Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

Zusammenfassung

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Zusammenfassung

Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.

Einleitung

Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren¹. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen². Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin^1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung⁴ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs^5,6.

Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert⁷. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann². OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen^8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.

Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend¹³. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.

Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.

Protokoll

Die Pflege und Verwendung von Ratten in diesem Experiment entspricht den institutionellen Politiken und Leitlinien (UPMC, INSERM und Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaft). Das folgende Protokoll wird für einen Standard-Wurf von 12 Welpen eingerichtet.

1. Vorbereitung der Kolben (ca. 5 min)

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte am Tag vor der Zerlegung in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.

1. Beschichten Sie die 150 cm² Kolben (T150) mit Filterkappe (1 Kolben für 2 Welpen) mit 5 ml Polyethylenimin (PEI, 100 mg/L, siehe Protokoll in Zusatzdatei 1).
2. Lagern Sie die Kolben über Nacht bei 4 °C.
3. Spülen Sie beschichtete Kolben 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser am Tag der Zerlegung.

2. Vorbereitung der Medien (ca. 10 min)

HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.

1. Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium vor, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin (100 I.E./ml).
2. Bereiten Sie 20,6 ml des Enzymverdauungsmediums in einem 50 ml-Rohr vor, bestehend aus 20 ml DMEM, 200 l DNase (50 g/ml), 200 l Papain (30 U/ml) und 200 l L L-Cystein (0,24 mg/ml).
3. Filtern Sie die Medien mit einem 0,22 m-Filter.
4. Halten Sie die Medien in der laminaren Durchflusshaube bei Raumtemperatur (RT) bis zur Zerlegung.

3. Vorbereitung für die Zerlegung (ca. 10 min)

HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.

1. 100 ml phosphatgepufferte Saline ohne Kalzium und Magnesium (PBS; 1x) vorbereiten. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.
2. Bereiten Sie 50 ml eiskalte 1x PBS-Lösung vor, die mit 750 l 45% Glukose ergänzt wird. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.
3. Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 1x PBS für Reinigungsinstrumente und drei 60 mm Petrischalen mit eiskaltem PBS-Glucose für die Gewebeernte. Die Petrischalen auf Eis legen, bis sie zerlegt sind.

4. Dissektion

HINWEIS: Die Dissektion wird von männlichen und weiblichen Wistar Rattenwelpen am postnatalen Tag (P) 2 durchgeführt.

1. Um eine sterile Umgebung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die Bank mit 100% Ethanol gereinigt wird. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit 100% Ethanol.
2. Sprühen Sie den Hals des Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol.
3. Verwenden Sie große chirurgische Scheren, um das Tier zu enthaupten und legen Sie den Kopf in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.
4. Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten. Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie.
5. Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen.
6. Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen. Setzen Sie das Gehirn in eine 60 mm Petrischale, die eiskalte PBS-Glucose enthält.
7. Betrachten unter einem Steromikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, das Hirnstamm und olfaktorische Glühbirnen aus zerebralen Hemisphären zu entfernen.
8. Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen. Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Hirnkortika in einer 60 mm-Petrischale auf Eis legen.
   HINWEIS: Eiskalte Sedieb ist entscheidend für die richtige Entfernung von Meningen.

5. Gewebedissoziation

HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.

1. Verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken. Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 ml-Rohr, das Enzymverdauungsmedium enthält.
2. 30 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
3. Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des 50 ml-Rohrs verbleibt.
4. Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um 1 ml DMEM-10% FCS hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren.
5. Verwenden Sie einen 70-mm-Filter und einen Kolben einer 1 ml Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50 ml-Rohr zu filtern.
   HINWEIS: Mit DMEM-10% FCS kann restliches Gewebe mehrmals an der Innenrohrwand abspülen.
6. Füllen Sie das 50 ml Rohr mit DMEM-10%FCS. Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und Zellpellet mit 2 ml DMEM-10%FCS wieder aufsetzen.
7. Zellpellet mit einer p1000-Mikropipette und dann mit einer p200-Mikropipette sanft trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM-10%FCS.
   HINWEIS: Zwei Gehirne = ein T150 = 5 ml DMEM-10%FCS.
8. Platte 5 ml der Zellsuspension auf einem T150 mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/cm². Fügen Sie jedem T150 20 ml warmes DMEM-10%FCS hinzu. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2.
9. Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums nach 6 Tagen in vitro (DIV) mit warmem DMEM-10%FCS.

6. Schüttelvorbereitung

1. Führen Sie die Schüttelvorbereitung am Tag vor dem Schütteln in einer laminaren Fließhaube unter sterilen Bedingungen durch.
2. Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums, indem Sie frisches warmes Kulturmedium in den Kolben einfließen lassen und bei 37 °C unter 5%_CO2brüten.

7. Schütteln

1. Drei 100 mm Petrischalen mit PEI beschichten. Lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
2. Bedecken Sie die Flaschenkappe mit Paraffinfolie und legen Sie die Kolben in eine Plastiktüte. Schütteln Sie Kolben mit Gliazellen über Nacht bei 250 U/min bei 37 °C.
   HINWEIS: Das erste Schütteln erfolgt bei 8 DIV und man kann bis zu drei verschiedene Schütteln durchführen (siehe Abbildung 1 für Timing).

8. OL Linienzellen Ernte und Kultur

HINWEIS: Diese Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Am Tag nach dem Schütteln bereiten Bottenstein-Sato (BS) Mittel nach Tabelle 1vor.
2. Spülen Sie beschichtete Petrischalen 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser.
3. Erntekolben',-Überstand, der hauptsächlich OL-Linienzellen, aber auch einige mikrogliaale Zellen enthält, und auf nicht beschichteten 100 mm Petrischalen plattieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche.
4. Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
5. Füllen Sie jeden T150 Kolben mit 25 ml warmem, frisch zubereitetem Kulturmedium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2 bis zum zweiten Schütteln.
6. Übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100 mm Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen.
7. Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
8. Entfernen Sie den Überstand, der nicht anhaftende OL-Linienzellen enthält, und übertragen Sie ihn in 50 ml-Rohre (Überstand aus 2 Petrischalen für ein 50 ml-Rohr). Entsorgen Sie Petri-Gerichte, die mit Mikroglia überzogen sind.
9. Zentrifugieren Sie den Überstand für 5 min bei 423 x g. Entfernen Sie überstand es und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1 ml BS-Medium aus. Alle Pellets in einem gemeinsamen 50 ml-Rohr bündeln und volumen auf 10 ml mit BS-Medium einstellen.
10. Bestimmen Sie Zellen, die zellendichte zählen, unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Es sollte eine Zelldichte zwischen 3 x 10⁵/ml und 5 x 10⁵/ml erreicht werden.
11. Fügen Sie 20 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte größer oder gleich 4 x 10⁵/ml ist, um ein Endvolumen von 30 ml zu erhalten, oder fügen Sie nur 10 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte kleiner als 4 x 10⁵/ml ist, um ein Endvolumen von 20 ml zu erhalten.
12. Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100 mm Petrischalen mit 10 ml Zellaufhängung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2.
13. Reinigen Sie die Trümmer der Petri-Gerichte, indem Sie das gesamte BS-Medium 2 H später erfrischen.
    HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop vor und nach der Räumung, um die Zelldichte und die Effizienz der Entfernung von Schmutz zu überprüfen.
14. 2 Tage in BS-Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
    HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Der Zusammenfluss sollte 70 % bis 80 % betragen.

9. OCM-Produktion

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.

1. Vorbereiten NB-B27low Medium nach Tabelle 2.
2. Erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 ml warmem NB-B27low Medium. 2 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
3. Ernten Sie das OCM, d.h. Überstand, der OL-Sekretfaktoren enthält. Filtern Sie OCM mit einem 0,22-mm-Filter.
   HINWEIS: OCM maximal 2 Monate bei 4 °C lagern.

10. OCM-Zusatz

HINWEIS: Die Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. OCM kann gereinigten Hippocampus-Neuronenkulturen hinzugefügt werden, die nach dem folgenden Protokoll¹⁴hergestellt und durch Zugabe von 24 h nach Isolation, den Anti-Mito-Wirkstoffen Uridin und 5-Fluorodeoxyuridin (5 m) für 36 h erhalten werden.

1. Bei 3 DIV entfernen Sie alle Neuronenkulturmedium mit Anti-Mitotik-Mitteln und fügen Sie 500 l frische warme OCM.
2. Erneuern Sie alle 3 Tage die Hälfte des Mediums mit frisch zubereitetem warmen NB-B27.
   HINWEIS: Solche Kulturen können bis zu 21 DIV beibehalten werden.

11. Zugabe von OL zur gereinigten Hippocampus-Neuronenkultur

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus. OLs können gereinigten Hippocampuskulturen hinzugefügt werden, die auf die gleiche Weise erhalten werden wie oben beschrieben.

1. Vorbereiten von Co-Kultur-Medium gemäß Tabelle 3.
2. Rufen Sie die OL-Kultur bei 70% bis 80% Zusammenfluss ab. Spülen Sie mit 2 ml warmem 1x PBS.
3. Um die Zellen zu lösen, fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin zu einer 100 mm Petrischale hinzu.
4. Inkubieren Sie für 5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%_CO2.
5. Fügen Sie 2 ml DMEM-10% FCS hinzu, um die enzymatische Reaktion zu blockieren. Ernten Sie den Überstand, der OL-Abstammungszellen enthält.
6. Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und das Zellpellet in warmem Co-Kulturmedium wieder aufsetzen, um eine Konzentration von 1,25 x 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
7. Fügen Sie OL zu gereinigten Hippocampus-Neuronen Kultur durch entfernen 200 l Neuronkultur Medium und Hinzufügen von 200 l Zellsuspension pro Brunnen (2,5 x 10⁴ Zellen/ Well) einer 24-Well-Platte.
8. Erfrischen Sie alle 2-3 Tage die Hälfte des Co-Kulturmediums.
   HINWEIS: Kokulturen können bis zu 24 DIV gepflegt werden.

Ergebnisse

In diesem Protokoll werden OL-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt werden. Reinheit und phänotypische Untersuchung von OL-Kulturen kann durch Immunfärbung mit Gliamarkern¹⁵beurteilt werden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass OL-Kulturen meist Vor-OLs waren, wobei 90 % 4 % der O4^+-Zellen, 85 % bei 7 % NG2⁺ Zellen und 4,7 % 2,1 % der PLP⁺ Zellen, während 7,2...

Diskussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode¹⁶, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
D-(+)-Glucose solution	Sigma	G8769
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington	LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Ethanol 100%	Sigma	32221-M
Ethanol 70%	VWR Chemicals	83801.360
Fetal Calf Serum	ThermoFisher	10082147
L-cysteine	Sigma	C7352
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Papain	Worthington	LS003126
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium	ThermoFisher	A1285601
Polyethylenimine(PEI)	Sigma	P3143
Tetraborate decahydrate	Sigma	B9876
Trypsin	Sigma	Sigma
Uridine	Sigma	U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Insulin	Sigma	I5500
PDGF	Peprotech	AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
T4 (L-Thyroxine)	Sigma	T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human	Sigma	T1147
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Biotin	Sigma	B4639
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma	A4161
Ceruloplasmin	Sigma	239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher	31966021
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Insulin	Sigma	I5500
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A8199
Neurobasal	ThermoFisher	21103049
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescin	Sigma	P5780
Recombinant Human CNTF	Sigma	450-13
Sodium selenite	Sigma	S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)	Sigma	T6397
Vitamin B12	Sigma	V6629
Tools
0.22 µm filter	Sartorius	514-7010
1 mL syringe	Terumo	1611127
100 mm Petri dish	Dutscher	193100
15 mL tube	Corning Life Science	734-1867
50 mL tube	Corning Life Science	734-1869
60 mm Petri dish	Dutscher	067003
70 µm filter	Miltenyi Biotec	130-095-823
Binocular microscope	Olympus	SZX7
Curved forceps	Fine Science Tools	11152-10
Fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14008-14
Scalpel	Swann-morton	233-5528
Shaker	Infors HT
Small surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Small surgical spoon	Bar Naor Ltd	BN2706
T150 cm2 flask with filter cap	Dutscher	190151
Animal
P2 Wistar rat	Janvier	RjHAn:WI