共培养实验的奥里戈丁细胞和奥里戈丁酸基质的生成

摘要

本文展示了一种用于纯化寡核苷酸物和生产寡核苷酸调节介质的有效方法，可用于共培养实验。

摘要

在中枢神经系统中，寡核苷酸以其在轴向髓中的作用而闻名，通过盐性传导加速作用电位的传播。此外，越来越多的报告表明，寡核苷酸与神经元在骨髓外相互作用，特别是通过可溶性因子的分泌。在这里，我们提出了一个详细的协议，允许从胶质细胞培养物中也含有星形细胞和微胶质细胞的寡核体系细胞进行纯化。该方法依赖于在37°C处过夜摇动，这允许选择性地分离上覆的寡核瘤细胞和微胶质细胞，并通过差分粘附消除微胶质。然后，我们描述了寡核苷酸的培养物和寡核苷酸条件介质（OCM）的生产。我们还在共培养实验中提供OCM治疗或寡核苷酸的动力学，以及纯化海马神经元，研究寡核苷酸-神经元相互作用。

引言

寡核苷酸（OLs）是中枢神经系统（CNS）的胶质细胞，产生围绕轴xon的骨髓素。OLs源自寡核苷酸前体细胞（OPCs），在胚胎中枢神经系统的心室区增殖，然后迁移和分化成完全成熟的OLs（即骨髓形成细胞^）1。OPCs在早期发育期间是丰富的，但也坚持在成人大脑中，在那里他们代表主要的增殖细胞群^2。单个 OL 在非兴奋部分（即节点间）中产生多个阳极，并且每个骨髓环的边缘附着在构成参数域的斧子上，这对骨髓^素1、3的绝缘特性至关重要。在副节点之间是称为Ranvier节点的未骨髓间隙。这些节点富含电压门控钠通道（Nav），允许通过盐性传导⁴再生和快速传播作用电位。这种紧密的相互作用也使得斧道能量支持通过神经元从OLs^5，6的乳酸盐。

寡核苷酸系细胞的成熟和骨髓过程由它们^{与神经元的}相互作用7严格调节。事实上，OLs和OPCs，也叫NG2细胞，表达神经递质的受体阵列，并能接收兴奋和抑制神经元的输入，使它们能够感知神经元活动，可以触发其增殖和/或分化到骨髓细胞^2。反过来，OPCs/OP将微囊和蛋白质分泌到细胞外空间，单独或协同地介导神经调节和神经保护功能8，9，10，11，12。然而，控制寡核遗传细胞和神经元之间多种相互作用模式的分子机制尚未完全破译。

此外，在几个CNS病理条件下，OLs主要受到影响，从而干扰它们与神经元的相互作用。例如，在多发性硬化症 （MS） 中，神经功能障碍是由中枢神经系统中的焦脱髓引起，其次是 OLs 损失，可导致斧道损伤和相关残疾积累。重组可以发生，尽管在大多数情况下还不够^。过去十年的进展，由于免疫疗法的发展，已经降低了复发率，但促进再骨髓化至今仍是一个未满足的需求。因此，更好地了解OLs的作用、功能和影响对于开发针对各种CNS条件的新疗法特别感兴趣。

在这里，我们描述了OLs纯化和培养的方法。这使得能够精确检查调节其发展和生物学的内在机制。此外，这种高度丰富的OLs培养物允许生产寡核苷酸条件介质（OCM），这种介质可以添加到纯化神经元培养物中，从而深入了解OLs分泌因子对神经元生理学和连通性的影响。此外，我们描述了如何实现一个体外共培养系统，其中纯化的寡核苷酸和神经元结合在一起，允许解决调节（再）髓化的机制。

研究方案

本实验中对大鼠的护理和使用符合机构政策和准则（UPMC、INSERM和欧洲共同体理事会指令86/609/EEC）。以下协议是为12只幼崽的标准垃圾建立的。

1. 烧瓶的准备（±5分钟）

注:在无菌条件下在层流罩中进行解剖的前一天执行以下步骤。

1. 使用 5 mL 的聚乙烯胺（PEI，100 mg/L，参见补充文件 1中的协议）涂上 150 厘米²瓶 （T150） 与过滤帽（1 瓶，用于 2 只小狗）。
2. 将烧瓶储存在4°C处过夜。
3. 在解剖当天用无菌蒸馏水冲洗涂覆烧瓶3次。

2. 介质的准备（约10分钟）

注:在无菌条件下在层流罩中执行步骤。

1. 制备500 mL培养基，包括Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM），辅以10%的胎儿小牛血清（FCS）和青霉素链霉素（100 IU/mL）。
2. 在50 mL管中制备20.6 mL的酶消化介质，包括20 mL的DMEM、200 μL的DNase（50μg/mL）、200 μL的木瓜（30 U/mL）和200 μL-半胱氨酸（0.24毫克/mL）。
3. 使用 0.22 μm 过滤器对介质进行过滤消毒。
4. 将介质保持在室温 （RT） 下层流罩中的介质，直到解剖。

3. 解剖准备（约10分钟）

注:在无菌条件下在层流罩中执行步骤。

1. 在不带钙和镁的情况下制备100 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS;1x）。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。
2. 准备50 mL的冰冷1x PBS溶液，辅以750μL45%葡萄糖。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。
3. 将 100 mm 培养皿与 1x PBS 填充，用于清洁仪器和三个 60 mm 培养皿，并带有冰冷的 PBS-葡萄糖，用于组织采集。将培养皿放在冰上，直到解剖。

4. 解剖

注:解剖从男性和女性的威斯塔大鼠幼崽在产后天（P）2。

1. 为了提供无菌环境，请确保用 100% 乙醇清洁工作台。用100%乙醇消毒所有手术工具。
2. 用70%乙醇轻轻喷洒小狗的脖子。
3. 使用大型手术剪刀将动物斩首，并将头部放入含有冰冷PBS-葡萄糖的100毫米培养皿中。
4. 使用弯曲的钳子将动物的头部保持在眼睛水平。使用小手术剪刀在头骨底部做一个小切口，并切下脑中线后的头骨。
5. 使用钳子轻轻地从中线剥离头骨的两个部分。
6. 使用小手术勺将大脑从头腔中取出。将大脑放入含有冰冷PBS-葡萄糖的60毫米培养皿中。
7. 在显微镜下观察时，使用细钳去除脑小脑、脑干和脑球状球。
8. 使用细钳来分离两个脑半球。使用细钳去皮。将脑皮质放入 60 毫米培养皿中放在冰上。
   注: 冰冷的 PBS 对于正确去除脑膜炎至关重要。

5. 组织分离

注:在无菌条件下在层流罩中执行步骤。

1. 使用锋利的手术刀细切脑皮。将切碎的组织转移到含有酶消化培养基的50 mL管中。
2. 在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育30分钟。
3. 使用 p1000 微移液器轻轻去除酶消化介质，同时确保皮质组织保持在 50 mL 管的底部。
4. 使用 p1000 微移液器添加 1 mL 的 DMEM-10% FCS，并轻轻对组织进行三聚。
5. 使用 70 μm 过滤器和 1 mL 注射器的活塞将皮质组织过滤到 50 mL 管中。
   注:使用 DMEM-10% FCS 可以冲洗内管壁上的残余组织多次。
6. 用 DMEM-10% FCS 填充 50 mL 管。在 RT 下以 423 x g离心 5 分钟，小心地去除上清液，用 2 mL 的 DMEM-10%FCS 重新悬浮细胞颗粒。
7. 用p1000微移液器轻轻三聚细胞颗粒，然后用p200微移液器轻轻三聚。用适当的 DMEM-10%FCS 体积稀释细胞悬浮液。
   注: 两个大脑 = 一个 T150 = 5 mL 的 DMEM-10%FCS。
8. 板 5 mL 的细胞悬浮在 T150 上的密度为 1 x 10⁵细胞/cm²。在每个 T150 中添加 20 mL 的暖 DMEM-10% FCS。在37°C以下的_5%CO2下孵育。
9. 在6天体外（DIV）后，用温暖的DMEM-10%FCS更新一半的培养基。

6. 摇动准备

1. 在无菌条件下在层流罩中摇动前一天进行摇动准备。
2. 通过在烧瓶中加入新鲜的温文化介质，在37°C下孵育5%CO_2，更新一半的培养基。

7. 摇动

1. 与 PEI 一起涂上三个 100 mm 培养皿。将它们储存在4°C过夜。
2. 用石蜡薄膜盖住烧瓶盖，并将烧瓶放入塑料袋中。在37°C下，在250rpm下摇动含有胶质细胞的烧瓶过夜。
   注: 第一次晃动在 8 DIV 处执行，一个可以执行最多三个不同的抖动（有关计时，参见图 1）。

8. OL系系细胞收获和培养

注:这些步骤应在无菌条件下在层流罩中执行。

1. 在震动后的第二天，根据表1准备博滕斯坦-萨托（BS）介质。
2. 用无菌蒸馏水冲洗涂覆的培养皿3次。
3. 收获瓶的上清液主要含有OL系系细胞，但也含有一些微胶质细胞，并将其盘在非涂层的100毫米培养皿上。
   注:此步骤允许通过在盘表面的差分快速粘附来去除微胶质细胞。
4. 在37°C下_5%CO2的加湿培养箱中孵育培养15分钟。
5. 将每个T150烧瓶填充25 mL的新鲜制备的培养基，并在37°C的加湿培养箱中孵育，在5%CO₂下孵育，直到第二次晃动。
6. 将上清液从培养皿转移到新的非涂层 100 mm 培养皿中，以允许残留微胶质细胞粘附。
7. 在37°C下_5%CO2的加湿培养箱中孵育培养15分钟。
8. 去除含有非粘附性OL谱系细胞的上清液，并将其转移到50 mL管中（50 mL管的2个培养皿中上清液）。丢弃用微胶质镀的培养皿。
9. 在423 x g下将上清液离心5分钟。小心地去除上清液，用1mL的BS培养基重新悬浮细胞颗粒。将所有颗粒汇集在一个公共的 50 mL 管中，使用 BS 介质将体积调节到 10 mL。
10. 确定显微镜下的细胞密度计数细胞。
    注: 应获得介于 3 x 10⁵/mL 和 5 x 10⁵/mL 之间的单元密度。
11. 如果细胞密度高于或等于 4 x 10⁵/mL，则添加 20 mL 的 BS，以获得 30 mL 的最终体积;如果细胞密度小于 4 x 10⁵/mL，则仅添加 10 mL 的 BS，以获得 20 mL 的最终体积。
12. 板 2 或 3 预涂 100 mm 培养皿，带 10 mL 的细胞悬浮液。在37°C以下的_5%CO2下孵育。
13. 清除培养皿中的碎片，在 2 小时后刷新所有 BS 介质。
    注:在清除前后检查显微镜下的培养物，以验证细胞密度和碎片清除效率。
14. 在37°C下_5%CO2的加湿培养箱中孵育2天。
    注:在显微镜下检查培养。汇合应为 70% 到 80%。

9. OCM 生产

注:在无菌条件下，在层流罩中执行这些步骤。

1. 根据表2准备NB-B27低介质。
2. 使用 10 mL 的热 NB-B27low 介质更新培养基。在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育2天。
3. 收获OCM，即含有OL分泌因子的上清液。使用 0.22 μm 过滤器对 OCM 进行过滤消毒。
   注:将 OCM 储存在 4°C 下，最多存放 2 个月。

10. OCM 添加

注:步骤应在无菌条件下在层流罩中执行。OCM可添加到根据以下协议¹⁴制备的纯化海马神经元培养物中，并在分离后24小时添加抗米质剂尿氨酸和5-氟氧尿氨酸（5μM）36小时。

1. 在3DIV时，去除所有含有抗线粒剂的神经元培养基，并加入500μL的新鲜热OCM。
2. 每3天更新一半的介质，用新鲜制作的热NB-B27。
   注:此类区域性可维护多达 21 DIV。

11. 在纯化海马神经元培养中添加OL

注:在无菌条件下，在层流罩中执行以下步骤。OLs 可以添加到纯化海马培养物中，获得的方式与上述相同。

1. 根据表3准备共同培养媒介。
2. 在 70% 到 80% 的汇合处检索 OL 培养体。用 2 mL 的 1x 热 PBS 冲洗。
3. 要分离细胞，将 2 mL 0.25% 胰蛋白酶添加到 100 mm 培养皿中。
4. 在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育5分钟。
5. 加入2 mL的DMEM-10%FCS以阻止酶反应。收获含有OL系系细胞的上清液。
6. 在RT下以423 x g离心5分钟。小心地去除上清液，并在温暖的共培养基培养基中重新悬浮细胞颗粒，以获得1.25 x 10⁵细胞/mL的浓度。
7. 通过去除200μL的神经元培养基，并在24孔板每孔（2.5 x 10⁴细胞/孔）添加200μL细胞悬浮液，为纯化的海马神经元培养添加OL。
8. 每2-3天刷新一半的共同培养媒介。
   注: 共培养可以维护多达 24 DIV。

结果

在此协议中，OL系系细胞通过摆脱星形细胞和微胶质从胶质培养中纯化。对OL培养物的纯度和质型检查可以通过用胶质标记物进行免疫染色^来评估。对不同标记物表达的分析表明，OL培养物大多是^O4+细胞的90%~4%，85%~7%NG2+细胞，4.7%~2.1%的PLP+细胞，7.2%~2.5%的细胞为GFAP+星细胞（均值=S.D.，n= 3; 图 2.此外，4....

讨论

在这里，我们提供了一个详细的协议，以获得高度丰富的寡核苷酸细胞培养从混合胶质培养，改编自以前出版的方法^16，并随后生产OL条件介质。这种摇动技术不贵，可重复三次，是获得高量纯化OL的最佳方法，因为在含有PDGF®的博滕斯坦-萨托（BS）培养的细胞中培养。胶质细胞是在P2时使用威斯塔大鼠的脑皮质制备的，此时绝大多数的寡核瘤系细胞是表达NG2和O4¹⁵

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington	LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Ethanol 100%	Sigma	32221-M
Ethanol 70%	VWR Chemicals	83801.360
Fetal Calf Serum	ThermoFisher	10082147
L-cysteine	Sigma	C7352
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium	ThermoFisher	A1285601
Polyethylenimine(PEI)	Sigma	P3143
Tetraborate decahydrate	Sigma	B9876
Trypsin	Sigma	Sigma
Uridine	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Insulin	Sigma	I5500
PDGF	Peprotech	AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
T4 (L-Thyroxine)	Sigma	T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Biotin	Sigma	B4639
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Ceruloplasmin	Sigma	239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin	Sigma	I5500
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A8199
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescin	Sigma	P5780
Recombinant Human CNTF	Sigma	450-13
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
Vitamin B12	Sigma	V6629
Tools
0.22 µm filter	Sartorius	514-7010
1 mL syringe	Terumo	1611127
100 mm Petri dish	Dutscher	193100
15 mL tube	Corning Life Science	734-1867
50 mL tube	Corning Life Science	734-1869
60 mm Petri dish	Dutscher	067003
70 µm filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Binocular microscope	Olympus	SZX7
Curved forceps	Fine Science Tools	11152-10
Fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14008-14
Scalpel	Swann-morton	233-5528
Shaker	Infors HT
Small surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Small surgical spoon	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 flask with filter cap	Dutscher	190151
Animal
P2 Wistar rat	Janvier	RjHAn:WI