JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada gösterilen, postnatal fare beyincik beyaz madde kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Özet

En serebellar nöronlar iki embriyonik kök nişler ortaya çıkar: bir eşkenar dudak niş, tüm serebellar uyarıcı glutamaterjik nöronlar oluşturur, ve ventriküler zon niş, hangi inhibitör GABAerjik Purkinje hücreleri oluşturur, hangi derin serebellar çekirdekleri ve Bergman glia oluşturan nöronlar vardır. Son zamanlarda, üçüncü bir kök hücre niş ventriküler bölge niş ikincil bir germinal bölge olarak ortaya çıkar tarif edilmiştir. Bu nişin hücreleri hücre yüzeyi belirteci prominin-1 ile tanımlanır ve postnatal serebellumun gelişen beyaz maddesine lokalize edilir. Bu niş postnatal olarak üretilen serebellar astrositler ile birlikte geç doğan moleküler tabaka GABAerjik internöronlar için hesaplar. Gelişimsel rollerine ek olarak, bu niş nörodejenerasyon ve tümörigenezde rol alması açısından çevirisel önem kazanmaktadır. Bu hücrelerin biyolojisi, arınma için etkili tekniklerin eksikliği nedeniyle deşifre etmek zor olmuştur. Burada gösterildiği gibi bu postnatal serebellar kök hücreleri arındırmak, kültür ve ayırt etmek için etkili yöntemler vardır.

Giriş

Serebellum uzun gönüllü hareket koordine önemli bir nöronal devre olarak kabul edilmiştir1. Motor çıktısını ince ayarlayabilmek ve hareketi koordine etmek için çevreden proprioseptif bilgi içeren nöroaksinin geniş alanlarından giriş alır. Daha yakın zamanda, aynı zamanda potansiyel olarak benzer,bilgi işleme ağları2,3,4kullanarak biliş ve duyguların düzenlenmesinde karıştığı olmuştur.

Erişkin serebellum bir dış serebellar korteks ve iç beyaz madde oluşur. Bu yapıların içinde serpiştirilmiş derin intracerebellar çekirdekleri vardır. Sinir sisteminin geri kalanına benzer şekilde, beyincik gelişimi göç ve bu iyi organize yapı verim farklılaştırmak multipotent progenitor hücrelerinin (kök hücreler) çoğalması tarafından tahrik edilir. Erken gelişimde (E10.5–E13.5), gelişmekte olan dördüncü ventrikül etrafında bir ventriküler kök niş GABAerjik nöronlar üretir (yani, Purkinje hücreleri, Lugaro hücreleri, Golgi hücreleri) Bergmann gliailebirlikte 5,6,7,8.

Daha sonra geliştirme (doğum sonrası hafta bir), eşkenar dudak ikinci bir kök hücre niş MATEMATİk üretir- ve Nestin ifade ataları uyarıcı granül nöronlar 9,9,10,11,12. Son zamanlarda üçüncü bir kök hücre niş tarif edilmiştir13. Bu hücreler prominin-1 (CD133 olarak da bilinir), bağırsak ve hematopoetik sistemlerde kök hücrelerin bir alt kümesi tanımlayan bir membran yayılan glikoprotein14,15,16ifade . In vivo kader haritalama bu kök hücrelerin ilk üç doğum sonrası hafta boyunca, astrositler ile birlikte anahtar moleküler tabaka internöronlar (yani, sepet hücreleri ve stellat hücreleri) oluşturmak gösterir. Geçmişte, önceki yöntemler prominin-1 boyama12,13,,17bağımlı pahalı ve zaman alıcı teknikler (yani, floresan-aktive hücre sıralama [FACS]) gerekli olduğu için bu hücreleri in vitro çalışmak zor olmuştur. Bu protokol, bu kök hücrelerin izolasyonu için daha sonra kolayca kültürlenebilir ve ayırt edilebilir bir immünomanyetik tabanlı yöntemi açıklar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri NIH'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi 'ne (2011) uygun olarak gerçekleştirildi ve Northwestern Üniversitesi IACUC (Protokol IS00011368) tarafından onaylandı.

1. Çözümlerin Hazırlanması

  1. Steril fenol kırmızısı içeren Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) papain (100 U/ml), sistein (0.2 mg/ml) ve DNase (250 U/ml) ile yapılan doku dissosinasyon çözeltisi hazırlayın.
  2. DNase çözeltisi hazırlamak için 100 mg DNase I (bir şişe) lyophilized toz 50 mL H2O. iyice karıştırın ve stok çözeltisi filtre. 10 mL hisse senedi aliquots hazırlayın. Bir stok tüpünü 0,5 mL tek kullanımlık aliquots'a bölün. Bu tek kullanımlık aliquotları -80 °C'de saklayın.
  3. Manyetik kolon tamponU X: %0.5 büyükbaş serum albumini (BSA) ve 2 mM EDTA çözeltisi hazırlayarak manyetik ayırma reaktiflerini hazırlayın.
  4. Nörosfer medya hazırlamak için, L-glutamin ile penisilin / streptomisin içeren nörobazal orta kullanın ve ek ile 2% B27, 20 ng / mL insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF), ve 20 ng / mL insan rekombinant temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF).
  5. Ayırıcı ortam hazırlamak için nörobazal ortam ve 10 ng/mL diferansiyel faktör trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA) veya 10 ng/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve %2 B27 ile takviye kullanın.
  6. Ultra düşük eki 12 iyi (3,5 cm2)ve 6 iyi (9,6 cm2)kültür plakaları kullanın.

2. Beyincik Diseksiyonu

  1. Anestezi fare yavruları (P3-P7) isoflurane ve decapitate cerrahi makas kullanarak.
  2. Sprey% 70 etanol ile yavruların ayrılmış baş.
  3. Her kafa boş bir steril 10 cm kültür çanak içine aktarın. Mikrodiseksiyon makas kullanarak cilt ayırın, sonra orta hat boyunca makas sagittal çalıştırarak kafatası kaldırın.
  4. #7 forceps kullanarak, beyin sapından caudally başlayan kafatası kemikleri soyma. Spatula kullanarak beyni dikkatlice kaldırın, beyincik bozulmadan tutarak beyni 15 mL buz gibi Hanks' Balanced Salt çözeltisi (HBSS) çözeltisi içeren 10,0 cm'lik taze bir tabağa aktarın.
  5. Beyni içeren yemeği bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. İnce #5 forceps kullanarak, serebellum menenjler ve büyük kan damarları kaldırmak ve spatula kullanarak beyin sapından beyincik ayırın.
  6. Serebellumun 5,0 mL buz gibi HBSS çözeltisi içeren 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarımı. Serebellum durulama ve HBSS 5.0 mL ile 3x decanting tarafından yıkayın.
    NOT: Her beyincik daha fazla işlem için kendi tüpüne yerleştirilmelidir.

3. Hücre Süspansiyon Hazırlığı

  1. Son durulamadan sonra, 37 °C'ye önceden ısıtılmış papain bazlı doku dissosilasyon çözeltisi (önceki çalışmaya göre13,18)5 mL ekleyin. Bir su banyosunda 37 °C'de 15 dakika boyunca dokuyu kuluçkaya yatırın. Yavaş yavaş bir nutating karıştırıcı veya elle kullanarak her 3 dakika 3x-5x tüp ters çevirerek içeriği karıştırın.
  2. Daha önce19açıklandığı gibi geniş çaplı (normal cam pipet) ve dar çaplı Pasteur pipet (Bunsen brülörü üzerinde ısıtılarak ateşle parlatılmış) hazırlayın.
  3. El ile dekanting sırasında doku kaybını önleyerek, HBSS çözeltisi 5 mL ile doku 3x yıkayın.
  4. Son HBSS yıkamayı çıkarın ve dokuya 250 μL DNase çözeltisi içeren 5 mL DPBS çözeltisi ekleyin. Geniş çaplı Pasteur pipetini kullanarak 10x-15x'i üçe katlayarak dokuyu ayrıştırın. Kabarcıklar oluşumunu önlemek için yavaşça bu adımı gerçekleştirin.
  5. Daha sonra bulamacı su banyosunda 37 °C'de 10 dakika daha kuluçkaya yatırın, tüpü ters çevirerek ve düzelterek karıştırın.
  6. Doku bulamacı 10x daha triturate için azaltılmış çapı Pasteur pipet kullanın. Büyük doku parçaları kalırsa, doku parçalarını pipetin ucuyla tüpün dibine hafifçe bastırın ve hücreler ince bir süspansiyona ulaşana kadar pipetleme yapmaya devam edin.
  7. Daha önceki karıştırma adımlarını tekrarlayarak, 37 °C'de 10 dakika daha dokuyu kuluçkaya yatırın.

4. Kök Hücrelerin İmmünetiketleme

  1. Santrifüj tüplerini buzüzerine yerleştirin ve sonraki adımlar için buz gibi solüsyonlar kullanın. Çözünmüş hücreleri 40 μm'lik hücresüzden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Bu ek çözümde hücrelerin kafesten geçmesini sağlamak için 10,0 mL HBSS çözeltisi ile filtreyi toplayın.
  2. Filtrelenmiş hücreleri 15 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonuna santrifüj edin. Bir vakum aspiratörü dikkatlice kullanarak süpernatant'ı tamamen aspire edin ve atın.
  3. Manyetik kolon arabelleği 160 μL pelet resuspend. Manyetik etiketlemeden önce tek hücreli süspansiyonu elde etmek için, hücreleri 30 μm naylon kafesten geçirerek hücre kümelerini temizleyerek kolonu tıkayabilir.
  4. Her 15 mL tüp, mix ve 15 dakika boyunca bir buzdolabında antikor prominin-1-ifade hücreleri bağlamak için kuluçka için anti-prominin-1 mikroboncuklar 40 μL ekleyin.
  5. Hücreleri 10 dk. için 300 x g'de 1.0-2.0 mL kolon tamponx ve santrifüj ekleyerek yıkayın.
  6. X sütun arabelleği 1.0 mL pelet resuspend.
    NOT: X sütun arabelleği 1.0 mL ile pelet in resuspension sonra küçük kümeler görülürse, onlar Pasteur pipet bir ucu kullanılarak dikkatle kaldırılmalıdır, aksi takdirde bu kümeler hücre sıralama sırasında manyetik kolon engelleyebilir.

5. Manyetik Kolon Hazırlama, Hücre Sıralama ve Kaplama

NOT: Herhangi bir gecikme nörosfer morfolojisini etkileyebileceğinden, farklı genotip koşullarından (hastalık vs. kontrol) manyetik ayırma aynı anda yapılmalıdır.

  1. Manyetik kolonları manyetik alana maruz kalan manyetik standa yerleştirerek hazırlayın. Sütunu 500 μL tampon X ile bir kez durulayın ve bir santrifüj tüpüne damlayan tamponu atarak atılmasını önbelleğe alın.
    NOT: Her deney için taze manyetik sütun tampon U- X'i hazırlayın; değilse, kök hücre verimi düşük olacaktır.
  2. Etiketli hücre süspansiyonu sütuna uygulayın. Esas olarak serebellar nöronal/glial karışık hücrelerden oluşan etiketsiz hücreleri içeren akışı taze 15 mL tüplere toplayın(Şekil 1A).
  3. Sütunu 3x 500 μL tampon X ile yıkayın (her yıkama yaklaşık 2-4 dakika sürer).
    NOT: Serebellar nöronal / glial karışık kültür serebellar granüler nöronlar ile zenginleştirilmiş bu arıtma adım yararlı bir yan ürün olarak hizmet verebilir.
  4. Sütunu manyetik alandan çıkarın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Sütuna 1,0 mL kültür ortamı (nörosfer orta) ekleyin ve prominin-1 boncuklarla etiketlenmiş hücreleri taze 1,5 mL'lik bir şahin tüpüne atmak için pistonu sütuna itin.
  5. Prominin-1 etiketli hücrelerin saflığını artırmak için, 5.1-5.4 adımlarını izleyen eluted hücreleri ikinci bir sütun üzerinden geçirin.
  6. Hücreleri hemositometreile say. Tipik verim beyincik başına 107 hücredir. Hücreleri ultra-düşük ek plakalara (6 veya 12 kuyu, akış aşağı deneyleri için gerekli yoğunluğa bağlı olarak) kaplayın.

6. Nörosferlerin Geçişi ve Farklılaşma

  1. Prominin-1 etiketli kök hücreleri nörosfer ortasındaki ultra düşük eki 12 kuyu plakasında (5.000 hücre/kuyu) plakalayın.
  2. 7-10 gün sonra, hücreler top şeklinde yüzen nörosferler (birincil nörosferler) verim bölmek.
    NOT: Bu deneyde, sayıları genişleyen ikincil nörosferler daha fazla kullanım için oluşturulur. Birincil nörosfer popülasyonları bu deneyler için kullanılmaz, çünkü kök hücre özellikleri olmayan ve nörosferlerle birlikte kümelenebilir kirletici hücreler içerebilirler.
  3. Passaging için, 1.0 mL pipet uçları kullanarak kültür ortamı ile birlikte birincil nörosferleri 15 mL steril santrifüj tüpüne aktarın. 5 dk için 300 x g santrifüj ile nörosferler Pelet ve supernatant atın.
  4. Papain veya %0.05 tripsin solüsyonu içeren 5 mL doku dissosilasyon mediasında peleti yeniden askıya alın. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
  5. Hücre süspansiyonunu 300 x g'de 5 dk. Nörosfer ortamının 5 mL'indeki hücreleri yeniden askıya alın ve plastik pasteur pipetkullanarak hücreleri mekanik olarak ayrıştırın ve 10 kat yukarı ve aşağı borular yavaşça pipetleme.
  6. Daha önce açıklandığı gibi nörosfer medyada hücreleri (tekrar) plaka. Kültürde 7-10 gün sonra plaka ikincil nörosferlerle zenginleştirilmelidir.
    NOT: Bu kültürler iyi bir verimlilik ile 8x kadar geçitli olabilir, sonra nörosfer boyutu daha küçük ve çoğalma bir azalma düşündüren olma eğilimindedir.
  7. Hemositometredeki hücreleri sayın ve poli-D-lizin kaplı plakalar (6 veya 12 kuyu) üzerinde gelecekteki deneyler için en uygun sayıyı plakalayın.
  8. Kök hücreleri ayırt etmek için, pelet farklılaşma orta eklemek dışında, daha önce açıklandığı gibi santrifüj tarafından ikinci ila sekizinci geçiş nörosferler toplamak.
    NOT: 7 gün in vitro sonra, kök hücreler nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklılaştırmak, nöronal marker β-III tubulin ile boyama gösterildiği gibi, astrositik marker GFAP, ve oligodendrocyte üreticisi O4.

Sonuçlar

Prominin-1-pozitif postnatal serebellar kök hücreler nörosferlerde büyüme faktörleri açısından zengin nörosferler oluşturdular (EGF ve bFGF). Bu nörosferler prominin-1-boyama için pozitif, izolasyon için kullanılan belirteç, ve aynı zamanda Nestin ve GFAP13 gibi diğer kök hücre belirteçleri için bir leke olarak(Şekil 1). Kök hücre işaretleyici ekspresyonu kültür boyunca ve en az sekiz pasaj20kadar muhafaza edildi. B?...

Tartışmalar

Prominin-1-ifade serebellar kök hücreler postnatal yaşamın ilk 3 haftasında prospektif beyaz maddede bulunur. Onların çoğalması sıkıca Purkinje hücreleri tarafından desteklenen sonik kirpi yolu tarafından kontrol edilir17. Bu kök hücre / ataları sepet hücreleri ve stellat hücreleri olarak adlandırılan daha sonra doğan GABAerjik interneurons katkıda bulunur. Bu internöronlar moleküler tabakada ikamet, Onlar Purkinje hücreleri üzerine sinaps ve HEYKEL PC topografyası ve G...

Açıklamalar

Çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Teşekkürler

Opal laboratuvar üyelerine önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe tarafından desteklendi 1RO1 NS062051 ve 1RO1NS08251 (Opal P)

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05%TrypsinThermo Fisher Scientific253000540.05%
2% B27Gibco; Thermo Fisher Scientific17504001
2 mM EDTA solutionCorning46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeadsMiltenyi Biote130-092-333
Bovine serum albuminSigmaA9418
Column MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Culture plates ultra - low attachmentCorning3473
CysteineSigmaC7880
DNaseSigmaD4513-1VL250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer SalineThermo Fisher Scientific14040141
Hank's balanced salt solution-HBSSGibco14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth FactorPromegaG507A20 ng/mL
Human recombinant Epidermal Growth FactorPromegaG502A20 ng/mL
Leukemia Inhibitory FactorSigmaL5158
l-glutamineGibco25030081
MicroscopyLieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separatorMiltenyi Biotec130-042-102
Mouse anti-Prominin-1Affymetrix eBioscience14-13311 in 100
NestinAbcamab279521 in 200
Neurobasal mediumThermo Fisher25030081
O4MilloporeMAB345
PapainWorthingtonLS003126(100 U/mL)
Platelet- Derived Growth FactorSigmaH829110 ng/mL
Poly-D-LysineSigmaP6407
Rabbit anti-tubulin, b-IIISigmaT22001 in 500
Rabit anti-GFAPDakoZ03341 in 500
Separation columns-MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Sterile cell strainerFisher Scientific2236354740 μm

Referanslar

  1. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  2. Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
  3. Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
  4. Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
  5. Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
  6. Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
  7. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
  8. Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
  9. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
  10. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  11. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  12. Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
  13. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
  14. Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
  15. Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
  16. Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
  17. Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
  18. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
  19. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
  20. Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
  21. Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
  22. Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
  23. Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
  24. Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
  25. Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
  26. Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
  27. Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
  28. Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
  29. Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 158serebellumprominin 1postnataln ral k k h crelerintern ronlarastrositler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır