OaAEP1介导酶合成和聚合蛋白固定，用于单分子力光谱

摘要

在这里，我们提出了一个方案，通过酶形成蛋白质聚合物与受控序列结合蛋白质单体，并将其固定在表面进行单分子力光谱研究。

摘要

近年来，化学和生物结合技术发展迅速，使蛋白质聚合物得以形成。然而，受控的蛋白质聚合过程始终是一个挑战。在这里，我们开发了一种酶方法，用于在合理控制的序列中逐步构建聚合蛋白。在这种方法中，蛋白质单体的C端是NGL用于蛋白质结合使用OaAEP1 （奥德兰尼亚亲基苯甲酰二甲苯肽酶） 1），而N端是一个可夹紧的TEV（烟草蚀刻病毒）裂解位点加L（ENLYFQ/GL）用于临时N端保护。因此，OaAEP1一次只能添加一个蛋白质单体，然后TEV蛋白酶在Q和G之间将N-终点板分刻，以暴露NH 2-Gly-Leu。然后，该装置已准备好进行下一次 OaAEP1 结扎。工程多蛋白通过展开单个蛋白质域使用原子力显微镜为基础的单分子力光谱（AFM-SMFS）进行检查。因此，本研究为多蛋白工程和固定化提供了一个有用的策略。

引言

与合成聚合物相比，天然多域蛋白具有统一的结构，具有控制良好的数量和子域¹的类型。此功能通常导致改善生物功能和稳定性^2，3。许多方法，如基于半胱氨酸的二硫化物结合和重组DNA技术，已经开发用于建立这种聚合蛋白与多个领域^{4，5，6，7。}然而，前一种方法总是导致一个随机和不受控制的序列，而后者会导致其他问题，包括有毒和大型蛋白质的过度表达和复合蛋白与辅因子和其他微妙酶的纯化的困难。

为了迎接这一挑战，我们开发了一种酶法，利用蛋白胶合OaAEP1与蛋白酶TEV^8、9相结合，将蛋白质单体结合在一起，以循序渐进的方式用于聚合物/多蛋白。OaAEP1是一种严格而高效的内肽酶。如果N-终点为Gly-Leu残留物（GL），则两种蛋白质可于30分钟内通过OaAEP1通过两个终点线（NGL）进行共价连接，而C-终点为NGL残留物^10。然而，使用OaAEP1只将蛋白质单体与蛋白质聚合物联系起来，其序列与基于半胱氨酸的耦合方法一样不受控制。因此，我们设计了具有可移动TEV蛋白酶位点的蛋白质单元的N-终点，以及作为ENLYFQ/G-L-POI的亮氨酸残留物。在 TEV 裂解之前，N 终端不会参与 OaAEP1 连接。然后，N-总站的GL残留物，与进一步的OaAEP1结扎兼容，在TEV裂解后暴露。因此，我们实现了多蛋白的连续酶生物合成方法，序列控制相对较好。

在这里，我们的分步酶合成方法可用于多蛋白样品制备，包括序列控制和不受控制，以及蛋白质固定用于单分子研究，特别是对于复杂系统，如金属蛋白。

此外，基于AFM的SMFS实验使我们能够确认蛋白质聚合物在单分子水平上的结构和稳定性。单分子力光谱，包括AFM，光学钳子和磁钳，是纳米技术中一般工具，以机械方式操纵生物分子，测量其稳定性11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。单分子AFM已广泛应用于蛋白质（非）折叠21，22，23，24，25，受体-配体相互作用的强度测量26，27，28，29，30，31，32，33，34， ^35，无机化学键20，36，37，38，39，40，41，42，43和金属配体键在金属蛋白44，45，46，47，48，49，50.在这里，使用单分子AFM验证基于相应蛋白质展开信号的合成多蛋白序列。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 蛋白质生产

1. 基因克隆
   1. 购买感兴趣的蛋白质（POI）的基因编码:泛素、鲁布雷多辛^{（RD）51、}纤维素结合模块（CBM）、Dockerin-X域（XDoc）和从鲁米诺球菌浮躁、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶、弹性蛋白样多肽（ELPs）的内聚力。
   2. 进行聚合酶链反应，并使用三限消化酶系统BamHI-BglII-KpnI对不同蛋白质片段的基因进行重组。
   3. 通过直接DNA测序确认所有基因。
2. 蛋白质表达和生产
   1. 使用pQE80L-POI或pET28a-POI质粒将大肠杆菌BL21（DE3）转化为表达。
   2. 使用相应的抗生素（例如，100 μg/mL阿霉素钠盐或50微克/mL，卡那霉素）将单菌群选入15 mL的LB培养基中。在 37°C 下保持 200 rpm 的摇动培养物 16-20 小时。
   3. 将隔夜培养物稀释到 800 mL 的 LB 介质中（1:50 稀释）。对于红霉素，将培养物在1，800 x g处离心，然后在15 mL的M9介质中重新悬浮（辅以0.4%葡萄糖、0.1 mM CaCl_2、2mM MgSO_4），然后稀释成800 mL的M9介质。
   4. 在 37°C 下孵育培养基，同时以 200 rpm 摇动，直到培养基达到 0.6 6 600 nm （OD_600）的光学密度。保存100μL培养剂样品作为预诱导控制，用于测试蛋白质表达。
   5. 通过将 IPTG 添加到 1 mM 的最终浓度中诱导蛋白质表达，并在 37°C 下在 200 rpm 下摇动培养物 4 小时。保留100μL培养剂样品作为后诱导控制，用于测试蛋白质表达。
   6. 在13，000 x g下将培养物在4°C下离心25分钟，在-80°C前储存在-80°C。
      注: 可以在此处暂停该协议。
3. 感兴趣的蛋白质的纯化
   1. 在25 mL的裂干缓冲液中重新悬浮细胞（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4，含有DNase、RNase、PMSF），并使用声波器（15%振幅）在冰上裂莱30分钟。
   2. 在4°C下在19，000 x g下澄清细胞分麦40分钟。
   3. 将 Co-NTA 或 Ni-NTA 亲和柱的 1 mL（床体积）包，用 10 列体积 （CV） 的超纯水清洗柱，然后用重力流清洗 10 CV 的洗涤缓冲液（50 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM imidazole、pH 7.4）。
   4. 通过重力流通过蛋白质上清液三次。
   5. 用50个CV将洗涤缓冲液倒入柱子上，以去除污染物蛋白质。
   6. 用3个冷洗脱缓冲液（20 mM Tris，400 mM NaCl，250 mM imidazole，pH 7.4）来洗取结合的蛋白质。当涉及到红霉素蛋白时，有必要在4°C下使用pH8.5的海龙交换柱进一步进行黄蜂交换纯化。
   7. 按 SDS-PAGE 分析样本。

2. 盖玻片和悬臂表面的功能化

1. 功能化盖玻片表面处理
   1. 在40 mL的超纯水中溶解20克铬酸钾。用玻璃棒轻轻搅拌，将360 mL的浓缩硫酸慢慢加入铬酸钾溶液中，并制备铬酸。
      注意:这里使用的化学物质和最终的铬酸具有很强的腐蚀性和酸性。使用适当的防护设备。当添加浓缩硫酸时，溶液释放热量，这意味着缓慢添加和适当的暂停冷却。
   2. 通过铬酸处理，在80°C下清洁并激活玻璃盖玻片30分钟。在室温下将盖玻片完全浸入 1% （v/v） APTES 苯丙烯溶液中 1 小时，同时保护它们免受光线照射。
   3. 用甲苯和绝对乙醇清洗盖玻片，用氮气流擦干盖玻片。
   4. 在 80°C 孵育盖玻片 15 分钟，然后冷却至室温。
   5. 在两个固定盖片之间加入200 μ0μL的磺酸-SMCC（1mg/mL）二甲基磺酸（DMSO）溶液，并孵育1小时，防止光线照射。
   6. 先用DMSO清洗盖玻片，然后用绝对乙醇清洗盖玻片，以去除残留的磺酸-SMCC。
   7. 在氮气流下擦干盖玻片。
   8. 将60μL的200μM GL-ELP_50nm-C蛋白溶液移至功能化盖玻片上，孵育约3小时。
   9. 用超纯水清洗盖玻片，以去除未反应的 GL-ELP_50nm-C。
      注:功能化盖玻片在4°C下可储存约两周。
2. 功能化悬臂表面处理
   1. 通过铬酸处理，在80°C下清洁吊臂10分钟。
   2. 使用 1% （v/v） APTES 苯丙烯溶液，通过氨基硅化使悬臂功能化，然后在 80°C 烘烤悬臂 15 分钟，然后再与磺酸-SMCC 结合。
   3. 将 C-ELP_50nm-NGL 与硫磺-SMCC 的雄性组连接在表面 1.5 小时。
   4. 用超纯水洗去盖玻片上未反应的C-ELP_50nm-NGL。
   5. 在200μL的50μM GL-CBM-XDoc蛋白质溶液中浸入功能化悬臂，在25°C下含有200 nM OaAEP1，20-30分钟。然后使用AFM缓冲液（100 mM Tris，100 mM NaCl，pH 7.4）洗去未反应的蛋白质。
      注:悬臂和盖玻片的表面化学性质相似。

3. 带受控序列的分步多蛋白制备

1. 将结扎单元 Coh-tev-L-POI-NGL 与 OaAEP1 固定在盖玻片表面的 GL-ELP_50nm连接 30 分钟。
2. 使用 15-20 mL 的 AFM 缓冲液（100 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.4）来洗去任何未反应的蛋白质。
3. 加入100 μL的TEV蛋白酶（0.5 mM EDTA，75 mM NaCl，25 mM Tris-HCl 10%[v/v] 甘油，pH 8.0），在TEV识别位点在25°C时将蛋白质单元分1小时。
4. 使用 15-20 mL 的 AFM 缓冲液洗去残留的蛋白质。
5. 通过 OaAEP1 将结扎单元 Coh-tev-L-POI-NGL 连接到 GL-Ub-NGL 玻璃 30 分钟。
6. 重复步骤3.3至3.5 N-1次，在玻璃表面构建蛋白质结构GL-（Ub）n-NGL。在蛋白质聚合物上将粘合蛋白作为Coh-tev-L-（Ub）n-NGL-玻璃，省略最后一次TEV裂解反应以储备合辛。

4. AFM实验测量和数据分析

1. AFM 测量
   1. 将 1 mL AFM 缓冲液加入 10 mM CaCl₂和 5 mM 抗坏血酸的腔室中。
   2. 为实验选择功能化的 AFM 探头的 D 尖端。使用等位定理在每个实验之前使用精确的弹簧常数（k） 值校准 AFM 缓冲区中的悬臂。
   3. 将悬臂尖端连接到样品表面，形成 Cohesin/Dockerin 对。
   4. 以 400 nmμs^±1的恒定速度从表面缩回悬臂。同时，以 4000 Hz 的采样率记录力延伸曲线。
2. 数据分析
   1. 使用 JPK 数据处理选择力延伸跟踪。
   2. 使用软件分析跟踪。将曲线与聚合物弹性的蠕虫链 （WLC） 模型配合，获得单个蛋白质展开峰值的展开力和轮廓长度增量。
   3. 将展开力的直方图与高斯模型拟合，以获得展开力（u>;）和轮廓长度增量（<_L_c>;;

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

OaAEP1结扎在相邻蛋白质之间引入的NGL残留物不会影响聚合物中的蛋白质单体稳定性，因为展开力（u>）和轮廓长度增量（<+L_c>;）与上一项研究（图1）相当。红霉素蛋白的纯化结果如图2所示。为了证明TEV裂解后的蛋白质与以下OaAEP1结扎相容，以构建具有控制序列的蛋白质聚合物，结构高效，图3提供了SDS-PAGE图像作...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

我们描述了一种酶生物合成和多蛋白固定化方案，并验证了基于AFM的SMFS的多蛋白设计。这种方法提供了一种新方法，以设计的顺序构建蛋白质聚合物，补充了以前多蛋白工程和固定4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61的方法。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
iron (III) chloride hexahydrate	Energy chemical		99%
Zinc chloride	Alfa Aesar		100.00%
calcium chloride hydrate	Alfa Aesar		99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid	Sigma Life Science		Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane	Sigma-Aldrich		≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate	Thermo Scientific		90%
Glycerol	Macklin		99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)	Alfa Aesar
Genes	Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM	JPK Germany
MLCT cantilever	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC system	GE Healthcare
Glass coverslip	Sail Brand
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge	Beckman Coulter
Gel Image System	Tanon