生成受控动态化学景观，研究微生物行为

摘要

提出了在微流体和微流体设置中通过光液生成动态化学景观的协议。该方法适用于研究不同的生物过程，包括单细胞和种群层面的移动行为、营养摄入或对微生物化学物质的适应。

摘要

我们演示了一种生成受控动态化学脉冲的方法，即局部化学吸引剂在微观尺度上突然出现，为微生物化学实验创造微环境。为了产生化学脉冲，我们开发了一个系统，通过在含有细菌悬浮液的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体室中对笼体氨基酸进行光解，在近乎瞬间引入氨基酸源。我们应用了这种方法的化学细菌，Vibrio ordalii，它可以积极爬上这些动态化学梯度，同时通过视频显微镜跟踪。氨基酸，通过化学改性与可拆卸保护组进行化学修饰，在悬浮液中均匀存在，但在它们突然释放之前不能食用，这种释放通过近UV-A聚焦LED光束在用户定义的时间和空间点发生。脉冲中释放的分子数量可以通过暴露时间和未处理分数之间的校准关系来确定，其中光解后的吸收光谱使用 UV-Vis 光谱进行特征。纳米多孔聚碳酸酯 （PCTE） 膜可集成到微流体装置中，以便通过流动连续去除未结折合的化合物和废介质。PCTE膜与PDMS微流体结构之间的强、不可逆的粘结，是通过用3-氨基丙烯氧硅烷（APTES）溶液涂覆膜，然后对要粘结的表面进行等离子体活化来实现的。计算机控制的系统可以在不同位置和不同强度下生成用户定义的脉冲序列，从而创造具有规定的空间和时间可变性的资源景观。在每个化学环境中，可以获得单个尺度的细菌运动动态及其在种群层面的积累，从而能够量化化学战术性能及其对生态相关环境中细菌聚集的影响。

引言

微生物依靠化学，检测化学梯度和改变运动的过程，以响应^1，导航化学景观，接近营养源和宿主，并逃脱有毒物质。这些微尺度过程决定了微生物与其环境相互作用的宏观动力学^2，3。微流体和微加工技术（包括软光刻^4）的最新进展彻底改变了我们创造受控微环境的能力，从而研究微生物的相互作用。例如，过去的实验通过产生高可控、稳定的中间至高营养浓度梯度^5、6来研究细菌化学。然而，在自然环境中，微尺度化学梯度可能寿命短，通过分子扩散消散，背景条件通常高度稀薄^7。为了直接测量首次暴露于不稳定化学环境中的微生物种群的化学反应，我们设计并介绍了将微流体技术与光解相结合的方法，从而模拟野生细菌在自然界中遇到的梯度。

解封技术采用光敏探头，以功能方式将生物分子封装为非活性形式。辐照释放笼状分子，允许生物过程的靶向扰动^8。由于细胞化学的快速和精确控制，解开提供^9，光解笼化合物传统上使用生物学家，生理学家和神经科学家研究基因^10，电通道¹¹和神经元¹²的激活。最近，科学家利用光分析的显著优势，研究了化学^13，确定了暴露于步进化学刺激^14、15的单个细菌细胞的旗杆切换动力学，并研究了单精子细胞在三维（3D）梯度¹⁶中的运动模式。

在我们的方法中，我们在微流体装置中实现笼体氨基酸的光解，以研究细菌群体对受控化学脉冲的行为反应，这些脉冲通过光释放几乎瞬间可用。使用低放大率（4x）物（NA = 0.13，聚焦深度约40μm）既可观察大视场（3.2 mm x 3.2 mm）上数千种细菌的种群级聚合反应，也可用于单细胞水平的运动测量。我们提出了这种方法的两个应用:1） 释放单个化学脉冲以研究从均匀条件开始的细菌积累 -耗散动力学;2i） 释放多个脉冲来描述在时变、空间异质化学吸引条件下的细菌积累动力学。该方法已在海洋细菌Vibrio ordalii上对氨基酸谷氨酸¹⁷进行化学试验，但该方法广泛适用于不同物种和化学吸引剂的组合，以及化学酶以外的生物过程（例如，营养摄入、抗生素暴露、仲裁检测）。这种方法有望帮助阐明真实环境中微生物的生态和行为，并揭示单个细菌在导航瞬时动态梯度时所面临的隐藏权衡。

研究方案

1. 单化学脉冲实验微流体装置的制造

1. 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计通道并将其打印到透明胶片上以创建照片蒙版（图 1A）。
2. 通过软光刻（在洁净室条件下）制作主人。
   1. 用丙酮、甲醇和异丙醇快速连续清洁硅片（4英寸），然后用氮气干燥。在 130°C 的烤箱中烘烤晶圆 5 分钟。
   2. 将晶圆放在纺布机的中心，并将 SU-8 光刻胶倒在晶圆上。将旋转涂层的速度调高至 5s 转速 500 rpm，并保持在 500 rpm 下 10 s。
      注:最终速度的精确值取决于目标涂层厚度和使用的 SU-8。
   3. 在旋转涂层工艺后，在65°C下烘烤晶圆，然后在95°C烘烤晶圆。让晶圆在室温 （RT） 下冷却至少 5 分钟。
      注:烘烤时间取决于所用光刻胶的目标厚度和类型。一般来说，每100μm层的晶圆应在65°C下烘烤5分钟，在95°C下烘烤45分钟。
   4. 将照片蒙版放在晶圆上，以确保只暴露和聚合感兴趣的区域。在 SU-8 手册中建议的时间暴露于紫外线下。
      注:此处，在波长为 350 nm 时，暴露能量为 200 mJ^cm-2，晶圆暴露时间为 150 s。
   5. 在 SU-8 手册中推荐的时间，在 65°C 和 95°C 下烘烤晶圆。
      注:一般来说，每100μm层的晶圆应在65°C下烘烤5分钟，在95°C下烘烤45分钟。
   6. 将晶圆浸入装有聚甲基丙烯酸酯 （PMMA） 的烧杯中，以获得主。轻轻摇动烧杯，确保将未聚合的光刻胶洗掉。在 200°C 下烘烤主层，以进一步交叉连接 SU-8 层。
3. 在烧杯中以 10:1 的比例（此处为 40 mL）将弹性体与其固化剂（材料表）结合，制备聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 混合物。大力混合，直到液体均匀。
   注: PDMS 混合物看起来不透明，因为气泡是在混合过程中产生的。
   注意:为了防止皮肤接触到潜在的危险化学品或生物材料，在协议过程中始终佩戴实验室涂层和一次性塑料手套，并遵循材料规定的任何特定安全规程安全数据表 （MSDS）。
4. 在 RT 处将 PDMS 混合物在真空室中脱气 45 分钟。为了加快该过程，请定期释放真空，以破裂接口上形成的气泡。
   注: 脱气过程必须在 1 小时内进行，以防止 PDMS 混合物开始固化。
5. 用加压清洁剂清除主表面的灰尘，然后将脱气的 PDMS 混合物倒入主炉，并在 80°C 的烤箱中烘烤 2 小时。
   注:或者，在60°C下烘烤过夜（或至少12小时）将实现相同的硬化PDMS。
6. 在微结构周围用刀片切割 PDMS（距离约为 5 mm），然后小心地从主结构上剥离 PDMS。
7. 打孔作为微通道的入口和出口（此处，一个入口和一个出口，参见图 1A）。确保没有接触特征所在的 PDMS 的底面。
   注: 可以在此处暂停该协议。微通道应用胶带密封，以防止在储存过程中积聚灰尘和其他颗粒。
8. 将 PDMS 微通道粘结到玻璃滑块上。
   1. 用肥皂、异丙醇和去离子水彻底清洁玻璃滑梯。让玻璃滑动干燥或使用压缩空气来加快该过程。
   2. 用胶带涂抹去除灰尘颗粒。在用等离子体处理两个表面（使用电晕系统或等离子氧室）2分钟后，将 PDMS 微通道粘结在干净的玻璃滑块上 2 分钟。
   3. 将微流体装置置于热板上加热至少 1 小时，以增强与玻璃的化学键。

2. 为多脉冲实验制作 3D 打印的微流体设备

1. 使用 3D 设计软件设计 3D 形状，并使用高分辨率 3D 打印机打印 PDMS 模具的主形状（图 1B）。
   注:请参阅用于创建主控形状 3D 打印机和模具材料的材料表。
2. 重复步骤 1.3_1.4，然后用胶带涂抹清洁主表面。将主控形状放在刻度上，然后，在避免主控体的中心区域将被膜占用的同时，倒入未固化的 PDMS 混合物的确切数量（此处为 23.4 g），以便通过匹配主控形状的高度来获得所需的 PDMS 高度（此处， 0.5 毫米）。在压缩空气的帮助下清除所有剩余的气泡。
3. 将 PDMS 铸在 45°C 的烤箱中，烘烤至少 12 小时。
4. 将 3D PDMS 模具粘结到培养皿中。
   1. 轻轻剥离硬化的 PDMS 层和冲孔入口和出口孔，用于注入细菌悬架（图 1C）。
   2. 用氧气等离子体激活培养皿表面（90 mm x 15 mm）和 PDMS 模具 2 分钟，将 PDMS 模具粘结在培养皿上。轻轻地将模具按到培养皿，但不要按特征所在的位置，因为这可能使审讯室崩溃。
   3. 将培养皿粘结到 PDMS 3D 模具中，在 45°C 的烤箱中至少 12 小时，以加强化学粘结。
      注: 可以在此处暂停该协议。
5. 膜表面功能化¹⁸
   1. 在 RT 处激活氧等离子腔中的纳米多孔聚碳酸酯 （PCTE） 膜 1 分钟。
      注意:避免使用电晕系统进行等离子激活，因为它会损坏膜。
   2. 在化学罩下，使用聚丙烯管将脱离子水中的3-氨基三氧基硅烷（APTES）的商业溶液稀释至体积（此处为40 mL）的1%。
      注意:APTES 溶液具有剧毒（MSDS 健康危害评分 3），应极其小心处理，完全在带手套的化学罩下处理。处理 APTES 解决方案后立即更换手套。APTES 烟雾对粘膜和上呼吸道具有破坏性。APTES的目标器官是神经、肝脏和肾脏。如果没有烟罩，则必须实施面罩和全脸呼吸器。
   3. 将稀释的APTES溶液转移到培养皿中，将活性膜浸入APTES溶液中20分钟。
   4. 用钳子从 APTES 溶液中取出膜，并将其放在洁净室擦拭上晾干。
6. 对于PDMS微流体通道的制造，将位于膜上并允许清洗细菌竞技场，重复步骤1.1_1.7。
7. 将 PDMS 洗涤通道粘结到功能化膜上。
   1. 用氧等离子室激活PDMS洗涤通道和PCTE膜2分钟。
      注:膜应小于PDMS洗涤通道，夹在两个PDMS层之间。
   2. 等离子体处理后，通过轻轻将PDMS洗涤通道轻轻压到膜上，使功能化膜和PDMS洗涤通道接触。
      注:在此阶段不要施加过大压力，因为它可能导致（不可逆）膜附着到通道的车顶上，阻塞通道。
8. 将膜夹在两个 PDMS 层之间 （图 1E）。
   1. 激活粘结层压层 PDMS 洗涤通道 -PCTE 膜和先前用氧气等离子室粘合到培养皿中的 3D PDMS 模具 2 分钟，将其接触并压在一起。
   2. 将培养皿粘结到45°C的烤箱中，至少12小时，以加强化学键。
      注: 可以在此处暂停该协议。

3. 细胞培养

1. 在2216中等¹⁹号轨道摇床（600rpm）上，在30°C下生长V.ordalii（应变12B09或12B09pGFP），在20小时内生长20小时，在8°C的后期收获细胞。对于含有pGFP的分离物，添加光谱霉素（50μg^mL-1）以维持质粒。
2. 在 2500 x g下将 1 mL 等分的细胞离心 3 分钟，去除上清液，并在 1 mL 的过滤人工海水中重新悬浮细胞。重复此步骤。
3. 在30°C下将V.ordalii的种群饿死在轨道摇床（600rpm）上3小时。
4. 制备库存10mM（此处，1 mL）的4-甲氧基-7-亚硝基-乙酯-L-谷氨酸（MNI-笼-L-谷氨酸）的库存人工海水溶液，并储存在-20°C。
   注:保护MNI-笼-L-谷氨酸溶液免受环境光照射，防止光解。
5. 在1mM MNI-笼-L-谷氨酸的人工海水溶液中重新悬浮饥饿的细胞，稀释细胞50倍。
   注:这将确保最终细菌浓度低于5 x 10⁷ mL^-1（确切的值取决于指数晚期细胞的初始浓度，通常为 ±10^{9 mL-1}）。使用光学密度 （OD） 为 600 nm 的分光光度计估计细菌浓度。

4. 取消控制协议的校准

1. 将MNI-笼-L-谷氨酸²⁰的人工海水溶液的液滴（20 μL）放在玻璃玻片上，浓度为C_0~ 10 mM。用圆形 PDMS 造型室覆盖，将滴封装（直径d = 5 mm，高度h = 250 μm）。
2. 使用 4x 物镜（数值孔径 [NA] = 0.13），将玻璃滑块放在显微镜舞台上，将整个腔室 20 毫秒暴露在波长为 395 nm（功率 295 mW）的 LED 光束中。
3. 打开 PDMS 造型室并提取一个滴 （1 μL），以便使用 UV-Vis 分光光度计进行分析。
4. 对于 0.1 s、0.5 s、2.5 s、25 s、250 s（或直到化学反应饱和）和 0 s（获取背景）的不同 LED 照明持续时间，重复步骤 4.1_4.3。复制步骤 4.1_4.4 至少 3 倍（此处为 4 倍）。
5. 从吸收光谱中，提取值在405nm，代表笼分子²¹吸收光谱中的峰值。要确定 LED 暴露¹⁴的化学去熟反应的速率k，请使用以下一阶动力学方程进行实验数据¹⁷的数值拟合
   
   其中C（t） 是溶液吸收光谱的值，在 405 nm（背景去除后）与 t秒的未处理时间。对于小的解压时间t，例如kt 1，Eq. 1 可以简化为线性公式
   

5. 单化学脉冲实验

1. 在真空下保持微流体通道 20 分钟，以降低 PDMS 内的气体浓度，从而在灌装过程中不太可能形成气泡。
2. 从真空泵中提取通道，并立即将稀释细菌悬浮液引入人工海水中的 1 mM MNI-笼-L-谷氨酸中，使用微移液器轻轻引入微通道，以避免机械剪切力对鞭节机损坏（此处，整个灌装过程需要 5-10 s）。用细菌悬浮液填充通道后，用纸巾吸吸溶液，用 PDMS 插头将溶液轻轻压入孔中，用 PDMS 插头密封入口和出口。
   注:这样，腔室中的流体流动就被阻止。
3. 将微通道置于显微镜台上，移动舞台以设置中间通道的视野。设置显微镜，以12fps的帧速率在相对比度（4倍物镜）中执行成像。
   注: 此值可以变化，但不应小于 10 fps，以便通过图像分析重建细菌轨迹（参见协议第 7 节）。
4. 将 LED 光束的针孔设置为最小孔径。通过将摄像机的曝光时间设置为 5 秒，记录几帧，以获得 LED 光束的空间位置和尺寸的精确测量。
   注:LED光源通过液体导光连接连接到显微镜的上荧光照明器。LED 光束不会影响视频捕获，因为视频采集和 LED 刺激是通过软件独立命令的。
5. 通过显微镜软件在用户定义的时间点（此处，视频采集开始后 10 秒）对 395 nm 的聚焦 LED 光束进行连续成像，持续成像 10 分钟（395 nm），同时激活所需的持续时间（t = 20 ms、100 ms、500 ms）。要获得同一工艺的多个复制，移动舞台以记录微流体通道不同位置的细菌反应。使用新的微通道，为每个脉冲大小复制此过程。
   注: 解封过程生成一个对称圆柱脉冲，在成像平面中径向外扩散。
6. 在较高的放大倍率（20x物镜，NA = 0.45）下，在不化学脱光的情况下进行单独的实验，以更高的帧速率（50 fps）记录细菌的无偏游泳运动。

6. 多化学脉冲实验

1. 在真空下保持微流体室20分钟。
2. 将含有微流体室的培养皿放在显微镜上。在人工海水中，将 1 mM MNI-笼-L-谷氨酸溶液中的 GFP 荧光V. ordalii的稀释细菌悬浮液（此处，整个灌装过程需要 10-15 s）填充膜下方的腔室。用细菌悬浮液填充通道后，用纸巾吸吸溶液，用 PDMS 插头将溶液轻轻压入孔中，用 PDMS 插头密封入口和出口。
   注:这样，腔室中的流体流动就被阻止。为了在通过纳米孔膜进行成像的这种设置中更好地可视化细菌，强烈建议使用荧光菌株而不是野生类型（如单个化学脉冲实验中使用的）。
3. 用1mM MNI-Cin-L-谷氨酸的人工海水溶液填充注射器，并将管附在膜上方的清洗通道的入口和出口上。
4. 将油管连接到废物储液罐，确保油管完全浸入液体废物储液罐中，以避免压力振荡。
5. 在注射器泵上设置适当的流速（此处为 50 μL^min-1），以获得洗涤通道中所需的平均流量，这取决于通道几何形状。
6. 启动注射器泵，在膜上方的洗涤通道中建立流量。
7. 运行控制 LED 光束和显微镜级的软件，以不同位置和不同强度生成用户定义的脉冲序列。
   注:膜上方洗涤通道中1mM MNI-Cin-L-谷氨酸的人工海水溶液的连续流动补充了笼内复合溶液，并洗涤了细菌场中的废介质。
8. 在几个小时内和多个连续位置使用 4 倍目标定期录制视频，以覆盖一个大表面（此处为 1 厘米 x 1 厘米，图 1F）。

7. 图像分析和数据分析

1. 细菌轨迹的重建
   1. 从用4倍目标录制的电影中，使用跟踪软件¹⁷重建细菌轨迹。
      注:这些轨迹表示微通道中 3D 细菌运动的 2D 投影。
   2. 从重建的细菌轨迹中，通过将游泳速度投射到化学脉冲中心的方向上，确定每个游泳个体的径向漂移速度（图2D）。为了可视化径向漂移速度的时空动力学，请使用空间大小为 75 μm x 75 μm 和时间窗口为 5-10 s 间隔的分箱网格（图 2D，E）。
      注:由于过程的圆柱对称性，数据可以以极坐标进行分析，并在角度尺寸上求平均值（图3）。
   3. 从重建的细菌轨迹中，确定细菌对化学脉冲作出反应时分布的时空动力学（图2E）。
   4. 在单脉冲实验中用20倍目标记录的高分辨率电影中提取细菌群的游泳速度和运行时间的分布，因为它们对化学脉冲有反应（图4）。
2. 通过考虑化学菌株完成¹⁷年后细菌种群的耗散动态来估计细菌的扩散系数（此处为t>300 s; 图 3.
3. 通过应用斯托克斯-爱因斯坦方程估计谷氨酸的扩散系数
   
   其中氨基酸分子被假定为球形粒子，水动力半径^为22r_{G，k B}是玻尔兹曼常数（1.38 x 10^-23 m² kg s -2 K^-1），T是温度（296 K），α是人工海水的动态粘度（盐度 36 g^kg-1），温度为 23 °C （10^-3 Pa s）²³

结果

我们使用微流体和微流体装置（图1）来研究动态营养条件下的细菌积累谱。细菌轨迹是从通过相对比显微镜获得的细菌群体在光解释放的化学脉冲后积累-消散动力学的录影视频中提取的（图2和图3）。通过平均数百万条轨迹，得到了径向漂移速度和细菌浓度的时空动力学。在没有化学梯度的情况下进行游泳的统计数据是在空间和...

讨论

该方法使研究人员能够在微流体和微流体器件的受控动态梯度下研究细菌化学，从而实现可重现的数据采集。光溶在微尺度上几乎瞬间产生化学脉冲，目的是从各种来源再现细菌在野外遇到的营养脉冲类型，例如，下沉的海洋颗粒²⁵背后的羽状物扩散，或从溶化浮游植物细胞²⁶中传播的营养。

我们提出了这种方法的两个应用:1） 释放单个化?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material