反义寡核苷酸临床试验中DMD患者样本的Exon跳过效率特征

摘要

在这里，我们介绍在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素38表达的分子特征。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，导致肌肉质量的逐渐丧失，导致过早死亡。突变往往导致读取框架失真和过早停止的鳕鱼，导致几乎完全缺乏肌营养不良蛋白。可使用诱导寡核苷酸（AON）纠正阅读框架，诱导外向跳过。morpholino AON viltolarsen（代号:NS-065/NCNP-01）已被证明诱导 exon 53 跳过，恢复 exon 52 删除患者的阅读框架。我们最近给DMD患者静脉注射了NS-065/NCNP-01的静脉注射，这是由探索性研究者发起的NS-065/NCNP-01首次人工试验。在本文的本文中，我们提出了在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素表达的分子特征。肌营养不良素表达的表征是显示疗效的基础研究，因为没有进行功能结果测试。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，导致肌肉质量逐渐丧失，呼吸衰竭和心肌病，并导致过早死亡^1。这种疾病是由缺乏大结构肌肉蛋白营养不良素^2引起的。X染色体上的DMD基因突变是隐性的，该病影响3500-5000名新出生男性^{中的1个,3，4，5。,5}突变往往是在外向44和55之间的热点区域大删除，导致扭曲的阅读框架和过早停止的鳕鱼，导致无稽之谈的调解衰变和几乎完全缺乏肌营养不良蛋白^{6，7，8。,7,8}阅读框架可以使用反义寡核苷酸（AONS）进行校正，这种蛋白能诱导外向跳跃并恢复阅读框架，部分恢复肌营养不良的表达，延缓^{疾病进展,9、10、11。,11}最近被联邦药物局（FDA）批准的奥菲诺奥·艾特普利森，诱导跳过exon 51，并可以恢复与exon 52删除^{12，13,的患者的阅读框架}。然而，exon 53跳过恢复患者的阅读框架与exon 52删除，它有可能治疗约10%的DMD患者¹⁴。Morpholino AON 药物 NS-065/NCNP-01 已被证明诱导 exon 53 在人类细胞中跳跃， 我们最近给DMD患者进行了第一期开放标签剂量升级临床试验（以下简称"研究"）（注册为UMIN:00010964和ClinicalTrials.gov:NCT02081625）14。¹⁴研究表明，根据基于西方印迹的RT-PCR和营养不良蛋白水平，剂量依赖性增加53，14日未观察到严重不良药物事件^或辍学。

在所有临床试验中，结果的分析至关重要。对于DMD临床试验，关于显示治疗效果的最佳方法的辩论仍在进行中。临床测试，如6分钟的步行测试有一些缺点。反营养不良素表达的分子表征可以使用多种方法进行，如RT-PCR、qPCR、数字PCR、西部印迹和免疫hito化学。然而，提供临床益处所需的蛋白质表达恢复程度仍不清楚。在这篇文章中，我们详细描述了RT-PCR和西方印迹方法，分别用于确定外延跳孔和蛋白质水平，在AON跳过药物NS-065/NCNP-01^{14的阶段试验}中。

研究方案

调查员启动的审判业务程序已获国家方案伦理委员会批准（批准ID:A2013-019）。

1. 肌肉样本的准备

注:比塞普斯胸围或四头肌肌肉通常被选为活检点。然而，头骨前被用于临床试验。

1. 患者的肌肉活检
   1. 在皮肤准备之前标记切口部位。
   2. 为活检标本准备盐水湿纱布。把纱布挤好。
   3. 将局部麻醉注射到皮肤和皮下组织，而不是注入肌肉。确保麻醉的深度，没有皮肤疼痛。
      注:一般麻醉一般用于15岁以下儿科患者。
   4. 切口从皮肤到皮下组织。使用小缩回器打开切口并分离皮下脂肪。
      注意:在此步骤中，可以切割部分皮肤，用于成纤维细胞培养。
   5. 在筋膜中再做一个小切口，进一步切开筋膜。用蚊子钳子夹住边缘以暴露肌肉。
   6. 使用缝合线拉起肌肉的选定部分。用虹膜剪刀做一条小隧道，把蚊子钳子插入隧道。
   7. 使用钳子分离肌肉束，并切割目标部分的两端。
      注:肌肉活检标本应大约在成人患者的铅笔大小（长度为1.0-1.5厘米，直径0.8-1.0厘米）。在儿科患者中，标本的长度应约为1厘米，直径应为5毫米。
   8. 将试样包裹在盐水湿润的纱布中，并在室温 （RT） 下立即将新鲜肌肉运送到可准备样品进行进一步分析的设施。
      注:如果运输时间超过 1 小时，样品应在 4 °C 下运输。

2. 肌肉样品制备

1. 混合等量的牙龈和水，直到口香糖变得柔软和粘稠。将混合物装入 25 mL 注射器中。注射器可以存放在冰箱中。
2. 将大约 0.5 至 1 厘米的牙龈放在软盘上。将光盘标记为另一侧。
3. 将一个异丙烷容器放在液氮中，直到一些液体结冰。
4. 将试样放在气管胶中。每个肌肉的纵向轴应垂直于软木塞。在每个肌肉底部放置口香糖，以帮助正确放置。
5. 使用钳子，将肌肉/软木标本放在步骤 2.3 中准备的冷异丙烷中进行冷冻。持续移动试样 1 分钟或直到完全冻结，并暂时放在干冰上。
6. 将样品放在玻璃瓶中，储存在-80°C。

3. 肌肉剖块

1. 设置低温恒温器，用于工作温度为 -25 °C 的截切。
2. 安装软木塞/肌肉块并修剪，直到达到平坦部分。
3. 使用 10 μm 的截面厚度进行 RT-PCR 和西印迹。分别使用6-8μm和10-12μm的厚度进行免疫组织化学或血氧素和eosin染色。将切片部分放入 2.0 mL 管中，并储存在 -80°C，用于 RT-PCR 和西印迹。

4. RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

1. 通过低温恒温器从冷冻肌肉中提取约10片厚度为10 μm的切片。使用总RNA的纯化试剂盒，根据制造商的说明收集纯化总RNA。
2. 使用分光光度计测量RNA浓度。
3. 根据表1，将RT-PCR反应所需的试剂组合在PCR 管中。有关 底图序列 ，请参阅表 2。
   注:患者NS-03的正向底注为44F，患者NS-07为46F。反向底像为 54/55R 作为默认值。如果非特定产品明显，则使用 54R 作为替代产品。
4. 将含有混合物的 PCR 管放入热循环器中。根据表3运行热 循环器。
5. 将 PCR 产品储存在 4 °C，用于短期存储，或 -20°C 长期存储。

5. 微芯片电泳和 exon 跳过计算

注:通常选择微芯片电泳系统（MCE）来分析执行效率。在此协议中，我们描述了制造商 A 以及制造商 B（以下简称系统 A 和 B）使用 MCE 系统分析 exon 跳过效率所需的步骤。在临床试验中，对系统 A 的 exon 跳过效率进行了分析。但是，系统 A 不再出售，我们建议系统 B 分析 exon 跳过效率。我们包括了两个系统的协议（系统 A 的 5.1 和系统 B 的 5.2 节）。有关 系统 A 和 B 的信息，请参阅材料表。此外，此步骤也可以执行与正常的阿加罗斯凝胶电泳，但灵敏度显著降低。

1. 使用系统 A 的微芯片电泳
   注:系统 A 有两种类型的芯片。在这里，我们描述DNA芯片的步骤。
   1. 平衡试剂（染色缓冲液、装载缓冲液、梯子和凝胶缓冲液）到RT、涡流和旋转。
   2. 要制备凝胶染色缓冲液 （GS），将 12.5 μL 的污渍缓冲液加入 250 μL 的凝胶缓冲液和涡流 10 s。将溶液以 2，400 x g 的旋转滤管和离心机移至离心机 15 分钟。丢弃过滤器。
      注:过滤后 GS 可储存在 4 °C 1 个月。
   3. 如果样品浓度高，用TE缓冲液或无DNase水稀释至约50纳克/μL。
      注:如果样品的盐浓度 = 200 mM KCl（或 NaCl）和/或 15 mM MgCl_2，则交换缓冲液。
   4. 将 12 μL 的 GS 溶液添加到 DNA 芯片的凝胶注水井（高亮和标记 GS）中，并将芯片放在注注站中。
      注:为避免气泡，在点胶时，垂直插入移液器尖端和井底。缓慢地分配到移液器上的第一个停止，并且不要排出移液步骤末端的空气。
   5. 选择 C3 模式，然后按"开始 " 按钮。注机完成后，取出芯片。
   6. 目视检查微通道有无陷空气气泡或注油不完整。
   7. 将准备好的样品和梯子加载到芯片上，如下所示。
      1. 将 9 μL 的 GS 溶液移入其他 3 个 GS 井。
      2. 移液 5 μL 的负载缓冲器进入 L 井和每个样品井 （1-11）。
      3. 移液 1 μL 的梯子进入 L 井。
      4. 将1 μL的DNA样品移入11个样品井中。
      5. 将 1 μL 的 TE 或无 DNase 水放入任何未使用的水井中。套件快速指南显示芯片布局图。
         注:通过将芯片保持为浅色背景上方，检查所有孔中有无气泡。用干净的移液器尖端或拆卸并重新装装溶液，清除井底任何受困的气泡。
   8. 将芯片放在涡流站中，然后按 "混合"。涡流站在 1 分钟后自动停止。
   9. 在装载后 5 分钟内在电泳站中运行芯片。
   10. 在软件工具栏中选择"新运行"。在"新运行"屏幕上，从"检测"下拉列表中选择 DNA 和DNA 1K。
   11. 从"项目"下拉列表中为 运行选择项目 文件夹，或者通过在"项目"字段中输入名称创建新 项目 文件夹。
   12. 在"运行前缀"字段中输入运行的名称，然后单击"开始运行"。
   13. 分析完成后，仪器发出蜂鸣音，并打开一个窗口，指示运行结束。选择 " 确定"并从芯片平台上卸下芯片。
   14. 选择 文件 |导出数据 以导出数据。在导出对话中选择 所需的 选项。
   15. 要清洁电极，请用 800 μL 的去电化水填充清洁芯片，并放在芯片平台上，合上盖子，然后关闭 1 分钟。1 分钟后，打开盖子，取出清洁芯片，让电极干燥 1 分钟。
2. 使用系统 B 的微芯片电泳
   1. 打开操作软件并输入示例信息。输入信息后，软件会自动计算分离缓冲区和标记解决方案的数量。
   2. 准备软件计算的必要分离缓冲区量。首先，用适当数量的TE缓冲液稀释10，000x溶液，准备100倍核酸凝胶染色溶液。100x 溶液可储存在-20°C。
   3. 将适当量的 100 倍核酸凝胶污渍与公司提供的特定管中分离缓冲液混合，以准备 1x 溶液。漩涡解决方案。
   4. 在管中准备所需数量的标记溶液。
   5. 启动探头清洗程序。
   6. 完成后启动微芯片清洗程序。
   7. 同时，将样品移液到PCR多板（96孔，清澈）中，用去电化水稀释4次。机器可处理的最小体积为 6 μL，最大体积为 30 μL。我们建议总体积为 10 μL（2.5 μL 样品和 7.5 μL 的水/TE 缓冲液）。
   8. 用粘合的 PCR 密封箔片盖住板，然后旋转样品。
   9. 根据机器显示的位置，在机器中设置板、标记溶液和 1x 分离缓冲液。按下" 开始" 按钮。
   10. 运行完成后，从软件将结果数据导出为 .csv 文件，并使用摩尔浓度计算 exon 跳过效率，如下所示:
       Exon 跳过效率 （%） = （跳过波段 / （跳过波段 + 非跳过波段） X 100

6. 补充DNA（cDNA）测序

1. 阿加罗斯凝胶制备
   1. 测量 1.5 g 的阿加罗斯粉末，将粉末与 100 mL 的 1x TAE 缓冲液混合在微可瓦的烧瓶中（产生 1.5% 的 agarose 凝胶）。
   2. 微波1-3分钟，直到红糖完全溶解。
      注意:不要过度冷却溶液，因为一些缓冲液会蒸发并改变凝胶的最终加糖百分比。
   3. 让加糖溶液冷却至约50°C。
   4. 在红糖溶液中加入10 μL 10，000x荧光核酸染料。
   5. 将加糖倒入凝胶托盘中，将井梳放在位上。在 RT 离开 20-30 分钟，直到它完全凝固。
2. 测 序
   1. 混合 5 μL 的 RT-PCR 产品（从步骤 4.4）和 1 μL 的 6x 加载缓冲液。将它们装入1.5%的加糖凝胶的孔中。
   2. 在 135 V 下运行凝胶 5 分钟，在 120 V 下运行 20 分钟。
   3. 根据制造商的协议，使用转发光器可视化频段。
   4. 从凝胶中清除感兴趣带，并使用凝胶和 PCR 清理套件检索 RT-PCR 产品。
   5. 使用分光光度计测量浓度。
      注:如果内部没有桑格测序设备，可发送纯化带在公司或测序设施进行测序。
   6. 根据表4，为循环测序试剂盒和移液器准备所需的试剂，放入多板PCR 板中。有关 底图序列 ，请参阅表 2。
   7. 用透明胶粘膜密封板。
   8. 旋转板2至3 s。在摆动桶离心机中短暂离心机，使内装物以 1，000 x g 稳定到井底 （5 至 10 s）。
      注:油井中可能存在气泡，但它们不会对反应产生负面影响。
   9. 将混合物放入热循环器中，然后按照表 5运行。
   10. 根据制造商的说明用板进行测序反应。
   11. 使用 DNA 分析仪根据制造商的协议确定序列。
   12. 将获得的序列与患者的预期序列进行比较。

7. 西印

1. 样品制备
   1. 准备 SDS 样品缓冲液（4% SDS、4 M 尿素、10% 2-二甲醇、10% 甘油、70 mM Tris-HCl pH 6.4、0.001% 布罗莫酚蓝色和蛋白酶抑制剂）。
   2. 将从低温截面中收集的约 100 片 10 μm 肌肉部分放在 150 μL 的 SDS 缓冲液中。
   3. 使用方便的微均质器，将冰上蛋白质样品简单均匀 30 秒。
   4. 在 16，500 x g 下离心 15 分钟，然后将上一液转移到新鲜管中。在 -80 °C 下继续分析或储存。
2. 用于蛋白质浓度测量的SDS-PAGE
   注:使用荧光凝胶染色来确定蛋白质浓度。
   1. 根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白质测定试剂盒确定正常健康控制样品重量和浓度。
   2. 准备凝胶电泳样品。移液10μg的总蛋白的健康控制和5μL的患者样品，5μL的4x样品缓冲液，2μL的10倍样品还原剂。混合后，将去维水加入每个样品中20 μL的最终体积。
   3. 在70°C加热样品10分钟。
   4. 使用 50 mL 的 40x SDS 运行缓冲区准备 2，000 mL 的 1x SDS 运行缓冲区。用1，950 mL的去化水稀释。
      注意:此时，1，000 mL 的运行缓冲区就足够了。剩余的 1，000 mL 缓冲液用于步骤 7.3.1。
   5. 彻底混合并留出 800 mL 的 1x SDS 运行缓冲液，用于凝胶盒的下（外）缓冲室。
   6. 电泳前，在 200 mL 的 1x SDS 运行缓冲液中加入 500 μL 的抗氧化缓冲液，用于凝胶盒的上（内）缓冲室。
   7. 根据制造商的协议，通过设置 3-8% 三丝醋酸凝胶来准备凝胶电泳。将每个样品的 20 μL 加载到凝胶上。
   8. 在 150 V 下执行电泳 75 分钟。
   9. 电泳后，将凝胶直接放入含有 50 mL 荧光凝胶染色溶液的清洁托盘中。
   10. 盖住托盘，放在摇摇器上，搅拌时不要溅液体或损坏凝胶 90 分钟。
   11. 在荧光系统中用 312 nm 照明进行成像之前，使用溴化乙基排放过滤器将凝胶转移到水中，以检测荧光。
   12. 根据使用已知浓度的正常控制lysate构建的分析曲线测量患者样本的浓度。
3. 用于西印迹的 SDS-PAGE
   1. 按照步骤 7.2.4-7.2.6 准备凝胶盒。
   2. 根据步骤7.2.11获得的浓度测量，健康控制利盐的每车道负载100μg，患者样本每通道300μg。使用与步骤 7.2.7 相同的设置的电泳。
4. 蛋白质转移
   1. 准备传输缓冲区。将PVDF膜浸泡在甲醇中20 s。将它移动到印迹缓冲区 B，直到使用。
   2. 将超厚的印迹纸浸泡在印迹缓冲器 A、B 和 C 中至少 30 分钟。
   3. 电泳后，将凝胶浸泡在印迹缓冲液B中5分钟。
   4. 根据图 1 中的图，将印迹纸、PVDF 膜和凝胶放在半干转 印机上。用滚筒在凝胶和膜之间滚出气泡。
   5. 在 RT 时以 2 mA/cm² 膜传输 1 小时。
      注:转移后，建议进行与庞塞奥染色类似的总蛋白染色，以确认大分子量蛋白的成功转移。
5. 阻塞和抗体染色
   1. 用 PBST 冲洗膜两次（1x PBS，0.1% Tween 20）。
   2. 将膜放在1%的阻滞剂中，在RT处轻轻摇动1小时以阻挡。
   3. 在阻断溶液（1:125）和抗光谱抗体（1:25，000）中用抗肌营养不良素抗体孵育膜，在RT下孵育1小时，或在4°C下过夜。
   4. 用RT的PBST清洗膜三次，每次10分钟。
   5. 在PBST（1:100）中用马萝卜过氧化物酶（HRP）结合的二次抗小鼠/兔子抗体孵育膜，在RT下孵育40分钟。
   6. 用RT的PBST再次清洗膜三次10分钟。
6. 检测
   1. 以 1:1 的比例混合检测解决方案 A 和 B。所需的检测试剂的最终体积为0.1 mL/cm² 膜。
   2. 从洗涤膜上去除多余的 PBST，并将其与蛋白质侧放在塑料包装片或其他合适的清洁表面上。将混合检测试剂加入膜，在RT下孵育5分钟。
   3. 通过将膜轻轻握在钳子中并触摸组织边缘，去除多余的检测试剂。
   4. 将印迹蛋白侧放在样品托盘上。根据用户文档操作荧光系统。设置机器如下。曝光类型:增量、间隔时间:10秒、灵敏度/分辨率:高。
      注:测量区域用蓝色矩形装箱（图4a-b）: BG: 背景;D: 肌营养不良素 427 kDa， SL: 光谱素β长等同形 （274 kDa）;SS:短等形（253 kDa）。消化不良/光谱信号比计算为（D-BG）/+（SL-BG）=（SS-BG）=。正常控制比率设置为 100%。

结果

若要使用 RT-PCR 来检测 exon 跳过，将设计和评估将跳过的 exon 两侧的底像仅生成特定波段（有关 exon 跳过和底像位置的示意图，请参阅图2）。如果 MCE 不可用，底向器应生成可按 MCE 系统尺寸或普通 agarose 凝胶电泳来区分的产品。图 3a显示了 MCE 系统 RT-PCR 反应的凝胶图像以及患者 NS-03 和 NS-07 在剂量升级阶段 1 试验中使用 NS-065/NCNP-01 治疗前和之后跳过带的测序结果。NS-03 和 NS-07 港湾删除分别跨越 exons 45-52 和 48-52。NS-03每周接受5毫克/千克和NS-07 20毫克/千克的NS-065/NCNP-01，每周12周。正如治疗前所预料的，两个患者都没有表现出跳过，只有一个非跳过带可以可视化。经过12周的治疗，NS-07的清晰跳过的下带被可视化。然而，仍然难以检测任何跳过的产品为患者NS-03。测序结果显示，NS-07的外显子47和54与NS-03的外显子44和54串联。根据序列，这些理论上可以产生功能性但缩短的肌营养不良素等同形式。要计算图3b 所示的跳过百分比，跳过带的摩尔浓度除以跳过带和未跳过带。对于患者NS-07，治疗后百分比为72%，NS-03为3.4%。来自患者 NS-03、NS-07 和健康对照的西部印迹数据（三重），如图4a 所示。预计，在治疗前未检测到肌营养不良素带。治疗后，检测到患者NS-07的带状物与健康控制相比分子量较低（野生型肌营养不良素的分子量为427 kDa，NS-07肌营养不良素的分子量为389 kDa）。由于外向删除和跳过，从患者NS-07的肌营养不良素等异形缺乏几个exon，它预计将有一个较低的分子量。患者NS-03治疗后未发现可检测的营养不良素水平。在图4bb中，与患者NS-07的健康对照相比，营养不良素的量。测量信号强度以计算肌营养不良素恢复的位置用蓝色方块表示。与健康对照组相比，用肌营养不良素的光谱比计算了肌营养不良素的量。为此，来自肌营养不良素减去背景的信号除以两个光谱等式等构体（长和短）减去背景的总和（见步骤8.6.5）。健康控制的比例设置为 100%。与患者NS-07治疗后的健康控制相比，肌营养不良素的量为9.1%。然而，由于弱的肌营养不良素带，无法计算患者的NS-03百分比，这类似于为两名患者的先前治疗样本获得的百分比。

图1:用于西部印迹分析的传输堆栈的示意图。 在底部浸透印迹缓冲液 A 中的西印迹转移堆栈组装，然后将印迹纸浸泡在印迹缓冲液 B、PVDF 膜、3-8% 三叶酸酯凝胶和浸泡在印迹缓冲液 C 中的 2 个印迹纸中。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:在DMD基因中，exon 45-52缺失的患者中 exon 53 的 exon 跳过的架构 绘制。 例如，患者NS-03在剂量升级临床试验有这种删除。如果保留 exon 53，则 mRNA 将退出帧，因为 exon 44 和 53 之间的 exon-exon 交汇点会中断读取帧，从而在 exon 53 中导致停止 codon。当跳过 exon 53 时，将恢复读取帧，并生成更短的肌营养不良素等构形式。要检测 RT-PCR 的 exon 53 跳过，使用 exon 44 和 54 中的底像，以便轻松检测跳过和未跳过 mRNA 之间的 PCR 产品。FWD: 前底图， REV: 反向底面， PMO: 磷酰胺形态寡聚物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:从头骨前肌肉活检样本中跳过患者NS-03和NS-07的效率。a） 电泳系统生成的凝胶图像，该图像包括未经处理和治疗的患者NS-03和NS-07的RT-PCR样本。上面板以三次三面显示 NS-03 和下面板 NS-07。对于 NS-03，未跳过的频带为 422 bp，跳过的频段为 212 bp。对于 NS-07，波段分别是 836 bp 和 624 bp。序列分析显示，NS-03 的 exon 44 和 exon 54 与 NS-07 的 exon 54 串联在一起。b）治疗前和治疗后跳过效率显示为患者NS-03和NS-07，根据系统 A 提供的两个波段的摩尔浓度计算为跳过带/（跳过带 + 未跳过带） x 100。NS-03治疗后跳过效率非常低;对于 NS-07，跳过效率超过 70%。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:在外向逃前和之后对肌病素等异形的蛋白质定量。a） 在 exon 跳过治疗之前和之后对肌营养不良素异构蛋白的蛋白质定量。从患者NS-03和NS-07治疗前的肌肉活检的西部斑点，以及三重健康控制。在427kDa上可以看到肌张丁条，用于健康控制，在389kDa上可以看到NS-07治疗后。治疗前不能为任何患者检测到营养不良素，或者对患者NS-03进行治疗后也检测出任何营养不良素。黑匣子中的区域如图4b所示。在每个印迹的左侧显示标记。b）患者NS-07治疗后恢复的肌营养不良素量。根据公式计算 Dystrophin 恢复基于肌营养不良素、背景和光谱的长和短等同形波段的强度计算，公式为:（肌营养不良素 - 背景）/（光谱 L - 背景） = （光谱 S - 背景），其中健康控制的比例设置为 100%。每个波段的强度在图中显示的蓝色框内测量。NS-07的肌营养不良素恢复率为9.1%。肌营养不良信号太弱，无法测量未经处理的样品。标记大小以千达吨表示。Dys: 肌萎缩素， Bg: 背景， Sl: Spectrin 长等同形式， SS: Spectrin 短等构形式， 我的: 肌素类型 1。标记大小以千达吨表示。请单击此处查看此图的较大版本。

解决 方案	体积/反应 （μl）	最终浓度
无 RNase 水（提供）	变量	-
5x QIAGEN 一步 RT-PCR 缓冲器	5.0	1x
dNTP 混合（包含每个 dNTP 的 10 mM）	1.0	每个 dNTP 的 400 μM
前向底图 （10 μM）	1.5	0.6 μM
反向底图 （10 μM）	1.5	0.6 μM
QIAGEN 一步 RT-PCR 酶混合	1.0	-
RNase 抑制剂（可选）	变量	5~10个单位/反应
模板RNA	50纳克
总	25

表1:RT-PCR试剂。 RT-PCR 一次反应所需的化合物。

底漆	序列
44F	5'-CCTGAGAGCATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAGGCAA-3'
48F	5'-CCAAGAGACATGG-3'
54/55R	5'-TTCTCTCACTCCCCT-3'
54R	5'-GTGGACTTTATCAT-3'

表2:底图列表。 本研究中使用的底项的序列。F:向前，R:反向。

1 周期	逆转录	30分钟	50 °C
1 周期	初始 PCR 激活步骤	15 分钟	95 °C
35 周期	变性	1 分钟	94 °C
	退火	1 分钟	60 °C
	扩展	1 分钟	72 °C
1 周期	最终延期	7 分钟	72 °C
保持		∞	4 °C

表3:使用PCR条件。 显示 RT-PCR 反应的 PCR 条件。

解决 方案	体积/反应 （μl）
无 RNase 水	变量
Bigdye 终结者 3.1 就绪反应混合	3.5
前进底图/反向底图 （3.2 μM）	2.0
模板RNA	20 纳克
总	20

表4:测序反应所需的试剂。 在设置中使用"向前"或"反向"底因为，而不是同时使用两者。

1 周期	1 分钟	96 °C
25 周期	10 s	96 °C
	5 s	50 °C
	4 分钟	60 °C
保持	∞	4 °C

表5:桑格测序的PCR条件。

讨论

DMD 的临床试验在上些年取得了成功和失败。RT-PCR 和西方印迹都是用于评估给患者施用的 exon 跳过化合物产生的跳过效率的常见技术。然而，据报道，与数字PCR¹⁵相比，RT-PCR高估了跳过效率。尽管这是由于许多原因造成的，但这主要是由于 PCR 周期中较小跳过的片段的更高效放大。与西方印迹估计的蛋白质表达相比，这次临床试验中使用的RT-PCR似乎也产生了更高的跳过效率。根据FDA，这是一个更可靠的方法量化肌营养不良素恢复^12。因此，在解释RT-PCR跳过结果时应谨慎行事;然而，样品仍然可以比较。在西方印迹分析中，显示更高跳过效率的样本通常可提高蛋白质表达水平。

由于 DMD 临床试验中的所有患者没有相同的删除模式，因此很难设计出足够特定的底器和探针，以便在所有样品上执行数字或 qPCR。因此，RT-PCR 仍然是首次评估跳过效率的一个很好的替代方案。在NS-065/NCNP-01的临床试验开始之前，评估每个患者体外跳过效率是乏味的，因为肌肉或皮肤活检是强制性的，以产生患者特异性肌细胞。然而，我们最近出版了一种新的技术，以产生患者特定的 MYOD1 转换，尿液衍生细胞 （UDC） 作为一个新的 DMD 肌肉细胞模型¹⁶。因此，只需要从患者那里收集的尿液才能产生肌细胞，并且不需要侵入性手术。我们相信，这种方法可用于筛选患者特异性细胞中不同的 AON。此外，在患者开始任何临床试验之前，可以测试不同的底剂和探针。这可以帮助在未来的DMD临床试验中使用qPCR或数字PCR进行外向跳过测量。

在本次临床试验中，用于进行西印分析，使用单一的抗肌营养不良素抗体，仅使用一种健康对照作为参考样本。因此，抗体的特异性没有得到适当的验证。这一点，加上抗体只识别肌营养不良素的C-终端域，是协议的一个限制。今后，建议对针对肌营养不良素分子不同领域的进行更健康的对控和抗体。

在这里，我们总结了最近由探索性调查员发起的NS-065/NCNP-01人类试验中使用的协议。NS-065/NCNP-01 可能适用于 10.1% 的 DMD 患者。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA Ladder	Takara	3407A	marker solution for MultiNA
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)	Nacalai	35436-01
2-mercaptoethanol	Nacalai	21418-42
2-Methylbutane (Isopentane)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352235
6× Loading Buffer	Takara	9156
Agarose ME	Iwai chemical	50013R
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337455
Bovine Serum Albumin solution	Sigma-Aldrich	A8412
Bromophenol blue	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-Well Plates	Applied Biosystems	4367819
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime Blocking Reagent	GE healthcare	RPN418
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE healthcare	RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion Automated Electrophoresis Station	Bio-Rad	7007010	Microchip electrophoresis system A
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips	Bio-Rad	7007107JA
Experion Priming Station	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
Extra Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003
glass vial	Iwaki	1880 SV20
Glycerol	Nacalai	17045-65
Histofine Simple Stain MAX PO	Nichirei	424151
Horse Serum	Gibco	16050122
Immobilon-P Transfer Membrane	Millipore	IPVH304F0
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Microchip electrophoresis system B
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041
Oriole Fluorescent Gel Stain	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron Handy micro-homogenizer	MICROTEC	NS-310E3
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003
Propidium Iodide Staining Solution	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit	Qiagen	210212
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
Semi-dry transfer machine	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494	for MultiNA
TAE Buffer	Nacalai	35430-61
Tragacanth Gum	Wako	200-02245
Tris-EDTA Buffer	Nippon Gene	316-90025	for MultiNA
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Urea	Nacalai	35907-15
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001