JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין 38 באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני.

Abstract

ניוון שרירים דושן (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמים לאובדן הדרגתי של מסת שריר, המוביל למוות בטרם עת. המוטציות גורמות לעתים קרובות למסגרת קריאה מעוותת ולפגן בקוביות עצירה מוקדמות, וכתוצאה מכך חוסר כמעט מוחלט בחלבון דיסטרופין. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג. morpholino AON viltolarsen (שם קוד: NS-065/NCNP-01) הוצג כדי לגרום exon 53 דילוג, שחזור מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות. לאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 דרך וירדות לחולים DMD ב חוקר ביוזמת חוקר, ניסוי ראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. במאמר שיטות זה, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני. האפיון של ביטוי דיסטרופין היה בסיסי במחקר להצגת היעילות מאז לא בוצעו בדיקות תוצאה פונקציונלית.

Introduction

ניוון שרירים Duchenne (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמת לאובדן הדרגתי של מסת שריר, כשל נשימתי, קרדיומיופתיה, וזה מוביללמוות בטרם עת 1. המחלה נגרמת על ידי חוסר דיסטרופין חלבון שריר מבני גדול2. מוטציות בגן DMD על כרומוזום X הם רצסיביים, והמחלה משפיעה 1 ב 3500-5000 זכרים שזהם נולד 3,,4,,5. המוטציות הן לעתים קרובות מחיקות גדולות באזור נקודה חמה בין exons 44 ו 55 שמובילים למסגרת קריאה מעוותת וקודונים עצירה מוקדמת, גרימת ריקבון בתיווך שטויות וחוסר כמעט מוחלט של חלבון דיסטרופין6,,7,8. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג ושחזור של מסגרת הקריאה, שחזור חלקי של ביטוי דיסטרופין ועיכוב התקדמותהמחלה 9,10,11. morpholino AON eteplirsen, אשר אושרה לאחרונה על ידי סוכנות התרופות הפדרלית (FDA), גורם דילוג של exon 51 והוא יכול לשחזר את מסגרת הקריאה בחולים עם exon 52מחיקות 12,13. עם זאת, exon 53 דילוג משחזר את מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות, וזה יכול לטפל פוטנציאלית כ 10% של חולי DMD14. NS-065/NCNP-01 morpholino התרופה NS-065/NCNP-01 כבר הראה לגרום exon 53 דילוג בתאים אנושיים, ולאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 לחולים DMD בשלב 1 פתוח תווית מינון הסלמה ניסוי קליני (להלן, המכונה "המחקר") (רשום כUMIN: 000010964 ו ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. המחקר הראה עלייה תלויה במינון של exon 53 דילוג בהתבסס על RT-PCR ורמות חלבון דיסטרופין המבוסס על כתמים מערביים, ולא תופעות לוואי חמורות או נושריםנצפו 14.

בכל הניסויים הקליניים, הניתוח של התוצאות הוא בעל חשיבות עליונה. עבור ניסויים קליניים DMD, דיון הוא עדיין מתמשך לגבי השיטה הטובה ביותר כדי להראות יתרון טיפול. לבדיקות קליניות כגון בדיקת הליכה של 6 דקות יש חסרונות מסוימים. אפיון מולקולרי של ביטוי הדיסטרופין יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות, כגון RT-PCR, qPCR, דיגיטלי-PCR, כתמים מערביים, וimmunohistoistoistry. עם זאת, היקף שיקום ביטוי החלבון הנדרש כדי להקנות תועלת קלינית נותר לא ברור. במאמר שיטות זה, אנו מתארים בפירוט את RT-PCR ושיטות ההתנפחות המערביות המשמשות לקביעת רמות האקסון ורמות החלבון, בהתאמה, בניסוי שלב 1 של AON דילוג על התרופה NS-065/NCNP-0114.

Protocol

ההליך המבצעי של הניסוי ביוזמת החוקר אושר על ידי הוועדה האתית של NCNP (מזהה אישור: A2013-019).

1. הכנת דגימות שרירים

NOTE: Biceps brachii or quadriceps muscles are often selected as biopsy sites. עם זאת, הקדמי השוקיאלי שימש בניסוי הקליני.

  1. ביופסיית שרירים מחולים
    1. סמן את אתר החתך לפני הכנת העור.
    2. הכן גזה לחה בתמיסת מלח לדגימה הביופסיה. סוחטים היטב את הגזה.
    3. להזריק הרדמה מקומית לתוך העור ורקמות תת עוריות, אבל לא לתוך שריר. ודא לעומק ההרדמה על ידי היעדר כאב ים.
      הערה: הרדמה כללית משמשת בדרך כלל בחולים ילדים מתחת לגיל 15.
    4. לעשות חתך מהעור לרקמות תת עוריות. השתמשו במפשפים קטנים כדי לפתוח את החתך ולהפריד את השומן התת עורי.
      הערה: בשלב זה, חלק מהעור ניתן לחתוך עבור תרבות פיברובלסט.
    5. לעשות עוד חתך קטן בפאשיה ולחתוך את fascia עוד יותר. מהדק את הקצוות באמצעות מלחציים יתושים כדי לחשוף את השריר.
    6. השתמש בתפר כדי למשוך את החלק הנבחר של השריר. הפוך מנהרה קטנה באמצעות מספריים איריס ולהכניס מפס יתושים לתוך המנהרה.
    7. הפרד את חבילת השריר באמצעות מקצות וחתוך את שני הקצוות של חלק היעד.
      הערה: דגימות ביופסיה שריר צריך להיות סביב הגודל של עיפרון עבור חולים מבוגרים (אורך 1.0-1.5 ס"מ, קוטר 0.8-1.0 ס"מ). הדגימה צריכה להיות סביב 1 ס"מ אורך ו 5 מ"מ קוטר בחולים ילדים.
    8. עטו את הדגימה בגזה לחה בתמיסת מלח והעבירו את השריר הטרי בטמפרטורת החדר (RT) באופן מיידי למתקן שבו ניתן להכין את הדגימה לניתוח נוסף.
      הערה: יש להעביר את הדגימות ב-4°C אם משך ההובלה עולה על שעה אחת.

2. הכנת מדגם שריר

  1. מערבבים כמויות שוות של מסטיק ומים טראגנת עד שהמסטיק הופך רך ודביק. טוענים את התערובת למזרקים של 25 מ"ל. ניתן לאחסן את המזרקים במקרר.
  2. מניחים כ-0.5-1 ס"מ של מסטיק טרגנטה על דיסקי שעם. תייג את הדיסקים בצד השני.
  3. מניחים מיכל איזופנטן בחנקן נוזלי עד שחלק מהנוזל קופא.
  4. שים את הדגימה במסטיק הטראגנת. הציר האורך של כל שריר צריך להיות ניצב לפקק. מניחים מסטיק סביב החלק התחתון של כל שריר כדי לעזור מיקום נכון.
  5. באמצעות פינצטה, מניחים את הדגימה שריר / שעם ב isopentane קר מוכן בשלב 2.3 כדי להקפיא. מעבירים את הדגימה כל הזמן למשך דקה או עד להקפאה מוחלטת, ומעבירים על קרח יבש באופן זמני.
  6. מניחים את הדגימה בקבוקונים מזכוכית ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.

3. מקטע שרירים

  1. הגדר את ההקפאה למקטע עם טמפרטורת עבודה של -25 °C.
  2. הר את בלוק שעם / שריר לקצץ עד מקטעים שטוחים מושגת.
  3. השתמש בעובי מקטע של 10 μm עבור RT-PCR וכתמים מערביים. השתמש בעובי של 6-8 μm ו 10-12 μm עבור אימונוהיסטוכימיה או haematoxylin ו כתמים אאוסין, בהתאמה. לשים מקטעים חתוכים בצינורות 2.0 מ"ל ולאחסן ב -80 °C עבור RT-PCR וכתמים מערביים.

4. מיצוי RNA ותעתוק הפוך תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR)

  1. לחלץ כ 10 פרוסות עם עובי 10 μm משריר קפוא על ידי cryostat. אסוף את ה-RNA הכולל המטוהר באמצעות ערכת הטיהור של RNA הכולל בהתאם להוראות היצרן.
  2. למדוד את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. שלב את הריאגנטים הדרושים לתגובת RT-PCR בצינורות PCR בהתאם לשולחן 1. ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר.
    הערה: פריימר קדימה היה 44F עבור חולה NS-03 ו 46F לחולה NS-07. הפרימר ההפוך היה 54/55R כברירת מחדל. אם מוצרים לא ספציפיים היו ברורים, 54R שימש כחלופה.
  4. מניחים את צינורות ה-PCR המכילים את התערובת במחזור תרמו. הפעל את מחזור התרמו לפי טבלה 3.
  5. אחסן מוצר PCR ב- 4°C לאחסון לטווח קצר או -20°C לאחסון לטווח ארוך.

5. אלקטרופורזה שבב ואקסון דילוג חישוב

הערה: מערכת אלקטרופורזה שבב (MCE) נבחרה לעתים קרובות כדי לנתח exon דילוג יעילות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים הדרושים כדי לנתח את האקסון דילוג יעילות באמצעות מערכת MCE על ידי יצרן A, כמו גם מיצרן B, להלן נקרא מערכת A ו- B. במהלך הניסוי הקליני, האקסון דילוג יעילות נותח על מערכת א'. עם זאת, מערכת א' כבר לא למכירה, ואנחנו ממליצים למערכת ב' לנתח את היעילות של exon. כללנו פרוטוקולים עבור שתי המערכות (ראה סעיף 5.1 עבור מערכת א' ו- 5.2 עבור מערכת ב'). ראה טבלת חומרים לקבלת מידע אודות מערכת א' ו- ב'. יתר על כן, צעד זה יכול להתבצע גם עם אלקטרופורזה ג'ל agarose נורמלי, אבל הרגישות פוחתת במידה ניכרת.

  1. אלקטרופורזה שבב באמצעות מערכת A
    הערה: מערכת A כוללת שני סוגים של שבבים. כאן, אנו מתארים את השלבים לשבב ה-DNA.
    1. Reagents ערכת שיוויון (מאגר כתמים, מאגר טעינה, סולם, מאגר ג'ל) RT, מערבולת, וספין למטה.
    2. כדי להכין מאגר ג'ל-כתם (GS), להוסיף 12.5 μL של מאגר כתמים 250 μL של מאגר ג'ל ומערבולת עבור 10 s. העבר את הפתרון לצינור מסנן ספין וצנטריפוגה ב- 2,400 x g למשך 15 דקות. מחק את המסנן.
      הערה: ניתן לאחסן את GS המסונן ב- 4 °C למשך חודש אחד.
    3. אם הדגימות מרוכזות מאוד, תדלל לכ-50 ng/μL עם מאגר TE או מים ללא דינאז.
      הערה: אם הדגימות נמצאות בריכוז מלח - 200 mM KCl (או NaCl) ו/או 15 mM MgCl 2 ,להחליףאת המאגר.
    4. הוסף 12 μL של תמיסת GS לג'ל ג'ל ג'ל גם (מודגש ומתויג GS) של שבב ה-DNA ולמקם את השבב בתחנת התגנדרות.
      הערה: כדי להימנע מבועות אוויר, הכנס את קצה הפיפטה אנכית ולתחתית הבאר בעת חלוקת. לוותר לאט על העצירה הראשונה על הפיפטה, ולא לגרש אוויר בסוף שלב pipetting.
    5. בחר מצב C3 ולחץ על לחצן התחל. לאחר השלמת ההתגנדרות, הסר את השבב.
    6. בדוק באופן חזותי את המיקרו-תכנים אחר בועות אוויר לכודות או גנדרנות לא שלמה.
    7. טען את הדגימות המוכן ואת הסולם על השבב כמטהלן.
      1. פיפט 9 μL של פתרון GS לתוך 3 בארות GS האחרות.
      2. פיפטה 5 μL של מאגר טעינה לתוך באר L וכל מדגם היטב (1-11).
      3. פיפט 1 μL של סולם לתוך באר L.
      4. פיפט 1 μL של דגימת DNA לתוך כל אחת 11 בארות מדגם.
      5. פיפט 1 μL של TE או מים ללא DNase לתוך כל בארות שאינן נו.ג'י. המדריך המהיר של הערכה מציג דמות של פריסת השבב.
        הערה: בדוק את כל בארות עבור בועות אוויר על-ידי החזקת השבב מעל רקע בצבע בהיר. להוציא כל בועות אוויר לכוד בתחתית באר עם קצה פיפטה נקי או על ידי הסרה וטעון מחדש של הפתרון.
    8. מניחים את השבב בתחנת המערבולת ולחץ על Mix. תחנת המערבולת עוצרת באופן אוטומטי לאחר דקה אחת.
    9. הפעל את השבב בתחנת האלקטרופורזה בתוך 5 דקות של טעינה.
    10. בחר הפעלה חדשה בסרגל הכלים של התוכנה. במסך 'הפעלה חדשה', בחר דנ"א ו-DNA 1K מהרשימה המפוקנשלת של Assay. DNA
    11. בחר תיקיית פרוייקט עבור הריצה מהרשימה המרשימה הנשלפת של Project או צור תיקיית פרוייקט חדשה על-ידי הזנת שם בשדה Project.
    12. הזן שם עבור הריצה בשדה הפעל קידומת ולחץ על התחל הפעלה.
    13. המכשיר מצפצף כאשר הניתוח הושלם, ונפתח חלון המציין את סוף הריצה. בחר אישור והסר את השבב מפלטפורמת השבבים.
    14. בחר קובץ | יצא נתונים כדי לייצא את הנתונים. בחר את האפשרויות הרצויות בתיבת הדו-שיח ייצוא.
    15. כדי לנקות את האלקטרודות, מלא שבב ניקוי עם 800 μL של מים deionized ולמקם אותו על פלטפורמת השבבים, לסגור את המכסה, ולהשאיר אותו סגור במשך 1 דקות. לאחר דקה, פתחו את המכסה, הסירו את שבב הניקוי ואפשרו לאלקטרודות להתייבש למשך דקה.
  2. אלקטרופורזה שבב באמצעות מערכת B
    1. פתח את תוכנת ההפעלה והזן את המידע לדוגמה. לאחר הזנת המידע, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את כמות ההפרדת פתרונות מאגר וסמן.
    2. הכן את הכמות הדרושה של הפרדת מאגר המחושבת על-ידי התוכנה. ראשית, להכין 100x תמיסת כתם ג'ל חומצה גרעין על ידי דילול פתרון 10,000x עם הכמות המתאימה של מאגר TE. ניתן לאחסן את פתרון 100x ב- -20 °C.
    3. לערבב כמות מתאימה של 100x גרעין חומצה ג'ל כתם עם חיץ בצינור הספציפי שסופק על ידי החברה כדי להכין פתרון 1x. מערבולת הפתרון.
    4. הכן את הכמות הנדרשת של פתרון סמן בצינור.
    5. הפעל את תוכנית שטיפת הגשושים.
    6. הפעל את תוכנית שטיפה שבב כאשר סיים.
    7. בו זמנית, פיפטה הדגימות לתלת PCR (96-באר, ברור) ולדלל 4 פעמים עם מים deionized. הנפח המינימלי שההמכונה יכולה לטפל בו הוא 6 μL, והמקסימום הוא 30 μL. אנו מציעים נפח כולל של 10 μL (2.5 μL של מדגם ו 7.5 μL של מים / TE-מאגר).
    8. מכסים את הלוחות בנייר כסף דביק של איטום PCR וסובבים את הדגימות.
    9. הגדר את הלוח, פתרון הסמן ומאגר ההפרדה של 1x במחשב בהתאם למיקום המוצג על-ידי המחשב. לחץ על לחצן התחל.
    10. לאחר סיום הריצה, יצא את נתוני התוצאה כקובץ .csv מהתוכנה וחשב את יעילות exon דילוג באמצעות ריכוז טוחנות כדלקמן:
      Exon דילוג יעילות (%) = (רצועה מדלג / (רצועה מדלג + רצועה לא מדלג) X 100

6. רצף DNA משלים (cDNA)

  1. הכנת ג'ל אגרוז
    1. למדוד 1.5 גרם של אבקת agarose ולערבב את האבקה עם 100 מ"ל של 1x מאגר TAE במבחנות microwavable (וכתוצאה מכך 1.5% ג'ל agarose).
    2. מיקרוגל במשך 1-3 דקות עד agarose מומס לחלוטין.
      הערה: אין להגזים בתמיסה, שכן חלק מהמאגר יתאדה ותשנה את אחוז ההתפתלה הסופי של הג'ל.
    3. תנו לפתרון ה-agarose להתקרר ל-50 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף 10 μL 10,000x צבע חומצה פלורסנט גרעין לתמיסת agarose.
    5. יוצקים את האגרוז למגש ג'ל עם המסרק במקום. להשאיר ב RT במשך 20-30 דקות עד שהוא התגבש לחלוטין.
  2. רצף (רצף)
    1. ערבב 5 μL של מוצר RT-PCR (משלב 4.4) ו μL אחד של מאגר טעינה 6x. העמיסו אותם לבארות של 1.5% ג'ל אגז.
    2. הפעל את הג'ל ב- 135 V למשך 5 דקות ו- 120 V למשך 20 דקות.
    3. דמיין את הרצועות באמצעות טרנסילומבינטור בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    4. Excise להקות עניין מן הג'ל ולהשתמש ג'ל וערכת ניקוי PCR כדי לאחזר מוצרי RT-PCR.
    5. למדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: ניתן לשלוח את הרצועה המטוהרת לצורך רצף בחברה או במתקן רצף אם אין ציוד רצף של Sanger זמין בתוך הבית.
    6. הכן את הריאגנטים הנדרשים עבור ערכת רצף מחזור ופיפטה לתוך לוח PCR multiplate על פי טבלה 4. ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר.
    7. אטמו את הצלחת עם סרט דבק צלול.
    8. מערבולת הצלחת עבור 2-3 s. צנטריפוגה לזמן קצר צנטריפוגה דלי מתנדנד, כך התוכן להתיישב לתחתית של בארות (5 עד 10 s) ב 1,000 x g.
      הערה: בועות אוויר עשויות להיות קיימות בארות, אך הן אינן משפיעות לרעה על התגובה.
    9. מניחים את התערובת במחזור תרמו ורוצים לפי טבלה 5.
    10. טהר את תגובות ההתפתלים עם צלחות בהתאם להוראות היצרן.
    11. השתמש במנתח DNA כדי לקבוע את הרצפים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    12. השווה את הרצף שהושג לרצף הצפוי של המטופל.

7. כתמים מערביים

  1. הכנה לדוגמה
    1. להכין מאגר מדגם SDS (4% SDS, 4 M אוריאה, 10% 2-mercaptoethanol, 10% גליצרול, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% ברומופנול כחול, מעכב פרוטאז).
    2. מניחים סביב 100 פרוסות של 10 μm מקטעים שריר שנאספו מ cryo-sectioning ב 150 μL של מאגר SDS.
    3. בקצרה homogenize דגימות חלבון על קרח עבור 30 s באמצעות הומוגנייזר מיקרו שימושי.
    4. צנטריפוגה ב 16,500 x g עבור 15 דקות, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. המשך בניתוח או בחנות ב- -80 °C.
  2. SDS-PAGE למדידת ריכוז חלבונים
    הערה: כתם ג'ל פלורסנט שימש כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
    1. לקבוע את המשקל הרגיל של מדגם בקרה בריאה ואת הריכוז באמצעות ערכת אסאי חלבון BCA על פי הוראות היצרן.
    2. הכן את הדגימות לאלקטרופורזה ג'ל. פיפטה 10 μg של חלבון כולל של שליטה בריאה 5 μL של דגימות המטופל, 5 μL של מאגר מדגם 4x, 2 μL של סוכן הפחתת מדגם 10x. לאחר אלה כבר מעורב, להוסיף מים deionized לנפח הסופי של 20 μL בכל מדגם.
    3. דגימות חום ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. הכן מאגר פועל של 2,000 מ"ל של מאגר SDS אחד באמצעות מאגר פועל של 50 מ"ל של 40x SDS. דלל עם 1,950 מ"ל של מים שהם לאיון.
      הערה: בשלב זה, 1,000 מ"ל של מאגר פועל מספיק. מאגר 1,000 מ"ל הנותרים משמש בשלב 7.3.1.
    5. מערבבים היטב ומניחים בצד 800 מ"ל של מאגר הריצה של 1x SDS לשימוש בתא החיץ התחתון (החלקי) של קופסת הג'ל.
    6. מיד לפני אלקטרופורזה, להוסיף 500 μL של מאגר נוגד חמצון 200 מ"ל של 1x SDS פועל מאגר לשימוש בתא החיץ העליון (הפנימי) של תיבת הג'ל.
    7. היכונו לאלקטרופורזה ג'ל על ידי הגדרת 3-8% Tris-אצטט ג'ל על פי פרוטוקול היצרן. טען 20 μL של כל דגימה על הג'ל.
    8. בצע אלקטרופורזה ב- 150 V במשך 75 דקות.
    9. לאחר אלקטרופורזה, מניחים את הג'ל ישירות במגש נקי המכיל 50 מ"ל של תמיסת כתם ג'ל פלורסנט.
    10. מכסים את המגש, מניחים על שייקר, ומתסיסים מבלי להתיז נוזל או לפגוע בג'ל במשך 90 דקות.
    11. להעביר את הג'ל לתוך מים לפני הדמיה במערכת פלואורסץ ב 312 ננ"מ תאורה עם מסנן פליטת אתידיום ברומיד כדי לזהות פלואורסץ.
    12. למדוד את ריכוזי דגימות המטופל בהתבסס על עקומה אנליטית שנבנתה באמצעות השליטה הרגילה בריכוז ידוע.
  3. SDS-PAGE עבור כתמים מערביים
    1. הכן את תיבת הג'ל בהתאם לצעדים 7.2.4-7.2.6.
    2. בהתבסס על מדידת הריכוז שהתקבלה בשלב 7.2.11, לטעון 100 μg לכל נתיב של שליטה בריאה lysate ו 300 μg לכל נתיב של מדגם המטופל. אלקטרופורזה המשתמשת באותן הגדרות כמו שלב 7.2.7.
  4. העברת חלבונים
    1. הכן את מאגר ההעברה. להשרות קרום PVDF עבור 20 s ב מתנול. מעביר אותו למאגר הכתמים B עד לשימוש.
    2. השרים נייר סופג עבה במיוחד במאגר כתמים A, B ו- C למשך 30 דקות לפחות לכל מאגר.
    3. לאחר אלקטרופורזה, להשרות את הג'ל במאגר סופג B במשך 5 דקות.
    4. מניחים ניירות כתמים, קרום PVDF וג'ל על מכונת ההעברה החצי יבשה על פי הציור באיור 1. לגלגל בועות אוויר בין הג'ל וממברנה עם רולר.
    5. מעבירים ב- 2 mA/cm2 קרום למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: לאחר ההעברה, מומלץ לבצע כתם חלבון כולל דומה להכתמת פונסו כדי לאשר העברה מוצלחת של חלבוני משקל מולקולריים גדולים.
  5. חסימה וכתמים נוגדנים
    1. לשטוף את הממברנה פעמיים עם PBST (1 pBS עם 0.1% Tween 20).
    2. מניחים את הממברנה ב-1% חוסמים, ומנענעים בעדינות למשך שעה אחת ב-RT כדי לחסום.
    3. דגירה קרום עם נוגדן נגד דיסטרופין בחסימת פתרון (1:125) ונוגדן אנטי ספקטריני (1:25,000) עבור 1 שעה ב RT או לילה ב 4 ° C.
    4. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBST ב RT.
    5. דגירה קרום עם חזרת peroxidase (HRP)-conjugated נוגדן נגד עכבר / ארנב ב PBST (1:100) במשך 40 דקות ב RT.
    6. לשטוף את הממברנה שוב שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBST ב RT.
  6. זיהוי וזיהוי
    1. ערבב פתרונות זיהוי A ו- B ביחס של 1:1. הנפח הסופי של רייגנט זיהוי הנדרש הוא 0.1 מ"ל / ס"מ2 קרום.
    2. הסר את ה-PBST העודף מהממברנה השטופה והניחו אותו עם צד החלבון על יריעת ניילון נצמד או משטחים נקיים מתאימים אחרים. מוסיפים את reagent זיהוי מעורב על קרום דגירה במשך 5 דקות ב RT.
    3. הסר את עודף הזיהוי מחדשגנט על ידי החזקת הממברנה בעדינות במקציות ולגעת בקצה נגד רקמה.
    4. מניחים את צד החלבון על מגש דגימה. הפעלת מערכת הפלורסנט בהתאם לתיעוד המשתמש. הגדר מחשב כדלקמן. סוג חשיפה: תקרה, מרווח זמן: 10 שניות, רגישות/רזולוציה: גבוהה.
      הערה: אזורים נמדדו היו בקופסה עם מלבן כחול (איור 4a-b): BG: רקע; ד: דיסטרופין 427 kDa, SL: ספקטרין בטא ארוך isoform (274 kDa); SS: isoform קצר (253 kDa). יחס האות דיסטרופין/ספקטרין חושב כ- (D-BG)/[SL-BG) + (SS-BG)]. היחס של שליטה רגילה נקבע כ-100%.

תוצאות

כדי להשתמש ב- RT-PCR כדי לזהות דילוג על exon, פריימרים משני צדי האקסון שידלגו עליהם תוכננו והוערכו כדי להניב להקות ספציפיות בלבד (ראה איור 2 עבור דיאגרמה סכמטית של דילוג אקסון ומיקום פריימר). פריימרים צריך ליצור מוצרים שניתן להבחין בקלות לפי גודל על מערכת MCE או אלקטרופורזה ג'ל agarose נורמלי אם MCE אינו זמין. איור 3מראה מערכת MCE תמונות ג'ל של תגובות RT-PCR ואת תוצאות ה רצף של הלהקה דילג מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי טיפול עם NS-065/NCNP-01 בניסוי שלב 1 של הסלמה במינון. מחיקות נמל NS-03 ו-NS-07 המשתרעות על פני 45-52 ו-48-52, בהתאמה. NS-03 קיבל 5 מ"ג/ק"ג ו-NS-07 20 מ"ג/ק"ג של NS-065/NCNP-01 שבועי במשך 12 שבועות. כצפוי לפני הטיפול, שני החולים לא הראו דילוגים, ורק להקה שלא דילגה עליה ניתן היה לדמיין. לאחר 12 שבועות של טיפול, להקה נמוכה מדלג ברור היה לדמיין עבור NS-07. עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר מדלג עבור חולה NS-03. תוצאות ההתלתה הראו שרשור של exons 47 ו-54 עבור NS-07, כמו גם exons 44 ו-54 עבור NS-03. על פי הרצף, אלה יכולים תיאורטית לייצר איזופורם דיסטרופין פונקציונלי אך מקוצר. כדי לחשב את אחוזי דילוג המוצג באיון 3b, ריכוז החתרנות הטוחנת עבור הלהקה שמדלגת חולקה על-ידי הרצועה שמדלגים עליה ובטלה דילגה עליה. עבור חולה NS-07, האחוז לאחר הטיפול היה 72%, וזה היה 3.4% עבור NS-03. נתוני כתם מערבי (בשלושה רישיות) מחולים NS-03, NS-07, ושליטה בריאה מוצגים איור 4a. כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין לפני הטיפול. לאחר הטיפול להקה ממטופל NS-07 זוהתה עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לבקרה בריאה (דיסטרופין סוג פראי יש משקל מולקולרי של 427 kDa, ו NS-07 dystrophin יש משקל מולקולרי של 389 kDa). בגלל המחיקה exon ודילוג, isoform דיסטרופין ממטופל NS-07 חסר כמה exons, וזה היה צפוי להיות משקל מולקולרי נמוך יותר. חולה NS-03 הראה שום רמות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול. באות 4b, כמות הdystrophin לעומת שליטה בריאה עבור חולה NS-07 מוצג. המיקום שבו נמדדו עוצמת האות לחישוב של שחזור דיסטרופין מצוינים עם ריבועים כחולים. יחס ספקטרין דיסטרופין שימש לחישוב כמות ה דיסטרופין בהשוואה לזה של השליטה הבריאה. כך, האות מהדיסטרופין פחות רקע חולק על ידי הסכום של שני isoforms ספקטרין (ארוך וקצר) פחות רקע (ראה שלב 8.6.5). היחס לשליטה בריאה נקבע ל-100%. כמות ה dystrophin לעומת השליטה הבריאה בחולה NS-07 לאחר הטיפול היה 9.1%. עם זאת, לא ניתן היה לחשב את האחוז עבור חולה NS-03 בשל להקה דיסטרופין חלשה, אשר דומה לאלה שהושגו עבור דגימות טיפול קודמות עבור שני החולים.

figure-results-2600
איור 1: דיאגרמה סכמטית של מחסנית ההעברה עבור ניתוח כתם מערבי. הרכבה של מחסנית העברת כתם המערבי עם נייר סופג ספוג במאגר כתמים A בתחתית ואחריו נייר סופג ספוג מאגר סופג B, קרום PVDF, 3-8% Tris-אצטט ג'ל ועל גבי 2 ניירות סופגים ספוגים ב- C סופג סופג מוצג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3153
איור 2: ציור סכמטי של אקסון דילוג של exon 53 בחולה עם מחיקה exon 45-52 בגן DMD. לדוגמה, חולה NS-03 בניסוי הקליני להסלמה במינון היה מחיקה זו. אם אקסון 53 יישמר, ה-MRNA יהיה מחוץ למסגרת מאז צומת exon-exon בין exon 44 ו 53 משבש את מסגרת הקריאה, גורם עצירה קודון ב exon 53. מסגרת הקריאה משוחזרת כאשר מדלגים על exon 53, ומופקת איזופורם קצר יותר של דיסטרופין. כדי לזהות exon 53-דילוג על-ידי RT-PCR, פריימרים ב exon 44 ו 54 משמשים כך PCR-מוצר בין מדלג ו- mRNA לא מדלג יכול בקלות להתגלות. FWD: פריימר קדימה, REV: פריימר הפוך, PMO: פוספורודיאמידט מורפולינו אוליגומר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4023
איור 3: דילוג על יעילות עבור חולים NS-03 ו NS-07 מדגימות ביופסיה שריר קדמי השוקיאלי. a) תמונת ג'ל שנוצרה על ידי מערכת אלקטרופורזה A של דגימות RT-PCR של דגימות לא מטופלות ומטופלות מחולים NS-03 ו-NS-07. הלוח העליון מציג את NS-03 ואת הלוח התחתון NS-07 בשלושה רישיות. עבור NS-03, הלהקה שלא מדלגים עליה היא 422 bp, והלהקה מדלגת היא 212 bp. עבור NS-07, הלהקות הן 836 bp ו 624 bp, בהתאמה. ניתוח רצף הראה שרשור של exon 44 ו exon 54 עבור NS-03 ואקסון 47 כדי exon 54 עבור NS-07. ב)דילוג על יעילות לפני ואחרי הטיפול מוצג עבור חולים NS-03 ו NS-07, מחושב מתוך ריכוז הטוחנתן של שתי הלהקות המסופקות על ידי מערכת A כמו להקה מדלג / (מדלג הלהקה + הלהקה לא דילג) x 100. יעילות דילוג עבור NS-03 היה נמוך מאוד לאחר הטיפול; עבור NS-07, יעילות דילוג היה מעל 70%. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-5099
איור 4: כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. a) כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. כתם מערבי של ביופסיה שרירים מן השוקיאליים הקדמי מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי הטיפול ומשליטה בריאה בשלושה אנשים. Dystrophin ניתן לראות ב 427 kDa עבור שליטה בריאה ב 389 kDa עבור NS-07 לאחר הטיפול. לא ניתן היה לזהות דיסטרופין עבור אף אחד מהמטופלים לפני הטיפול, או שלא ניתן היה לזהות אף אחד מהם לאחר טיפול בחולה NS-03. האזור בקופסה השחורה מוצג באות 4b. משמאל בכל כתם מוצג הסמן. ב)כמות ההתרררות ששוחזרה לאחר הטיפול בחולה NS-07. שחזור Dystrophin חושב בהתבסס על העוצמות של הלהקות עבור דיסטרופין, רקע, ואת isoform ארוך וקצר של ספקטרין על פי הנוסחה: (dystrophin - רקע)/(ספקטרין L -רקע) + (ספקטרין S - רקע) שבו היחס לבקרה בריאה מוגדר ל 100%. העוצמה של כל להקה נמדדה בתוך הקופסאות הכחולות המוצגות בדמות. שיקום ה דיסטרופין עבור NS-07 היה 9.1% לאחר הטיפול. אות ה דיסטרופין היה חלש מדי מכדי למדוד את הדגימות הלא מטופלות. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. Dys: Dystrophin, BG: רקע, SL: ספקטרין ארוך isoform, SS: ספקטרין קצר isoform, שלי: מיויסין סוג 1. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

פתרון (פתרוןנפח / תגובה (μl)ריכוז סופי
מים ללא תחנה (מסופקים)משתנה (משתנה-
5X QIAGEN OneStep RT-PCR מאגר5.01x
dNTP Mix (המכיל 10 מיליון מ"מ של כל dNTP)1.0400 μM של כל dNTP
פריימר קדמי (10 μM)1.50.6 μM
פריימר הפוך (10 μM)1.50.6 μM
QIAGEN צעד אחד RT-PCR אנזים לערבב1.0-
מעכב RNase (אופציונלי)משתנה (משתנה5-10 יחידות/תגובה
RNA של תבנית50 ng
סה"כ25

טבלה 1: ריאגנטים RT-PCR. התרכובות הדרושות לתגובה אחת של RT-PCR.

פריימר (פרימר)רצף (20
ת"א 44 00:001.75 ק"מ
ת"א 3517.5.05, 1.75 מ', 3, 000 00:00:00,000 --&10:00,00
48 אף 00:00:1.75 מ', ג'ורג'
54/55R5'-TCTCTCTCACTCACCCTT-3'
54R (100)5'-GTGGACTTTCTACTACTCAT-3'

טבלה 2: רשימת פריימר. רצפים עבור פריימרים המשמשים במחקר זה. פ: קדימה, ר: הפוך.

מחזור אחדשעתוק הפוך30 דקות50°C
מחזור אחדשלב הפעלה ראשוני של PCR15 דקות100°C
35 מחזוריםפירוק (פירוק)1 דקות94 °C
אנאלית (119)1 דקות60 °C
השלוחה (השל1 דקות72 °C
מחזור אחדהארכה סופית7 דקות72 °C
המתן∞4°C

טבלה 3: PCR מותן בשימוש. הצג תנאי PCR עבור תגובת RT-PCR.

פתרון (פתרוןנפח / תגובה (μl)
מים ללא תחבולותמשתנה (משתנה
BigDye שליחות קטלנית 3.1 תגובה מוכנה לערבב3.5
פריימר קדמי/פריימר הפוך (3.2 μM)2.0
RNA של תבנית20 ng
סה"כ20

טבלה 4: ריאגנטים הנחוצים לתגובת ההתפתלה. השתמש בפרימר קדימה או הפוך בהתקנה, לא בשניהם בו-זמנית.

מחזור אחד1 דקות96 °C
25 מחזורים10 שניות96 °C
5 שניות50°C
4 דקות60 °C
המתן∞4°C

טבלה 5: תנאי PCR עבור רצף סנגר.

Discussion

ניסויים קליניים של DMD יצרו גם הצלחות וכישלונות בשנים האחרונות. הן RT-PCR והן כתמים מערביים הם טכניקות נפוצות כדי להעריך את יעילות דילוג שנוצר על ידי exon-דילוג תרכובות הניתנות לחולים. עם זאת, RT-PCR דווח להעריך יתר על המידה את יעילות דילוג לעומת PCRדיגיטלי 15. למרות שזה בגלל מספר סיבות, זה נגרם בעיקר על ידי ההגדלה יעילה יותר של שברים קטנים מדלג במהלך מחזורי PCR. נראה כי RT-PCR בשימוש בניסוי קליני זה גם יצר יעילות דילוג גבוהה יותר בהשוואה לביטוי החלבון המוערך על ידי כתמים מערביים. על פי ה-FDA, זוהי דרך אמינה יותר לכמת שיקום דיסטרופין12. לפיכך, יש לנקוט זהירות בעת פענוח תוצאות דילוג RT-PCR; עם זאת, עדיין ניתן להשוות את הדגימות. דוגמאות המציגות יעילות דילוג גבוהות יותר בהתבסס על תוצאות RT-PCR בדרך כלל מופקעות רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון בניתוחי כתם מערבי.

מאז כל החולים בניסויים קליניים DMD אין את אותו דפוס מחיקה, זה יכול להיות קשה לעצב פריימרים ובדיקות כי הם ספציפיים במידה מספקת כדי לבצע דיגיטלי או qPCR על כל הדגימות. לפיכך, RT-PCR היא עדיין אלטרנטיבה טובה להערכה ראשונה של יעילות דילוג. לפני הניסוי הקליני של NS-065/NCNP-01 החל, זה היה מייגע להעריך דילוג יעילות עבור כל מטופל במבחנה מאז או שריר או ביופסיה בעור היה חובה כדי ליצור myoblasts ספציפי למטופל. עם זאת, פרסמנו לאחרונה טכניקה חדשנית כדי ליצור MYOD1 ספציפי למטופל מומר, נגזר שתן תאים (UDCs) כמו מודל תא שריר DMDרומן 16. לפיכך, רק שתן שנאסף מהמטופל נדרש כדי ליצור את myoblasts, ואין צורך בהליך פולשני. אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לסנן AONs שונים בתאים ספציפיים למטופל. יתר על כן, פריימרים שונים ובדיקות ניתן לבדוק לפני המטופל מתחיל כל ניסוי קליני. זה יכול להקל על השימוש qPCR או PCR דיגיטלי עבור exon דילוג מדידה בניסויים קליניים DMD בעתיד.

לביצוע ניתוח כתם מערבי בניסוי קליני זה, נעשה שימוש בנוגדן יחיד נגד דיסטרופין, ורק בקרה בריאה אחת שימשה ודגימת התייחסות. לפיכך, הספציפיות של הנוגדן לא אומתה כראוי. זה, יחד עם העובדה כי הנוגדן מכיר רק את התחום C-מסוף של דיסטרופין, היא מגבלה של הפרוטוקול. בקרות בריאות יותר ונוגדנים מכוונים נגד תחומים שונים של מולקולת דיסטרופין מומלצים בעתיד.

כאן, סיכם את הפרוטוקולים ששימשו בניסוי הראשון של החוקרים ביוזמת החוקר, הראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 עשוי להיות ישים ל-10.1% מהחולים עם DMD.

Disclosures

אף לא אחד .

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לד"ר טקאשי סאיטו, ד"ר טצויה נאגאטה, מר סאטושי מסודה, וד"ר ארי טקשיטה לדיון מדעי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 bp DNA LadderTakara3407Amarker solution for MultiNA
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6)Nacalai35436-01
2-mercaptoethanolNacalai21418-42
2-Methylbutane (Isopentane)Sigma-Aldrich15-2220
5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeFalcon352235
6× Loading BufferTakara9156
Agarose MEIwai chemical50013R
Applied Biosystems 3730 DNA AnalyzerApplied BiosystemsA41046
BD Matrigel MatrixBD Biosciences356234
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystems4337455
Bovine Serum Albumin solutionSigma-AldrichA8412
Bromophenol blueNacalai05808-61
Centri-Sep 96-Well PlatesApplied Biosystems4367819
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche4693116001
DMEM/F-12Gibco11320033
ECL Prime Blocking ReagentGE healthcareRPN418
ECL Prime Western Blotting Detection ReagentGE healthcareRPN2232
Endo-PorterGeneTools2922498000
Experion Automated Electrophoresis StationBio-Rad7007010Microchip electrophoresis system A
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 ChipsBio-Rad7007107JA
Experion Priming StationBio-Rad7007030
Experion Vortex Station IIBio-Rad7007043
Extra Thick Blot Filter PaperBio-Rad1703965
EzBlotAttoAE-1460
GelRed Nucleic Acid Gel StainBiotium41003
glass vialIwaki1880 SV20
GlycerolNacalai17045-65
Histofine Simple Stain MAX PONichirei424151
Horse SerumGibco16050122
Immobilon-P Transfer MembraneMilliporeIPVH304F0
ITS Liquid Media SupplementSigma-AldrichI3146
MethanolSigma-Aldrich34860
MicroAmp Clear Adhesive FilmApplied Biosystems4306311
MultiNASHIMADZUMCE-202Microchip electrophoresis system B
Multiplate 96-Well PCR PlatesBio-Radmlp9601
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermo ScientificND-ONE-W
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus)Leica biosystemsNCL-DYS2
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody SpectrinLeica biosystemsNCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein GelsInvitrogenEA03785BOX
NuPAGE AntioxidantInvitrogenNP0005
NuPAGE LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
NuPAGE Sample Reducing AgentInvitrogenNP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running BufferInvitrogenLA0041
Oriole Fluorescent Gel StainBio-Rad1610496
PBSGibco10010023
Penicillin-Streptomycin Solution StabilizedSigma-AldrichP4458
Physcotron Handy micro-homogenizerMICROTECNS-310E3
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23227
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003
Propidium Iodide Staining SolutionBD Pharmingen556463
QIAGEN OneStep RT-PCR KitQiagen210212
RNeasy Fibrous Tissue Mini KitQiagen74704
SDSNacalai31606-75
Semi-dry transfer machineBio Craft41-1293
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainInvitrogenS11494for MultiNA
TAE BufferNacalai35430-61
Tragacanth GumWako200-02245
Tris-EDTA BufferNippon Gene316-90025for MultiNA
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco25300054
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
UreaNacalai35907-15
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9281
XCell SureLock Mini-CellInvitrogenEI0001

References

  1. Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
  2. Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
  3. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  4. Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
  5. Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
  6. Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
  7. Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
  8. Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
  9. Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
  10. Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
  11. Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
  12. Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
  13. Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
  14. Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
  15. Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).
  16. Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159DMDPhosphorodiamidate PMOsmRNART PCRNS 065 NCNP 0153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved