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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Resumen

Las técnicas químicas y de bioconjugación se han desarrollado rápidamente en los últimos años y permiten la construcción de polímeros proteicos. Sin embargo, un proceso controlado de polimerización de proteínas siempre es un desafío. Aquí, hemos desarrollado una metodología enzimática para la construcción de proteínapolis polimerizadas paso a paso en una secuencia racionalmente controlada. En este método, el C-terminus de un monómero proteico es NGL para la conjugación de proteínas utilizando OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mientras que el N-terminus era un teV escleable (virus de grabado de tabaco) sitio más una L (ENLYFQ/GL) para la protección temporal N-terminal. En consecuencia, OaAEP1 fue capaz de añadir sólo un monómero proteico a la vez, y luego la proteasa TEV cortó el N-terminus entre Q y G para exponer el NH2-Gly-Leu. Entonces la unidad está lista para la próxima ligadura OaAEP1. La poliproteína de ingeniería se examina mediante el desarrollo de un dominio de proteína individual utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SMFS). Por lo tanto, este estudio proporciona una estrategia útil para la ingeniería de poliproteínas y la inmovilización.

Introducción

En comparación con los polímeros sintéticos, las proteínas naturales multidominio tienen una estructura uniforme con un número bien controlado y tipo de subdominios1. Esta característica generalmente conduce a una mejor función biológica y estabilidad2,3. Se han desarrollado muchos enfoques, como el acoplamiento de enlace de disulfuro a base de cisteína y la tecnología de ADN recombinante, para la construcción de una proteína polimerizada de este tipo con múltiples dominios4,5,6,7. Sin embargo, el método primero siempre resulta en una secuencia aleatoria e incontrolada, y el segundo conduce a otros problemas, incluyendo la dificultad para la sobreexpresión de proteínas tóxicas y de gran tamaño y la purificación de proteínas complejas con cofactor y otras enzimas delicadas.

Para hacer frente a este reto, desarrollamos un método enzimático que conjuga el monómero proteico para polímero/poliproteína de manera escalonada utilizando una ligasa proteica OaAEP1 combinada con una proteasa TEV8,9. OaAEP1 es una endopeptidasa estricta y eficiente. Dos proteínas pueden vincularse covalentemente como secuencia Asn-Gly-Leu (NGL) a través de dos termini por OaAEP1 en menos de 30 min si el N-terminus es residuos de Gly-Leu (GL) y el otro de los cuales el C-terminus es residuos de NGL10. Sin embargo, el uso de OaAEP1 sólo para vincular monómero de proteína conduce a un polímero proteico con una secuencia incontrolada como el método de acoplamiento basado en cisteína. Por lo tanto, diseñamos el N-terminus de la unidad de proteína con un sitio de proteasa TEV extraíble más un residuo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes de la escisión TEV, el N-terminal no participaría en la ligadura OaAEP1. Y luego los residuos de GL en N-terminus, que son compatibles con la ligadura OaAEP1 adicional, se expone después de la escisión TEV. Así, hemos logrado un método secuencial de biosíntesis enzimática de poliproteína con una secuencia relativamente bien controlada.

Aquí, nuestro método de síntesis enzimática escalonada se puede utilizar en la preparación de muestras de poliproteínas, incluyendo controlado por secuencia e incontrolado, e inmovilización de proteínas para estudios de una sola molécula, especialmente para el sistema complejo como metaloproteína.

Además, los experimentos SMFS basados en AFM nos permiten confirmar la construcción y estabilidad de polímeros proteicos a nivel de una sola molécula. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula, incluyendo AFM, pinza óptica y pinza magnética, es una herramienta general en nanotecnología para manipular la biomolécula mecánicamente y medir su estabilidad11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. El AFM monomolécula ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la proteína (un)folding21,22,23,24,25, la medición de la fuerza de la interacción receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, enlace químico inorgánico20,36,37,38,39,40,41,42,43 y el enlace metal-ligand en metalloproteína44,45,46,47,48,49,50 . Aquí, El AFM de una sola molécula se utiliza para verificar la secuencia de poliproteína sintetizada basada en la señal de despliegue de proteínas correspondiente.

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Protocolo

1. Producción de proteínas

  1. Clon genético
    1. Comprar genes que codifican para la proteína de interés (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, el módulo de unión a la celulosa (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) y cohesión de Ruminococcus flavefaciencia, virus de la fjma ción tabaco (TEV) proteasa, polipéptidos similares a la elastina (ELP).
    2. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa y utilizar el sistema enzimático de digestión de tres restricciones BamHI-BglII-KpnI para recombinar el gen de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos los genes mediante la secuenciación directa del ADN.
  2. Expresión y producción de proteínas
    1. Transforme E. coli BL21(DE3) con el plásmido pQE80L-POI o pET28a-POI para expresión.
    2. Escoja una sola colonia en 15 ml de medio de LB con los antibióticos respectivos (p. ej., sal sódica de ampicilina de 100 g/ml o 50 g/ml, kanamicina). Seguir agitando los cultivos a 200 rpm a 37oC durante 16-20 h.
    3. Diluir los cultivos nocturnos en 800 ml de medio LB (dilución 1:50). Para la rubredoxina, centrifugar el cultivo a 1.800 x g, a continuación, resuspender en 15 mL de medio M9 (complementado con 0,4% glucosa, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), y luego diluirlo en 800 ml de medio M9.
    4. Incubar el cultivo a 37oC mientras se agita a 200 rpm, hasta que el cultivo alcanza una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,6. Ahorre una muestra de 100 l del cultivo como control previo a la inducción para probar la expresión de proteínas.
    5. Inducir la expresión proteica añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM y agitar el cultivo a 37 oC durante 4 h a 200 rpm. Reserve una muestra de 100 l del cultivo como control posterior a la inducción para probar la expresión de proteínas.
    6. Centrifugar el cultivo a 13.000 x g durante 25 min a 4oC y almacenara a -80oC antes de la purificación.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  3. Purificación de proteínas de interés
    1. Resuspenda las células en 25 ml de tampón de lisis (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 que contiene DNase, RNase, PMSF) y utilice un sonicador (15% de amplitud) para aislarlo durante 30 minutos en hielo.
    2. Aclare el lisado celular a 19.000 x g durante 40 min a 4 oC.
    3. Empaquete 1 ml (volumen de cama) de la columna de afinidad Co-NTA o Ni-NTA y lave la columna con 10 volúmenes de columna (CV) de agua ultrapura y luego 10 CV de tampón de lavado (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) por flujo de gravedad.
    4. Pasar el sobrenadante proteico a través de la columna por flujo de gravedad por tres veces.
    5. Vierta el tampón de lavado en la columna con 50 CV para alejar las proteínas contaminantes.
    6. Elule la proteína enlazada con 3 CV de tampón de elución helada (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM de imidazol, pH 7.4). Cuando se trata de proteínas de rubredoxina, es necesario una mayor purificación del intercambio de aniones utilizando la columna de intercambio de aniones a pH 8,5 a 4 oC.
    7. Analice la muestra por SDS-PAGE.

2. Funcionalización de la superficie de la cubierta y del voladizo

  1. Preparación funcional de la superficie de cubreobjetos
    1. Disolver 20 g de cromado de potasio en 40 ml de agua ultrapura. Añadir lentamente 360 ml de ácido sulfúrico concentrado a la solución de cromato de potasio con varilla de vidrio agitar suavemente y preparar el ácido cromático.
      ADVERTENCIA: El producto químico utilizado aquí y el ácido cromático final es fuertemente corrosivo y ácido. Trabaje con el equipo de protección adecuado. La solución libera calor cuando se añade ácido sulfúrico concentrado, lo que significa una adición lenta y una pausa adecuada para enfriar.
    2. Limpie y active un cubrecristales a 80oC durante 30 min mediante tratamiento con ácido cromático. Sumerja completamente los cubreobjetos en una solución de tolueno APTES al 1% (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente mientras los protege de la luz.
    3. Lave el cubreobjetos con tolueno y alcohol etílico absoluto y seque el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno.
    4. Incubar el cubreobjetos a 80 oC durante 15 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.
    5. Añadir 200 l de sulfo-SMCC (1 mg/ml) en solución de dimetilsulfóxido (DMSO) entre dos cubreobjetos inmovilizados e incubar durante 1 h protegido de la luz.
    6. Lavar primero el cubreobjetos con DMSO y luego con alcohol etílico absoluto para eliminar el sulfo-SMCC residual.
    7. Seque el cubreobjetos bajo una corriente de nitrógeno.
    8. Pipet 60 l de 200 m GL-ELP50nm-C solución de proteína en una cubierta funcionalizada e incubar durante aproximadamente 3 h.
    9. Lave el cubreobjetos con agua ultrapura para eliminar el GL-ELP50nm-C no reaccionado.
      NOTA: Los cubreobjetos funcionalizados son capaces durante unas dos semanas bajo almacenamiento a 4 oC.
  2. Preparación funcional de la superficie en voladizo
    1. Limpie los voladizos a 80 oC durante 10 min mediante el tratamiento con ácido cromático.
    2. Funcionalice el voladizo por aminosilanización con 1% (v/v) solución de tolueno APTES y luego hornee el voladizo a 80 oC durante 15 minutos antes de conjugar con sulfo-SMCC.
    3. Vincular el C-ELP50nm-NGL a la superficie con el grupo de maleimida de sulfo-SMCC durante 1,5 h.
    4. Lavar el C-ELP50nm -NGLno reaccionado en la cubierta con agua ultrapura.
    5. Sumergir un voladizo funcionalizado en 200 ml de una solución proteica GL-CBM-XDoc de 50 m que contenga 200 nM de OaAEP1 a 25 oC durante 20-30 min. A continuación, utilice el tampón AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar la proteína no reaccionada.
      NOTA: La química superficial de los voladizos y el cubreobjetos son similares.

3. Preparación escalonada de poliproteínas con secuencias controladas

  1. Vincule la unidad de ligadura Coh-tev-L-POI-NGL al GL-ELP50nm inmovilizado en la superficie de encubrimiento por OaAEP1 durante 30 min.
  2. Utilice 15-20 ml de tampón AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar cualquier proteína no reaccionada.
  3. Añadir 100 ml de proteasa TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerol, pH 8.0) para cortar la unidad proteica en el sitio de reconocimiento teV durante 1 h a 25 oC.
  4. Utilice 15-20 ml de tampón AFM para lavar las proteínas residuales.
  5. Vincule la unidad de ligadura Coh-tev-L-POI-NGL al GL-Ub-NGL-Glass de OaAEP1 durante 30 min.
  6. Repita los pasos 3.3 a 3.5 N-1 veces para construir proteína sconstruir GL-(Ub)n-NGL en la superficie de vidrio. Omita la última reacción de escote TEV para reservar la cohesina en el polímero de proteína como Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Medición y análisis de datos de AFM Experiment

  1. Mediciones de AFM
    1. Añadir 1 mL de buffer AFM a la cámara con 10 mM de CaCl2 y 5 mM de ácido ascórbico.
    2. Elija la punta D de la sonda AFM funcionalizada para el experimento. Utilice el teorema de equipartición para calibrar el voladizo en el búfer AFM con un valor de constante de resorte preciso (k) antes de cada experimento.
    3. Fije la punta del voladizo a la superficie de muestra para formar el par Cohesin/Dockerin.
    4. Retirar el voladizo a una velocidad constante de 400 nms 1 de la superficie. Mientras tanto, registre la curva de extensión de fuerza a una frecuencia de muestreo de 4000 Hz.
  2. Análisis de datos
    1. Utilice los seguimientos de extensión de fuerza de selección de procesamiento de datos JPK.
    2. Utilice el software para analizar las trazas. Ajuste las curvas con el modelo de cadena similar a un gusano (WLC) de elasticidad de polímero y obtenga un incremento de fuerza de despliegue y longitud de contorno para el pico de desdoblamiento de proteínas individuales.
    3. Ajuste los histogramas de las fuerzas de desdoblamiento con el modelo gaussiano para obtener los valores más probables de fuerza de desdoblamiento (u>) y incremento de longitud de curva de nivel (c>).

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Resultados

Los residuos NGL introducidos entre proteínas adyacentes por la ligadura OaAEP1 no afectarán a la estabilidad del monómero de proteína en el polímero, ya que la fuerza de despliegue (u>) y el incremento de la longitud del contorno (c>) es comparable con el estudio anterior(Figura 1). El resultado purificador de la proteína rubredoxina se muestra en la Figura 2. Para probar la proteína después de la escisión TEV es compatible co...

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Discusión

Hemos descrito un protocolo para la biosíntesis enzimática y la inmovilización de poliproteínas y verificado el diseño de poliproteínas por AFM-basado SMFS. Esta metodología proporciona un enfoque novedoso para construir el polímero de proteína en una secuencia diseñada, que complementa los métodos anteriores para la ingeniería poliproteica y la inmovilización4,6,52,53,<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) y el Programa Shuangchuang de la provincia de Jiangsu.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
iron (III) chloride hexahydrateEnergy chemical99%
Zinc chlorideAlfa Aesar100.00%
calcium chloride hydrateAlfa Aesar99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic AcidSigma Life ScienceBio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylateThermo Scientific90%
GlycerolMacklin99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Alfa Aesar
GenesGenscript
Equipment
Nanowizard 4 AFMJPK Germany
MLCT cantileverBruker Corp
Mono Q 5/50 GLGE Healthcare
AKTA FPLC systemGE Healthcare
Glass coverslipSail Brand
Nanodrop 2000Thermo Scientific
Avanti JXN-30 CentrifugeBeckman Coulter
Gel Image SystemTanon

Referencias

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