通过质谱成像对 萨利克斯阿尔巴 叶中异种生物代谢的调查

摘要

这种方法使用质谱成像（MSI）来了解在接触异种生物时 ，S.阿尔巴 叶的代谢过程。该方法允许在特定、完整的组织内对感兴趣的化合物及其预测的代谢物进行空间定位。

摘要

所介绍的方法使用质谱成像（MSI）来建立 S.阿尔巴 叶在接触异种生物时的代谢轮廓。使用非靶向方法，在植物组织中识别和本地化感兴趣的植物代谢物和异种生物，以发现特定的分布模式。然后，在从已识别的异种生物中预测潜在的代谢物（即代谢物和结合物）。当异生物代谢物位于组织中时，记录植物改变其所涉及的酶类型。这些结果用于描述在 S.alba 叶中发生的不同类型的生物反应，以回应叶子中的异生物积累。代谢物在两代人中预测，允许记录连续的生物反应，以改变叶组织中的异种生物。

引言

由于人类活动，异种生物在世界各地广泛分布。其中一些化合物是水溶性，并被土壤¹吸收，并进入食物链时，他们积累在植物组织^2，3，4。这些植物被昆虫和食草动物吃掉，它们是其他生物的猎物。一些异种生物的摄入及其对植物健康的影响被描述为^{5，6，7，8，}但最近才在组织水平^9。因此，目前还不清楚异种生物代谢发生于何处或如何发生，或者特定植物代谢物是否与特定组织^中的异生物积累相关。此外，大多数研究忽视了植物中异种生物及其代谢物的新陈代谢，因此对植物组织中的这些反应知之甚少。

这里建议的是一种研究生物样本中的酶反应的方法，该反应可以与基质和反应产品的组织定位相关。该方法可以在一个实验中绘制生物样本的完整代谢剖面，因为分析是无针对性的，并且可以使用感兴趣的定制分析列表进行调查。提供的是在原始数据集中跟踪的候选人列表。如果在样本中注意到一个或几个感兴趣的分析，特定的组织定位可以提供有关相关生物过程的重要信息。然后，利用相关的生物定律在硅中修改感兴趣的分析，以寻找可能的产品/代谢物。然后，通过识别所涉及的酶并本地化组织中的反应来分析原始数据，从而帮助了解发生的代谢过程。没有其他方法提供生物样本中发生的反应类型、感兴趣化合物的本地化及其相关代谢物的信息。一旦有新鲜和完整的组织，并且感兴趣的化合物可以电解，这种方法可用于任何类型的生物材料。拟议的议定书发表在《维莱特》等¹² 期中，详见此处供科学界使用。

研究方案

1. 样品准备

1. 获取生物样本，要么保持新鲜和完好无损（例如，不要强迫它进入管子），要么将其冻结。拟议的协议适用于任何类型的固体生物样本（即植物、动物或人体组织），以本地化特定组织中的化合物。
2. 冷却低温微分到-20°C。 将样品支架和刀片保持在相同的温度下。
3. 如有必要，将对象嵌入 M1 嵌入介质中，以便在切割过程中保存它。
   1. 将一些基质倒入放置在低温微分室的塑料模具中。快速添加样品，并倒入一些更多的嵌入介质，以覆盖它。当基质凝固并冷却时，将样品保持在模具中心。
      注:并非所有生物物体都需要嵌入。同质物体，如老鼠的大脑不需要嵌入介质，可以切割冻结。
4. 将嵌入式或冷冻样品放在低温微分架上，用锋利的刀片切割。5-30 μm 的厚度对植物样本有好处，由于植物样本的异质性，这些样品很难切割。将切割厚度和温度调整到样品中，进行多次切割以找到最佳条件。在提供的示例中，样本被切割为 -20 °C。 考虑将样品保持在 0 °C 以下，以避免样品退化。
   注意:使用放置在低温显微镜旁边的双目显微镜可以帮助确定切片的质量。组织必须完好无损。
5. 使用钳子或小画笔小心地将切片移到 ITO 涂层的滑梯上，然后将手指放在滑梯下，以加热和干燥样品。将幻灯片保存在冷冻微分室中，直到所有样品都准备好。慢慢将滑梯从房间中滑出，以避免热冲击。
   注意:要检查幻灯片的哪一侧涂有 ITO 涂层，请在室温 （RT） 下在幻灯片上放置一滴水。掉落将停留在 ITO 涂层侧或未涂层侧的扁平上。
6. 使用薄记号笔或校正液在幻灯片上绘制标记，并在矩阵沉积前使用高分辨率扫描仪扫描。当样品在质谱仪中时，这些标记将用于确定样品在幻灯片上的确切位置。获得精确参照点的最佳方法是绘制十字架。

2. 矩阵沉积

1. 准备MALDI矩阵:重70毫克的α-氰诺-4-羟基辛酸（HCCA）基质，并稀释在10mL的水和甲醇溶液（50:50）与0.2%TFA。在RT将矩阵固化10分钟。声波化后可能有额外的固体矩阵。
   注:根据感兴趣的分析，可以使用不同类型的 MALDI 矩阵。
2. 用100%甲醇清洁基质沉积机器人。
3. 使用甲醇和精密擦拭，清洁滑梯，保持样品不接触他们，不删除痕迹。在没有样品的区域中，在幻灯片上添加干净的盖片。然后将幻灯片的这一部分放置在光学探测器上以跟踪矩阵沉积。
   注意:要光学跟踪矩阵厚度，滑梯和盖片必须非常干净。
4. 使用机器人进行矩阵沉积:在储层中只放置 6 mL 的基质溶液，并添加 2 mL 的 100% 甲醇，总容量为 8 mL。
   注:沿沉积的矩阵厚度记录是自动的，可以使用 USB 棒恢复。喷洒方法的开发在这里没有详细说明。

3. 数据获取

1. 将矩阵的 1μL 放在 MALDI 板上，以使用矩阵峰值作为参考来校准质谱仪。质谱仪采集方法的开发情况没有详细说明。
   1. 将 MALDI 板插入源中，单击 ftms 控制软件中的"加载目标"，然后等待板被加载。
   2. 单击代表 MALDI 板的图像中的点，选择矩阵点的位置。
   3. 在软件的"示例信息"选项卡中注明示例名称和文件夹。
   4. 通过单击"收购"开始获取。
   5. 在收购过程中，使用"MALDI 视频"选项卡上的鼠标指头稍微移动板，使激光点位于不同的点。
   6. 收购完成后，转到"校准"选项卡，在二次模式下选择HCCA 校准列表，然后单击自动。全球校准结果在"校准图"窗口中表示，对于 SolariX XR 7T，应小于 0.2 ppm。
   7. 如果校准良好，请单击"接受"并保存方法。
2. 样品上的基质沉积完成后，将幻灯片放在幻灯片适配器中，并使用塑料盖检索标记的位置。
3. 在灵活的图像软件中，使用打开软件的第一个窗口设置新的成像运行。
   1. 命名成像运行，选择 结果目录，然后单击 "下一步"。
   2. 指示鼠标大小（即用户定义的测量区域），选择要使用的方法（在第 3.1 节校准），然后单击 "下一步"。
   3. 在扫描幻灯片并单击 "下一步"后，加载在第 1.6 步获得的幻灯片的光学图像。
   4. 图像在更宽的窗口中打开。使用幻灯片上的标记来教导幻灯片的位置:在 ftmsControl中，将 MALDI 视频窗口的目标放在标记的确切位置上，然后返回 felx 图像 并单击光学图像上的完全相同的点。重复三个独立点。带有标记的塑料盖被放置在MALDI板上，以恢复其位置并便于教学。
      注意:如果标记是用标记制作的，在幻灯片背面添加白色校正液可以使它们在教学过程中脱颖而出。
4. 使用"添加测量区域"工具在柔性图像软件中绘制样品感兴趣的区域。
5. 如果要分析几个样本，则保存成像运行和"自动序列"。
6. 如果分析多个样本，则使用"自动执行批次流体"启动序列。
   注意:定期将数据同步到安全位置。

4. 数据处理

1. 将原始数据导入可视化软件 （SCILS 实验室），并创建数据集。此软件中分两个单独的步骤完成此操作。
   1. 使用"批量导入器"工具并选择原始数据、指示目标目录并单击"导入"。
   2. 导入后，可以组合多个数据集进行进一步分析。要组合数据集，请使用"文件|新|数据集"工具。
   3. 选择用于获取的仪器类型，通过单击"+"添加导入数据集，并通过单击和拖动对象来排列图像。
   4. 检查质量范围设置或在需要时通过指示兴趣范围进行修改。单击 "下一步 "查看导入摘要并启动导入。
2. 可视化样品和/或不同样品中不同组织中感兴趣的 m/z。 只需单击 光谱 即可选择感兴趣的 m/z 或在 m/z 框中键入值。
   1. 如果需要，执行统计测试，以搜索不同组织和/或不同样本之间的共局部或歧视值，以确定感兴趣的 m/z。 这些工具在"工具"菜单中可用，不会在此协议中描述。
3. 从对象选项卡中导出感兴趣的m/z（例如，同地化、歧视性化合物）作为.csv文件。如果数据集不是太大（即最多 60，000 行），则也可以导出整个数据集。单击红色箭头指示的兴趣区域右侧的"出口"图标。
4. 导入.csv文件，以便在注释软件 （Metaboscape） 中创建新的数据集。点击"项目|导入CSV项目"。请注意，将只考虑确切的 m/z， 并且丢失了同位素配置文件。
   注:5.0 软件版本允许从可视化软件直接导入数据，从而能够更准确地注释，因为可以考虑同位素配置文件。
5. 附有定制分析列表的注释，这些列表可以从公开的数据库中提取。软件会给出一个模板来创建分析列表。
6. 使用预测软件（代谢物预测）对注释化合物的代谢物进行硅基预测。需要开发利益复合物的公式，要么由软件中的用户绘制，要么导入为 .mol 文件。然后，该方法是一个简单的分步协议。
7. 恢复代谢物列表，创建分析列表，并在注释软件中使用它用预测代谢物注释原始数据。或者，如果代谢物列表很短，则手动按步骤 4.8 搜索。
8. 可视化软件中原始数据中代谢物的组织分布。
9. 通过右键单击预测的兴趣代谢物，恢复预测软件中代谢过程中所涉及的酶的名称。

结果

此协议适用于从暴露于环境中的异种生物的S. alba树中采样的新鲜叶子。这个过程在图1中描述。第一步是准备兴趣样本的薄片。植物样本通常比动物样本更难切割，因为组织是异质的，可以含有水和/或空气。此困难使用嵌入介质处理，在样品周围形成均匀块。矩阵沉积通过使用机器人，避免手部操纵和确保可重复的结果而得到促进。MALDI基质层厚度在整个过程中遵循?...

讨论

此协议的关键部分是样品准备:样品必须柔软且完好无损。切割是最困难的部分，因为样品的温度和厚度可能因所研究的样品类型而异。动物组织通常是同质的，更容易切割。植物样本通常包含不同的结构，因此由于刀片遇到软、硬或空血管组织，因此更难保持完好无损。强烈建议在与植物样本一起工作时使用新鲜组织，以避免在亲水组织中形成冰并破坏冰。切片存放在 ITO 涂层滑梯上时，必须轻?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed