de plástico y pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo 10x.
6. Placa las células (de nuevo) en los medios de la neuroesfera como se describió anteriormente. Después de 7-10 días en el cultivo, la placa debe enriquecerse con neuroesferas secundarias.
   NOTA: Estos cultivos se pueden pasar hasta 8 veces con buena eficiencia, después de lo cual el tamaño de la neuroesfera tiende a ser más pequeño y sugiere una disminución en la proliferación.
7. Cuente las células en el hemocitómetro y placa el número óptimo para futuros experimentos en placas recubiertas de poli-D-lisina (6 o 12 pozos).
8. Para diferenciar las células madre, recoger las neuroesferas del segundo al octavo pasaje por centrifugación como se describió anteriormente, excepto añadir medio de diferenciación al pellet.
   NOTA: Después de 7 días in vitro, las células madre se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, como se demuestra mediante la tinción con el marcador neuronal de la tubulina,III marcador astrocítico GFAP y el fabricante de oligodendrocitos O4.

Resultados

Las células madre cerebelosas posnatales promininas-1 positivas formaron neuroesferas en neuroesferas medianas ricas en factores de crecimiento (EGF y bFGF). Estas neuroesferas fueron positivas para la prominina-1-tinción, el marcador utilizado para el aislamiento, y también como una mancha para otros marcadores de células madre como Nestin y GFAP¹³ (Figura 1). La expresión del marcador de células madre se mantuvo durante todo el cultivo y hasta por lo menos och...

Discusión

Las células madre cerebelosas promininas-1 que expresan residen en la materia blanca prospectiva durante las primeras 3 semanas de vida postnatal. Su proliferación está estrechamente controlada por la vía sónica del erizo apoyada por las células de Purkinje^17. Estas células madre / progenitores contribuyen a las interneuronas GABAérgicas de nacimiento posterior llamadas células de la cesta y células estelares. Estas interneuronas residen en la capa molecular, donde sinapsis en las célul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05%Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25300054	0.05%
2% B27	Gibco; Thermo Fisher Scientific	17504001
2 mM EDTA solution	Corning	46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads	Miltenyi Biote	130-092-333
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
Column MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Culture plates ultra - low attachment	Corning	3473
Cysteine	Sigma	C7880
DNase	Sigma	D4513-1VL	250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline	Thermo Fisher Scientific	14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS	Gibco	14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor	Promega	G507A	20 ng/mL
Human recombinant Epidermal Growth Factor	Promega	G502A	20 ng/mL
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158
l-glutamine	Gibco	25030081
Microscopy	Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
Mouse anti-Prominin-1	Affymetrix eBioscience	14-1331	1 in 100
Nestin	Abcam	ab27952	1 in 200
Neurobasal medium	Thermo Fisher	25030081
O4	Millopore	MAB345
Papain	Worthington	LS003126	(100 U/mL)
Platelet- Derived Growth Factor	Sigma	H8291	10 ng/mL
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Rabbit anti-tubulin, b-III	Sigma	T2200	1 in 500
Rabit anti-GFAP	Dako	Z0334	1 in 500
Separation columns-MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Sterile cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 μm