微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

要約

マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。

要約

マイクロスケールで局所的な化学誘起物質が突然利用可能になる制御された動的化学パルスの生成方法を実証し、微生物走化実験のためのマイクロ環境を作り出す。化学パルスを作製するために、細菌懸濁液を含むポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体室内でカゲアミノ酸を光分解することで、ほぼ瞬時にアミノ酸源を導入するシステムを開発しました。この方法を走化細菌、ビブリオ・オルダリに応用し、ビデオ顕微鏡で追跡しながらこれらの動的化学勾配を積極的に登ることができる。アミノ酸は、フォトリムーバル可能な保護基による化学的修飾によって生物学的に不活性('caged')をレンダリングし、懸濁液中に均一に存在するが、ほぼUV-A焦点を当てたLEDビームによって時間と空間のユーザー定義のポイントで発生する突然の放出まで消費できない。パルスで放出される分子の数は、光分解後の吸収スペクトルがUV-Vis分光法を用いて特徴付けられる露光時間と非定率との間の較正関係によって決定することができる。ナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜をマイクロ流体デバイスに組み込み、解毒された化合物および使用済み培地の流れによる連続的な除去を可能にすることができる。PCTE膜とPDMSマイクロ流体構造との間の強く不可逆的な結合は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の溶液で膜をコーティングし、続いて結合する表面のプラズマ活性化によって達成される。コンピュータ制御システムは、異なる場所で異なる強度を持つパルスのユーザー定義シーケンスを生成し、所定の空間的および時間的変動性を持つリソース景観を作成することができます。各化学環境において、個々のスケールでの細菌の動きのダイナミクスと集団レベルでの蓄積を得ることができるため、化学戦術性能の定量化と、生態学的に関連する環境における細菌凝集への影響が可能になる。

概要

微生物は、化学勾配を検出し、応答¹で運動性を改変するプロセスである化学化学軸に依存して、化学景観をナビゲートし、栄養源と宿主にアプローチし、有害物質を脱出します。これらのマイクロスケールプロセスは、微生物とその環境^2、3との間の相互作用のマクロスケールの動態を決定する。ソフトリソグラフィ⁴を含むマイクロ流体技術および微細加工技術の最近の進歩は、微生物の相互作用を研究する制御された微小環境を作り出す能力に革命をもたらしています。例えば、過去の実験では、高い栄養素濃度^5、6の中間体から高い栄養濃度の高い制御、安定した勾配を生成することにより、細菌の走化を研究してきた。しかし、自然環境では、マイクロスケールの化学勾配は、分子拡散によって消失する短時間で、背景条件は高度に希釈されることが多い⁷である。微生物集団の化学化学反応を直接測定するために、微生物が自然界で遭遇する勾配を模倣し、微小流体技術と光流動を組み合わせる方法を考案し、ここで説明しました。

アンセジング技術は、生体分子を非アクティブな形で機能的にカプセル化する光感受性プローブを採用しています。照射は、ケージ分子を放出し、生物学的プロセスの標的摂動を可能にする^8。細胞化学の迅速かつ正確な制御のために^9,ケージ化合物の光分化は、伝統的に遺伝子 10 の活性化を研究する生物学者、生理学者や神経科学者によって採用されています^10,イオンチャネル^11,ニューロン^12.最近では、科学者たちは、光化の重要な利点を利用して走化性¹³を研究し、段階的な化学誘引刺激刺激物^14、15にさらされた個々の細菌細胞のフラグラスイッチングダイナミクスを決定し、3次元(3D)勾配¹⁶における単一精子細胞の運動パターンを調査した。

我々のアプローチでは、マイクロ流体デバイス内でケージアミノ酸の光分化を実施し、光放出を通じてほぼ瞬時に入手可能になる制御された化学パルスに対する細菌集団の行動応答を研究する。低倍率(4倍)目標(NA = 0.13、焦点深度約40μm)を使用することで、大視野(3.2 mm x 3.2 mm)にわたる数千もの細菌の集団レベルの凝集応答を観察し、単一細胞レベルでの運動の測定を可能にします。この方法の2つの用途を提示する:1)均一な条件から始まる細菌の蓄積−放散ダイナミクスを研究するための単一の化学パルスの放出、および2i)時間変動、空間的に不均一な化学誘引条件下での細菌蓄積ダイナミクスを特徴付ける複数のパルスの放出。この方法は、アミノ酸グルタミン酸¹⁷に向かって走化を行う海洋細菌ビブリオダリに対して試験されているが、この方法は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに化学原性を超える生物学的プロセス(例えば、栄養取り込み、抗生物質暴露、クォーラムセンシング)に広く適用可能である。このアプローチは、現実的な環境における微生物の生態と挙動を解明し、一時的な動的勾配をナビゲートする際に個々の細菌が直面する隠れたトレードオフを明らかにすることを約束します。

プロトコル

1. 単一化学パルス実験のためのマイクロ流体装置の作製

1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用してチャンネルを設計し、透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。
2. 柔らかいリソグラフィー(清潔な部屋の条件下で)によってマスターを製造する。
   1. アセトン、メタノール、イソプロパノールでシリコンウエハ(4インチ)を連続して清掃し、窒素を使用して乾燥させます。ウエハをオーブンで130°Cで5分間焼きます。
   2. ウエハをスピンコーターの中心に置き、SU-8フォトレジストをウェーハに注ぎます。スピンコーターの速度を5s以上500rpmまでランプし、10sの500 rpmに保ち、10s以上の最終速度までランプアップし、30sのこの速度で維持します。
      注: 最終速度の正確な値は、ターゲットコーティングの厚さと使用される SU-8 によって異なります。
   3. スピンコーティング処理後、ウエハを65°Cで焼き、次いで95°Cで焼きます。ウエハを室温(RT)で少なくとも5分間冷やします。
      注:焼き時間は、ターゲットの厚さと使用されるフォトレジストの種類によって異なります。原則として、100 μm層ごとに、ウエハを 65 °C で 5 分間、95 °C で 45 分間焼く必要があります。
   4. フォトマスクをウェーハの上に置き、目的の領域だけを露出させ、重合することを確認します。SU-8マニュアルで推奨時間のためのUV光に露出。
      注:ここでは、350nmの波長で200mJ^cm-2の露光エネルギーを用い、ウエハを150sで露光した。
   5. SU-8マニュアルで推奨される時間のために65°Cと95°Cでウエハを焼きます。
      注: 原則として、100 μm 層ごとに、ウエハを 65 °C で 5 分間、95 °C で 45 分間焼く必要があります。
   6. マスターを得るために、ポリメタクリル酸(PMMA)現像剤を充填したビーカーにウエハを浸す。ビーカーを軽く振って、未重合フォトレジストを洗い流します。マスターを200°Cで焼き、SU-8層をさらにクロスリンクします。
3. エラストマーと硬化剤(材料表)をビーカーで10:1の比率(ここでは40 mL)と組み合わせて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物を調製する。液体が均質になるまで激しく混ぜます。
   注: 混合プロセス中に泡が生成されるため、PDMS の混合は不透明に見えます。
   注意:潜在的に有害な化学物質や生物学的材料に皮膚が接触するのを防ぐために、常にプロトコル全体でラボコートと使い捨てプラスチック手袋を着用し、材料に従って特定の安全プロトコルに従ってください安全データシート (MSDS)。
4. RTで45分間真空チャンバーにPDMS混合物を脱ガスする。プロセスを迅速化するには、インタフェースで形成される気泡を破裂させるために定期的に真空を解放します。
   注: PDMS 混合物が硬化し始めないように、脱ガス処理は 1 時間以内に行わなければなりません。
5. 加圧クリーナーでマスターの表面からほこりを取り除き、その後、脱気したPDMS混合物をマスターに注ぎ、80°Cのオーブンで2時間焼きます。
   注:あるいは、60 °Cで一晩(または少なくとも12時間)焼くことは同じ硬化PDMSを達成するでしょう。
6. マイクロ構造の周りに(約5mmの距離で)ブレードでPDMSを切断し、慎重にマスターからPDMSを剥がします。
7. マイクロ流路の入口および出口として機能する穴をパンチします(ここでは、1つの入口と1つの出口、図1Aを参照)。機能が配置されている PDMS の下面に何も触れないようにします。
   注: ここでプロトコルを一時停止できます。マイクロチャネルは、保管中にほこりや他の粒子が蓄積するのを防ぐために、粘着テープで密封する必要があります。
8. PDMSマイクロチャンネルをガラススライドに接着します。
   1. 石鹸、イソプロパノール、脱イオン水でガラススライドを十分に清掃します。ガラスを乾燥させるか、圧縮空気を使用してプロセスをスピードアップします。
   2. 粘着テープでダビングしてほこり粒子を取り除きます。PDMSマイクロ流路をクリーンなガラススライドに接着し、両方の表面をプラズマで処理した直後(コロナ系またはプラズマ酸素チャンバーのいずれかを使用して)2分間。
   3. マイクロ流体装置をホットプレート上の80°Cで少なくとも1時間加熱し、ガラスとの化学結合を強化します。

2. 複数パルスを用いた実験のための3Dプリントミリ流体デバイスの製造

1. 3D 設計ソフトウェアを使用して 3D 形状を設計し、高解像度 3D プリンタで PDMS 金型用マスタを印刷します (図 1B)。
   注: マスターの作成に使用する 3D プリンタおよび金型材料については、「マテリアルの表」を参照してください。
2. 手順1.3-1.4を繰り返し、粘着テープでダビングしてマスターの表面を清掃します。マスターをスケールに置き、次に、膜によって占有されるマスターの中央領域を避けながら、マスターの高さを一致させることによりPDMSの所望の高さを得るために、未硬化PDMS混合物の正確な量(ここでは23.4g)を注ぎます(ここでは、 0.5 mm)。圧縮空気の助けを借りて、残りの気泡を取り除く。
3. 45 °Cのオーブンでマスターに投下されたPDMSを置き、少なくとも12時間焼きます。
4. 3D PDMS金型をペトリ皿に接着します。
   1. 硬化したPDMS層を軽く剥がし、細菌懸濁液を注入するためのパンチ入口と出口穴(図1C)。
   2. ペトリ皿(90 mm x 15 mm)と酸素プラズマを用いたPDMSモールドを2分間有効にします。金型をペトリ皿にそっと押し込みますが、尋問室を崩壊させる可能性がありますので、機能が置かれている場所を押しません。
   3. PDMS 3D型に接着したペトリ皿を、少なくとも12時間オーブンのオーブンに入れ、化学結合を強化する。
      注: ここでプロトコルを一時停止できます。
5. 膜表面機能化¹⁸
   1. RTで1分間酸素プラズマ室でナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜を活性化します。
      注意:プラズマの活性化には膜が損傷するため、コロナシステムを使用しないでください。
   2. 化学フードの下で、ポリプロピレンチューブを用いて、脱イオン水中の3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の市販液を1%分(ここでは、40mL)に希釈する。
      注意: APTESソリューションは急性毒性(MSDS健康ハザードスコア3)であり、手袋付きの化学フードの下でのみ細心の注意を払って処理する必要があります。APTES ソリューションの処理後すぐに手袋を交換します。APTESの煙は粘膜および上気道に破壊的である。APTESの標的臓器は神経、肝臓、腎臓である。ヒュームフードが利用できない場合は、フェイスシールドと全面人工呼吸器を実装する必要があります。
   3. 希釈したAPTES溶液をペトリ皿に移し、活性化した膜をAPTES溶液に20分間浸漬します。
   4. ピンセットでAPTES溶液から膜を取り出し、クリーンルームワイプに入れ、乾燥させます。
6. 膜上に置かされ、細菌の場の洗浄を可能にするPDMSマイクロ流体チャネルの作製のために、ステップ1.1-1.7を繰り返す。
7. PDMS洗浄チャネルを機能化膜に接着します。
   1. PDMS洗浄チャネルとPCTE膜の両方を酸素プラズマチャンバーで2分間活性化します。
      注: 2 つの PDMS 層の間に挟まれる膜は、PDMS 洗浄チャネルよりも小さくする必要があります。
   2. 血漿処理の直後に、PDMS洗浄チャネルを膜にそっと押し込むことで、機能化された膜とPDMS洗浄チャネルを接触させます。
      注: この段階では、流路の屋根に膜が(不可逆的に)付着し、チャネルがふける原因となる可能性があるため、この段階では過度の圧力をかけないでください。
8. 2つのPDMS層の間に膜を挟み込む(図1E)。
   1. 結合した積層PDMS洗浄チャネル-PCTE膜と、以前にペトリ皿に結合した3D PDMSモールドを酸素プラズマチャンバーで2分間有効にします。
   2. サンドイッチ構造に接着したペトリ皿を、少なくとも12時間45°Cのオーブンに入れ、化学結合を強化します。
      注: ここでプロトコルを一時停止できます。

3. 細胞培養

1. 30°Cで軌道シェーカー(600rpm)で2216培地¹⁹で20時間、後期指数相で細胞を収穫するために、V.オルダリ(株12B09または12B09pGFP株)の集団を一晩成長させる。pGFPを保持する分離株の場合は、プラスミドを維持するためにスペクチノマイシン(50 μg^mL-1)を加えます。
2. 3分間2500 x gで1mLの細胞アリコートを遠心分離し、上清を除去し、1 mLの濾過された人工海水で細胞を再懸濁させる。この手順を繰り返します。
3. 3時間30°Cで軌道シェーカー(600rpm)でV.オルダリの集団を飢えさせる。
4. 4-メトキシ-7-ニトロインドリニル-L-グルタミン酸(MNI-カゲド-L-グルタミン酸)の10mM(ここでは1mL)のストック人工海水溶液を調製し、-20°Cで保存する。
   注:光の溶解を防ぐために、周囲の光からMNI-ケージL-グルタミン酸溶液を保護します。
5. 1 mNI-ced-L-グルタミン酸の人工海水溶液中で飢えた細胞を再懸濁して細胞を50倍に希釈する。
   注:これにより、5 x 10⁷ mL^-1未満の最終細菌濃度が保証されます(正確な値は後期指数関数の細胞の初期濃度に依存します。通常は〜10⁹ mL^-1です)。細菌濃度は、600nmの光学密度(OD)で分光光度計を用いて推定した。

4. アンケージプロトコルの校正

1. MNI-caged-L-グルタミン酸²⁰の人工海水溶液の液滴(20μL)を、ガラススライド上の濃度C₀ = 10 mMに置きます。円形のPDMSチャンバーで覆って液滴をカプセル化します(直径d = 5 mm、高さh = 250 μm)。
2. 顕微鏡ステージにガラススライドを置き、4倍の目的(数値開口[NA]=0.13)を使用して、395 nm(パワー295mW)の波長で20msのLEDビームにチャンバー全体を露出させます。
3. PDMSチャンバーを開き、UV-Vis分光光度計で分析する液滴(1μL)を抽出します。
4. 0.1 s、0.5 s、2.5 s、25 s、250 s (または化学反応が飽和するまで) および 0 s (バックグラウンドを取得する) の異なる持続時間について、ステップ 4.1-4.3 を繰り返します。手順 4.1-4.4 を少なくとも 3 倍 (ここでは 4x) に複製します。
5. 吸収スペクトルから、405nmで値を抽出し、ケージ分子²¹の吸収スペクトルにおけるピークを表す。LED露光¹⁴による化学解光反応のレートkを求めるために、実験データ¹⁷の数値適合に対して以下の一次動力学式を用いる
   
   ここで、C(t)は、405 nm (バックグラウンド除去後) の解液の吸収スペクトルの値で、t 秒の時間を取り除く。kt1、Eq. 1を線形製剤に簡略化することができるような小さな帯り付け時間t
   

5. 単一の化学パルス実験

1. PDMS内のガス濃度を下げるために真空下でマイクロ流体チャネルを維持し、充填プロセス中に気泡が形成されにくくなるようにします。
2. 真空ポンプから流路を抽出し、機械剪断力によるフラメラー損傷を避けるためにマイクロピペットを使用して人工海水中の1 mM MNI-カジド-L-グルタミン酸をマイクロチャネルにすぐに導入します(ここでは、充填プロセス全体が5〜10sかかりました)。管を細菌の懸濁液で満たした後、ペーパータオルで余分に溶液を吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密閉し、穴にそっと押し込みます。
   注:このようにして、チャンバ内の流体の流れを防止します。
3. マイクロチャンネルを顕微鏡のステージに置き、ステージを動かして中間チャンネルの視野を設定します。マイクロスコープをセットアップして、フレームレート 12 fps で位相コントラスト (4 倍の目的) でイメージングを行います。
   注: この値は変化させることができますが、画像解析を通じて細菌の軌道を再構築できるように 10 fps 未満にしないでください(プロトコル セクション 7 を参照)。
4. LEDビームのピンホールを最小開口に設定します。カメラの露光時間を5 sに設定して、数フレームを記録して、LEDビームの空間位置とサイズの正確な測定を得ます。
   注:LED光源は液体のライトガイド接続によって顕微鏡の上蛍光の照光器に接続する。ビデオ集録とLED刺激はソフトウェアによって独立して命令されるため、LEDビームはビデオキャプチャに影響を与えません。
5. 合計10分間(最大の化学パルスでは20分)の連続イメージングを行い、同時に、ユーザー定義の時点(ここでは、ビデオ取得開始後10秒)で、目的の持続時間(この実験ではt = 20 ms、100 ms、500ms)で395nmで集光LEDビームを活性化します。同じプロセスの複数の反復を得るために、段階を移動してマイクロ流体チャネルの異なる位置に細菌応答を記録する。新しいマイクロチャネルを使用して、パルス サイズごとにこの手順をレプリケートします。
   注: このアンセアーシング プロセスは、イメージング 平面内で放射状に外側に拡散する軸対称円筒形パルスを生成します。
6. 高い倍率(20倍の目的、NA = 0.45)で、細菌の偏りのない泳動を記録するために、より高いフレームレート(50 fps)で化学的に抜け出すことなく別々の実験を行います。

6. 複数の化学パルス実験

1. 20分間真空下でミリ流体室を維持します。
2. ミリ流体室を含むペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。膜の下のチャンバーを、人工海水中の1mM MNI-caged-L-グルタミン酸溶液中のGFP蛍光V.オルダリイの希薄な細菌懸濁液(ここでは、充填プロセス全体が10〜15秒かかった)で満たします。管を細菌の懸濁液で満たした後、ペーパータオルで余分に溶液を吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密閉し、穴にそっと押し込みます。
   注:このようにして、チャンバ内の流体の流れを防止します。ナノ多孔膜を通してイメージングが行われるこの設定で細菌をより良く可視化するためには、野生型の代わりに蛍光株を使用することが強く推奨されます(単一の化学パルス実験で使用)。
3. 1 mNi-caged-L-グルタミン酸の人工海水溶液で注射器を充填し、膜の上の洗浄チャネルの入口と出口にチューブを取り付けます。
4. チューブを廃棄物貯蔵所に接続し、圧力振動を避けるためにチューブが流体廃棄物貯留槽に完全に水没していることを確認します。
5. シリンジポンプに適切な流量を設定し(ここでは50 μL^分-1)、チャネルジオメトリに依存する洗浄チャネルで所望の平均流量を得ます。
6. シリンジポンプを開始し、膜の上の洗浄流路の流れを確立します。
7. LEDビームと顕微鏡ステージを制御するソフトウェアを実行して、異なる位置で異なる強度でパルスのユーザー定義シーケンスを生成します。
   注:膜上の洗浄流路における1 mM MNI-ケージ-L-グルタミン酸の人工海水溶液の連続的な流れは、ケージ化合物溶液を補充し、細菌の場から使用済み培地を洗浄します。
8. 4x の目標を、数時間にわたって定期的に録画し、連続した複数の場所でビデオを録画して、大きなサーフェスをカバーします(ここでは、1 cm x 1 cm、図 1F)。

7. 画像解析とデータ解析

1. 細菌の軌道の再構築
   1. 4xの目的で記録された映画から、トラッキングソフトウェア¹⁷を用いて細菌の軌跡を再構築する。
      注: これらの軌道は、マイクロ流路における 3D 細菌の動きの 2D 投影を表します。
   2. 再構築された細菌の軌跡から、化学パルスの中心方向に泳ぐ速度を投影することによって、各水泳個体の半径ドリフト速度を決定します(図2D)。放射状ドリフト速度の時空間ダイナミクスの視覚化のために、空間サイズ75 μm x 75 μm のビニンググリッドと、5-10 秒間隔の時間窓を使用します (図 2D,E)。
      注: プロセスの円筒対称性のため、データを極座標で解析し、角度寸法を平均化することができます(図3)。
   3. 再構成された細菌の軌道から、化学パルスに反応する細菌の分布の時空間的ダイナミクスを決定します(図2E)。
   4. 単一パルス実験中に20倍の目的で記録された高解像度の映画から、化学パルスに応答する細菌集団の泳動速度と実行時間の分布を抽出します(図4)。
2. 走化が完了した後の細菌集団の散逸ダイナミクスを考慮して細菌の拡散係数を推定する¹⁷ (ここでは、t > 300 s;図 3を参照してください。
3. ストークス-アインシュタイン方程式を適用してグルタミン酸の拡散係数を推定する
   
   ここで、アミノ酸分子は流体力学的半径^22rGの球状粒子と仮定され、k_Bはボルツマン定数(1.38 x 10-23 m² kg s ^-2 K^-1)、Tは温度(296 K)、ηは人工海水の動的粘度(塩分36gkg-1)23°C(1-Pa))である。

結果

微小流体およびミリ流体デバイス(図1)を使用して、動的栄養条件下での細菌蓄積プロファイルを研究しました。細菌の軌跡は、光熱により放出された化学パルスに続く細菌集団の蓄積・散逸ダイナミクスの位相差顕微鏡で取得した記録されたビデオから抽出した(図2および図3)。何百万もの軌道を平均化することにより、放射...

ディスカッション

この方法により、研究者はマイクロおよびミリ流体デバイスの制御された動的勾配の下で細菌の走化を研究することができ、再現性のあるデータ収集を可能にする。光彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の生成は、細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈没海洋粒子²⁵の背後にあるプルームの拡散拡散、または、毛状細胞細胞^26...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material