JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для сопряжения белка мономер ферментов формирования белка полимера с контролируемой последовательности и обездвижить его на поверхности для одномолекулярных исследований силы спектроскопии.

Аннотация

Химические и био-конъюгации методы были быстро разработаны в последние годы и позволяют строить белковых полимеров. Тем не менее, контролируемый процесс полимеризации белка всегда является сложной задачей. Здесь мы разработали ферментативную методологию построения полимеризованного белка шаг за шагом в рационально контролируемой последовательности. В этом методе, C-термина мономера белка является NGL для спряжения белка с использованием OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl эндопептидазы) 1) в то время как N-термин был расщепления TEV (вирус табачного etch) расщепления плюс L (ENLYF/ GL) для временного N-терминала защиты. Следовательно, OaAEP1 смог добавить только один мономер белка за один раз, а затем протеазы TEV расщепляли N-терминус между q и G, чтобы разоблачить NH2-Gly-Leu. Затем устройство готово к следующей перевязке OaAEP1. Инженерный полипротеин исследуется путем развертывания индивидуального белкового домена с использованием атомной силовой микроскопической одномолекулярной силовой спектроскопии (AFM-SMFS). Поэтому данное исследование дает полезную стратегию для полипротеиновой инженерии и иммобилизации.

Введение

По сравнению с синтетическими полимерами, натуральные мультидоменные белки имеют единую структуру с хорошо контролируемым числом и типом субдоменов1. Эта функция обычно приводит к улучшению биологической функции и стабильности2,3. Многие подходы, такие как цистеин основе дисульфидных связей и рекомбинантных технологий ДНК, были разработаны для создания такого полимерного белка с несколькими доменами4,5,6,7. Однако первый метод всегда приводит к случайной и неконтролируемой последовательности, а второй приводит к другим проблемам, в том числе к трудностям для переэкспрессии токсичных и крупногабаритных белков и очищения сложного белка с кофактором и другими деликатными ферментами.

Чтобы решить эту задачу, мы разрабатываем ферментационный метод, который совмещает белок мономер вместе для полимера / полипротеина в шаг ею с помощью белка лигазы OaAEP1 в сочетании с протеаза TEV8,9. OaAEP1 является строгим и эффективным эндопептидаза. Два белка могут быть связаны ковалентно, как Asn-Gly-Leu последовательности (NGL) через два termini OaAEP1 менее чем за 30 минут, если N-терминов является Гли-Леу остатков (GL) и другой из которых C-терминус NGL остатков10. Однако, использование OaAEP1 только для того чтобы связать мономер протеина водит к полимеру протеина с uncontrolled последовательностью как метод соединения на основе cysteine. Таким образом, мы проектируем N-терминус белкового блока со съемным участком протеазы TEV плюс остатки лейцина в виде ENLYF/G-L-POI. До расщепления TEV, N-терминал не будет участвовать в перевязке OaAEP1. И тогда остатки GL на N-терминус, которые совместимы с дальнейшей перевязкой OaAEP1, подвергается после расщепления TEV. Таким образом, мы достигли последовательного ферментативного метода биосинтеза полипротеина с относительно хорошо контролируемой последовательностью.

Здесь наш метод поэтапного ферментативного синтеза может быть использован в подготовке полипротеиновых образцов, включая контролируемую последовательность и неконтролируемую, и протеиновой иммобилизации для одномолекулярных исследований, особенно для сложной системы, такой как металлопротеин.

Кроме того, эксперименты SMFS на основе AFM позволяют нам подтвердить конструкцию полимера и стабильность белка на одномолекулярном уровне. Одномолекулярная силовая спектроскопия, включая AFM, оптический пинцет и магнитный пинцет, является общим инструментом в нанотехнологии для механически управления биомолекулой и измерения их стабильности11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Одномолекулярный AFM широко используется в изучении белка(un), складывая21,22,23,25,измерения прочности взаимодействия рецептор-лиганд26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, неорганические химические связи20,36,37,38,39,40,41,42,43 и металло-лиганд связи в металлопротеина44,45,46,47,48,49,50 . Здесь одномолекулярный AFM используется для проверки синтезированной последовательность полипротеинов на основе соответствующего белка разворачивается сигнала.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Производство белка

  1. Клон гена
    1. Покупка генов кодирования для белка интерес (POI): Убиквитин, Rubredoxin (RD)51, целлюлозы связывающий модуль (CBM), докерин-X домена (XDoc) и сплоченности от Ruminococcus flavefacience, табачный охлопок вирус (TEV) протеазы, эластиноподобные полипептиды (ELPs).
    2. Выполните полимеразную цепную реакцию и используйте трехограничения системы ферментов пищеварения BamHI-BglII-KpnI для рекомбинации гена из различных белковых фрагментов.
    3. Подтвердите все гены путем прямого секвенирования ДНК.
  2. Выражение и производство белков
    1. Преобразуйте E. coli BL21 (DE3) с плазмидом p'E80L-POI или pET28a-POI для выражения.
    2. Выберите одну колонию в 15 мл среды LB с соответствующими антибиотиками (например, 100 мкг/мл ампициллин соли натрия или 50 мкг/мл, канамицин). Продолжайте встряхивая культуры при 200 об/мин при 37 градусах по Цельсию при 16-20 ч.
    3. Разбавить ночные культуры в 800 мл среды LB (1:50 разбавления). Для рубредоксина, центрифуга культуры на 1800 х г, затем resuspend в 15 мл M9 среднего (дополнено 0,4% глюкозы, 0,1 мм CaCl2, 2 мМ MgSO4), а затем разбавить его в 800 мл M9 среды.
    4. Инкубировать культуру при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин, пока культура не достигнет оптической плотности на уровне 600 Нм (OD600) 0,6. Сохранить 100 л образца культуры в качестве контроля прединдукции для тестирования экспрессии белка.
    5. Побудить выражение белка, добавив IPTG к конечной концентрации 1 мМ и встряхнуть культуру при 37 градусах по Цельсию в течение 4 ч при 200 об/мин. Зарезервируйте образец культуры в 100 л в качестве постиндукционного контроля для проверки экспрессии белка.
    6. Centrifuge культуры на 13000 х г в течение 25 минут при 4 кв и хранить при -80 градусов по Цельсию до очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
  3. Очищение интересуемого белка
    1. Приостановите действие клеток в 25 мл буфера лизиса (50 мм Tris, 150 mM NaCl, рН 7.4, содержащий DNase, RNase, PMSF) и используйте звуковой элемент (15% амплитуды) для линизации его в течение 30 минут на льду.
    2. Уточните лизат клетки на 19000 x g на 40 мин при 4 c.
    3. Упакуйте 1 мл (объем кровати) колонки Co-NTA или Ni-NTA и промойте колонну 10 объемами колонн (CV) ультрачистой воды, а затем 10 резюме буфера для мытья (50 мМ Tris, 150 mM NaCl, 2 мМ имидазола, pH 7.4) гравитационным потоком.
    4. Передайте белок супернатант через столбец гравитационным потоком в три раза.
    5. Налейте буфер стирки на столбец с 50 резюме, чтобы отойти загрязняющих белков.
    6. Выявите связанный белок с 3 резюме ледяного элютионного буфера (20 мм Трис, 400 мм NaCl, 250 мМ имидазол, рН 7.4). Когда дело доходит до белков рубредоксина, дальнейшее очищение обмена анионом с помощью колонки обмена анионов при рН 8,5 при 4 градусах По Цельсию необходимо.
    7. Проанализируйте образец по SDS-PAGE.

2. Функционализация поверхности крышки и кантилевера

  1. Функционально функционализированная подготовка поверхности крышки
    1. Растворите 20 г хромата калия в 40 мл ультрачистой воды. Медленно добавьте 360 мл концентрированной серной кислоты в раствор хромата калия со стеклянным стержнем, аккуратно перемешайте и подготовьте хромовую кислоту.
      ВНИМАНИЕ: Химическое вещество, используемое здесь, и окончательная хромовая кислота сильно коррозионные и кислые. Работайте с надлежащим защитным оборудованием. Раствор высвобождает тепло при добавлении концентрированной серной кислоты, что означает медленное добавление и надлежащую паузу для охлаждения.
    2. Очистите и активируйте стеклянный покрывало при 80 градусах По Цельсию в течение 30 мин путем лечения хромовой кислотой. Полностью погрузите крышки в 1% (v/v) раствор толуена APTES в течение 1 ч при комнатной температуре, защищая их от света.
    3. Вымойте покрывало с толуолом и абсолютным этиловым спиртом и высушите крышку с потоком азота.
    4. Инкубировать крышку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а затем охладиться до комнатной температуры.
    5. Добавьте 200 л сульфо-SMCC (1 мг/мл) в раствор диметилсулькоса (DMSO) между двумя обездвиженные крышками и инкубировать на 1 ч защищенный от света.
    6. Вымойте крышку с DMSO, а затем с абсолютным этиловый спирт, чтобы удалить остаточный сульфо-SMCC.
    7. Высушите крышку под потоком азота.
    8. Труба 60 л 200 мкм GL-ELP50nm-C белковый раствор на функционализированный покрывало и инкубировать около 3 ч.
    9. Вымойте крышку с ультрачистой водой, чтобы удалить неотреагированный GL-ELP50nm-C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функционализированные крышки способны в течение примерно двух недель под хранением при 4 градусах Цельсия.
  2. Функционально йорленичная подготовка поверхности кантилевера
    1. Очистите кантилеверы при 80 градусах По Цельсию в течение 10 мин с помощью хромокислоты.
    2. Функционализируя кантилевер путем амино-силанизации с 1% (v/v) APTES тонуевый раствор, а затем выпекать кантилевер при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут, прежде чем спрягать к сульфо-SMCC.
    3. Свяжите C-ELP50nm-NGL с поверхностью с группой малимидов сульфо-SMCC на 1,5 ч.
    4. Смойте неотреагированный C-ELP50nm-NGL на крышке ультрачистой водой.
    5. Погрузите функционалированный кантилевер в 200 кл. 50 мкм GL-CBM-XDoc белковый раствор, содержащий 200 нм OaAEP1 при 25 градусах По кв. Затем используйте буфер AFM (100 мм Tris, 100 mM NaCl, рН 7.4), чтобы смыть неотреагированный белок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхностная химия кантилеверов и крышка похожи.

3. Шаговраз препарат полипротеина с контролируемыми последовательностями

  1. Свяжите перевязочное подразделение Coh-tev-L-POI-NGL с GL-ELP50nm, обездвижемым на поверхности покрытия OaAEP1 в течение 30 мин.
  2. Используйте 15-20 мл буфера AFM (100 мм Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), чтобы смыть любые неотреагированные белки.
  3. Добавьте 100 зЛ протеазы TEV (0,5 мМ EDTA, 75 мМ NaCl, 25 мМ Tris-HCl 10% "v/v" глицерол, рН 8.0), чтобы оставить белковую единицу на участке TEV для 1 ч при 25 градусах по Цельсию.
  4. Используйте 15-20 мл буфера AFM, чтобы смыть остаточные белки.
  5. Свяжите перевязочное подразделение Coh-tev-L-POI-NGL с GL-Ub-NGL-Glass от OaAEP1 за 30 мин.
  6. Повторите шаги от 3,3 до 3,5 N-1 раз, чтобы построить протеин построить GL-(Ub)n-NGLна стеклянной поверхности. Опускайте последнюю реакцию расщепления TEV на резервную сплоченность на протеине-полимере, как Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Измерение экспериментов AFM и анализ данных

  1. Измерения AFM
    1. Добавьте 1 мл буфера AFM в камеру с 10 мм CaCl2 и 5 мм аскорбиновой кислоты.
    2. Выберите d кончик функционализованного зонда AFM для эксперимента. Используйте теорему экипировки для калибровки кантилевера в буфере AFM с точным значением пружины(k)перед каждым экспериментом.
    3. Прикрепите кончик кантилевера к поверхности образца, чтобы сформировать пару cohesin/Dockerin.
    4. Убирать кантилевер с постоянной скоростью 400 нмс поверхности. В то же время, запишите кривую силы расширения на выборке скорость 4000 Гц.
  2. Анализ данных
    1. Используйте обработку данных JPK, выберите следы расширения силы.
    2. Используйте программное обеспечение для анализа следов. Приготовь кривые с червь-как-цепь (WLC) модель упругости полимера и получить разворачивающуюся силу и приращение длины контура для индивидуального белка разворачивается пик.
    3. Fit гистограммы разворачивающихся сил с гауссийской модели, чтобы получить наиболее вероятные значения разворачивающейся силы (Злт;Фуйgt;) и приращения длины контура (злт;Зли с

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Остатки NGL, введенные между соседними белками по перевязке OaAEP1, не повлияют на стабильность мономера белка в полимере, так как разворачивающаяся сила (Злт;Фуйогт;), а увеличение длины контура (злт; ЗЛсйgt;) сопоставимо с предыдущим исследованием(рисунок 1). Резул...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описали протокол ферментативного биосинтеза и иммобилизации полипротеина и проверили дизайн полипротеина на основе AFM SMFS. Данная методология предусматривает новый подход к созданию белково-полимера в разработанной последовательности, которая дополняет предыдущие методы для поли...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 21771103, 21977047), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (Грант No. BK20160639) и Шуанчуань программы провинции Цзянсу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
iron (III) chloride hexahydrateEnergy chemical99%
Zinc chlorideAlfa Aesar100.00%
calcium chloride hydrateAlfa Aesar99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic AcidSigma Life ScienceBio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylateThermo Scientific90%
GlycerolMacklin99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipment
Nanowizard 4 AFMJPK Germany
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC systemGE Healthcare
Glass coverslipSail Brand
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrifugeBeckman Coulter
Gel Image SystemTanon

Ссылки

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775(2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881(2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989(2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185(2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894(2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518(2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569(2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167(2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156OaAEP1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены