חקירת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בעלי אלבה סליקס באמצעות הדמיה ספקטרומטרית מסה

Summary

שיטה זו משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי להבין תהליכים מטבוליים בעלי S. alba כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. השיטה מאפשרת לוקליזציה מרחבית של תרכובות מעניינות ואת המטבוליטים החזויים שלהם בתוך רקמות ספציפיות ושלמות.

Abstract

השיטה המוצגת משתמשת בהדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) כדי לקבוע את הפרופיל המטבולי של עלי ס. אלבה כאשר הם נחשפים לשנאת קסנוביוטיקה. באמצעות גישה לא ממוקדת, מטבוליטים צמחיים ושנאת זרים של עניין מזוהים ומקומיים ברקמות הצמח כדי לחשוף דפוסי הפצה ספציפיים. לאחר מכן, בחיזוי סיליקו של מטבוליטים פוטנציאליים (כלומר, קטבוליטים ומצוות) מן xenobiotics מזוהה מבוצע. כאשר מטבוליט xenobiotic ממוקם ברקמה, סוג של אנזים המעורב בשינוי שלה על ידי הצמח נרשם. תוצאות אלה שימשו לתיאור סוגים שונים של תגובות ביולוגיות המתרחשות עלים S. אלבה בתגובה הצטברות xenobiotic בעלים. המטבוליטים חזו בשני דורות, מה שאיפשר לתיעוד של תגובות ביולוגיות רצופות להפוך קסנוביוטיקה ברקמות העלים.

Introduction

Xenobiotics מופצים באופן נרחב ברחבי העולם בשל פעילות אנושית. חלק מהתרכובות הללו מסיסות במים ונספגות באדמה¹, ונכנסות לשרשרת המזון כאשר הן מצטברות ברקמות צמחיות^2,3,4. הצמחים נאכלים על ידי חרקים ואוכלי עשב, שהם טרף לאורגניזמים אחרים. צריכת כמה xenobiotics והשפעתם על בריאותו של הצמח תוארו^5,6,7,8, אבל רק לאחרונה ברמת רקמה⁹. לכן, עדיין לא ברור איפה או איך חילוף החומרים של xenobiotics מתרחשת, או אם מטבוליטים צמחיים ספציפיים מתואמים הצטברות xenobiotic ברקמות ספציפיות¹⁰. יתר על כן, רוב המחקר התעלם חילוף החומרים של xenobiotics ואת המטבוליטים שלהם בצמחים, כל כך מעט ידוע על תגובות אלה ברקמות הצמח.

מוצעת כאן שיטה לחקור תגובות אנזימטיות בדגימות ביולוגיות שיכולות להיות קשורות לוקליזציה רקמה של מצעים ומוצרים של התגובות. השיטה יכולה לצייר את הפרופיל המטבולי המלא של מדגם ביולוגי בניסוי אחד, שכן הניתוח אינו ממוקד וניתן לחקור אותו באמצעות רשימות מותאמות אישית של אנליטים מעניינים. מסופקת רשימה של מועמדים במעקב בקבוצת הנתונים המקורית. אם מנתח אחד או יותר של עניין מצוינים במדגם, לוקליזציה הרקמה הספציפית יכולה לספק מידע חשוב על התהליכים הביולוגיים הקשורים. ניתוח עניין לאחר מכן ניתן לשנות silico באמצעות חוקים ביולוגיים רלוונטיים כדי לחפש מוצרים אפשריים / מטבוליטים. רשימת המטבוליטים המתקבלים משמשת לאחר מכן לניתוח הנתונים המקוריים על ידי זיהוי האנזימים המעורבים ו לוקליזציה של התגובות ברקמות, ובכך מסייע להבין את התהליכים המטבוליים המתרחשים. אף שיטה אחרת אינה מספקת מידע על סוגי התגובות המתרחשות בדגימות הביולוגיות, לוקליזציה של תרכובות מעניינות, ומטבוליטים הקשורים אליהן. שיטה זו יכולה לשמש על כל סוג של חומר ביולוגי פעם רקמות טריות ושלמות זמינים ואת תרכובות של עניין ניתן ליינן. הפרוטוקול המוצע פורסם ב-Villette et al.¹² ומפורט כאן לשימוש הקהילה המדעית.

Protocol

1. הכנה לדוגמה

1. להשיג את הדגימה הביולוגית או לשמור אותו טרי ושלם (למשל, לא לכפות אותו לתוך צינור) או להקפיא אותו. הפרוטוקול המוצע חל על כל סוג של מדגם ביולוגי מוצק (כלומר, רקמות צמחיות, בעלי חיים או אנושיות) כדי להתאים תרכובות ברקמות ספציפיות.
2. מצננים קריומיקרוטום ל-20 מעלות צלזיוס. שמור את מחזיק הדגימה ואת הלהב באותה טמפרטורה.
3. במידת הצורך, הטבע את האובייקט במדיום הטבעה M1 כדי לשמר אותו במהלך החיתוך.
   1. יוצקים קצת מטריצה בתבנית פלסטיק ממוקם בתא cryomicrotome. מוסיפים במהירות את המדגם ויוצקים עוד קצת מדיום הטמעה כדי לכסות אותו. שמור על המדגם במרכז התבנית כמו המטריצה מתגבשת תוך קירור.
      הערה: הטבעה אינה הכרחית עבור כל האובייקטים הביולוגיים. אובייקטים הומוגניים כגון מוחות עכבר אינם זקוקים למדיום הטמעה וניתן לחתוך אותם קפואים.
4. מניחים את הדגימה המוטבעת או הקפואה על מחזיק הקריומיקרוטום וחותכים אותה בלהב חד. עובי של 5-30 מיקרומטר טוב לדגימות צמחים, שקשה לחתוך בגלל ההטרוגניות שלהם. להתאים את עובי החיתוך ואת הטמפרטורה למדגם, מה שהופך כמה חתכים כדי למצוא את התנאים הטובים ביותר. בדוגמה שסופקה, המדגם נחתך ב -20 °C (69 °F). שקול לשמור את המדגם תחת 0 °C (60 °F) כדי למנוע השפלה מדגם.
   הערה: השימוש במיקרוסקופ משקפת הממוקם ליד הקריומיקרוטום יכול לעזור לקבוע את איכות הפרוסות. הרקמות חייבות להישאר שלמות.
5. הזז בזהירות את הפרוסה לשקופית מצופה ITO באמצעות מלקחיים או מברשת צבע קטנה ולאחר מכן הנח אצבע מתחת לשקופית כדי לחמם ולייבש את הדגימה. שמור את השקופית בתא cryomicrotome עד שכל הדגימות מוכנות. מוציאים את השקופית מהתא באיטיות כדי למנוע הלם חום.
   הערה: כדי לבדוק איזה צד של המגלשה מצופה ITO, הנח טיפת מים על המגלשה בטמפרטורת החדר (RT). הירידה תישאר עגולה בצד מצופה ITO או תשטח בצד הלא מצופה.
6. צייר סימנים בשקופית באמצעות עט סמן דק או נוזל תיקון וסרוק אותו באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה לפני תצהיר מטריצה. הסימנים ישמשו לקביעת המיקום המדויק של הדגימה בשקופית כאשר היא נמצאת בספקטרומטר המסה. הדרך הטובה ביותר להשיג נקודות התייחסות מדויקות היא לצייר צלב.

2. תצהיר מטריקס

1. הכינו את מטריצת MALDI: שוקלים 70 מ"ג של מטריצת חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסינמית (HCCA) ומדללים אותה ב-10 מ"ל של תמיסת מים ומתנול (50:50) עם 0.2% TFA. Sonicate המטריצה במשך 10 דקות ב RT. ייתכן שיש מטריצה מוצקה נוספת לאחר sonication.
   הערה: סוגים שונים של מטריצות MALDI ניתן להשתמש בהתאם לניתוח של עניין.
2. נקה את רובוט התצהיר מטריצה עם 100% מתנול.
3. באמצעות מתנול וניגוב מדויק, לנקות את השקופית, מחזיק את הדגימות מבלי לגעת בהם מבלי להסיר את הסימנים. הוסף כיסוי נקי מעל השקופית באזור ללא דגימה. חלק זה של השקופית ממוקם לאחר מכן מעל הגלאי האופטי כדי לעקוב אחר תצהיר מטריקס.
   הערה: כדי לעקוב באופן אופטי אחר עובי המטריצה, השקופית והכיסוי חייבים להיות נקיים מאוד.
4. השתמש ברובוט לתצהיר מטריצה: למקם רק 6 מ"ל של פתרון המטריצה במאגר, ולהוסיף 2 מ"ל של 100% מתנול עבור נפח כולל של 8 מ"ל.
   הערה: הקלטת עובי המטריצה לאורך התצהיר היא אוטומטית וניתן לשחזר אותה באמצעות מקל USB. הפיתוח של שיטת ריסוס אינו מפורט כאן.

3. רכישת נתונים

1. מניחים μL אחד של המטריצה על צלחת MALDI כדי לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות פסגות המטריצה כהפניות. הפיתוח של שיטת רכישה בספקטרומטר המסה אינו מפורט כאן.
   1. הכנס את לוח ה- MALDI למקור, לחץ על "טען יעד" בתוכנת ftmsControl והמתן לטעינת הצלחת.
   2. בחר את המיקום של מקום המטריצה על ידי לחיצה על המקום בתמונה המייצגת את לוח MALDI.
   3. ציין את השם לדוגמה ואת התיקיה בכרטיסיה "מידע לדוגמה" של התוכנה.
   4. התחל רכישה על ידי לחיצה על "רכישה".
   5. הזז את הצלחת מעט במהלך הרכישה באמצעות מצביע העכבר בכרטיסיה "וידאו MALDI" כך שהלייזר מצביע בנקודות שונות.
   6. לאחר השלמת הרכישה, עבור לכרטיסיה "כיול", בחר רשימת כיול HCCA במצב ריבועי ולחץ על אוטומטי. תוצאת הכיול הכללית מצוינת בחלון "התוויית כיול" וצריכה להיות קטנה מ- 0.2 עמודים לדקה עבור SolariX XR 7T.
   7. אם הכיול תקין, לחץ על "קבל" ושמור את פעולת השירות.
2. לאחר סיום תצהיר המטריצה על הדגימות, מקם את השקופית במתאם שקופית ואחזר את מיקום הסימנים באמצעות כיסוי פלסטיק.
3. ב- flexהגדרת תוכנה, הגדר הפעלת דימות חדשה באמצעות החלון הראשון שנפתח עם התוכנה.
   1. תן שם להפעלת הדימות, בחר את ספריית התוצאותולחץ על הבא.
   2. ציין את גודל הרסטר (כלומר, אזור מדידה המוגדר על-ידי המשתמש), בחר את השיטה לשימוש (מכוילת בסעיף 3.1) ולחץ על הבא.
   3. טען את התמונה האופטית של השקופית שהושגה בשלב 1.6 לאחר סריקת השקופית ולחץ על הבא.
   4. התמונה נפתחת בחלון רחב יותר. השתמש בסימונים בשקופית כדי ללמד את מיקום השקופיות: ב- ftmsControl, מקם את היעד של חלון הווידאו MALDI על המיקום המדויק של סימן, ולאחר מכן חזור felxImaging ולחץ על אותה נקודה בדיוק על התמונה האופטית. חזור על פעולה זו עבור שלוש נקודות עצמאיות. כיסוי פלסטיק הנושא את הסימנים ממוקם על צלחת MALDI כדי לשחזר את מיקומו להקל על ההוראה.
      הערה: אם הסימנים נעשו עם סמן, הוספת נוזל תיקון לבן בחלק האחורי של השקופית יכול לגרום להם להתבלט במהלך ההוראה.
4. צייר את אזורי העניין בדוגמאות בתוכנת flexImaging באמצעות הכלים "הוספת אזורי מדידה".
5. שמור את הפעלת ההדמיה ואת "רצף AutoXecute" אם יש לנתח מספר דגימות.
6. הפעל רצף באמצעות "רץ אצווה AutoXecute" אם מספר דגימות מנותחות.
   הערה: סנכרן את הנתונים באופן קבוע למיקום מאובטח.

4. עיבוד נתונים

1. יבא את הנתונים הגולמיים לתוכנת הפריטים החזותיים (SCiLS Lab) וצור ערכת נתונים. פעולה זו מתבצעת בשני שלבים נפרדים בתוכנה זו.
   1. השתמש בכלי "יבואן אצווה" ובחר את הנתונים הגולמיים, ציין את ספריית היעד ולחץ על "יבא".
   2. לאחר הייבוא, ניתן לשלב מספר ערכות נתונים לצורך ניתוח נוסף. כדי לשלב ערכות נתונים, השתמש ב "קובץ| חדש| הכלי ערכת נתונים ".
   3. בחר את סוג המכשיר המשמש לרכישה, הוסף את ערכות הנתונים המיובאות על-ידי לחיצה על "+", וסדר את התמונות על-ידי לחיצה וגרירה של האובייקטים.
   4. בדוק את הגדרות טווח המסה או שנה במידת הצורך על-ידי ציון טווח העניין. לחץ על הבא כדי לראות את סיכום הייבוא ולהפעיל את הייבוא.
2. דמיינו את מ/ז של עניין ברקמות השונות של מדגם ו/או בדגימות שונות. כל שעליך לעשות הוא ללחוץ על הספקטרום כדי לבחור m/z של עניין או להקליד את הערך בתיבה m / z .
   1. בצע בדיקות סטטיסטיות במידת הצורך כדי לחפש ערכים קולוקלים או מפלים בין רקמות שונות ו /או דגימות שונות כדי לקבוע את m/z של עניין. הכלים זמינים בתפריט "כלי" ולא יתוארו בפרוטוקול זה.
3. יצא את m/z של עניין (למשל, colocalized, תרכובות מפלות) כקובץ .csv מהכרטיסיה אובייקט. ניתן גם לייצא את ערכת הנתונים כולה אם היא אינה גדולה מדי (כלומר, מקסימום 60,000 שורות). לחץ על הסמל "ייצוא" בצד השמאלי של אזור העניין המצוין על-ידי חץ אדום.
4. יבא את קובץ .csv כדי ליצור ערכת נתונים חדשה בתוכנת הביאור (Metaboscape). לחץ על "פרויקטים | יבא פרוייקט CSV". שים לב שרק m/z המדויק ייחשב, והפרופיל האיזוטופי יאבד.
   הערה: גרסת התוכנה 5.0 מאפשרת ייבוא ישיר של נתונים מתוכנת ההדמיה, המאפשרת ביאור מדויק יותר, מכיוון שניתן לשקול את הפרופיל האיזוטופי.
5. ביאורים עם רשימות ניתוח מותאמות אישית, שניתן לגזור ממסדי נתונים הזמינים לציבור. תבנית ניתנת על-ידי התוכנה כדי ליצור רשימות ניתוח.
6. השתמש בתוכנת החיזוי (Metabolite Predict) כדי לבצע חיזוי silico של מטבוליטים של תרכובות מבוארות. הנוסחה המפותחת של תרכובת העניין נדרשת, נמשכת על ידי המשתמש בתוכנה או מיובאת כקובץ .mol אז השיטה היא פרוטוקול פשוט צעד אחר צעד.
7. לשחזר את הרשימה של מטבוליטים, ליצור רשימת אנליט, ולהשתמש בו בתוכנת ביאור כדי להוסיף ביאורים נתונים גלם עם מטבוליטים חזויים. לחלופין, אם רשימת המטבוליטים קצרה, חפש אותה באופן ידני בשלב 4.8.
8. דמיינו את התפלגות הרקמות של המטבוליטים בנתונים הגולמיים בתוכנת ההדמיה.
9. לשחזר את השמות של האנזימים המעורבים בתהליכים מטבוליים בתוכנת החיזוי על ידי לחיצה ימנית על המטבוליט החזוי של עניין.

תוצאות

פרוטוקול זה הוחל על עלים טריים שנדגמו מעץ ס. אלבה שנחשף לשנאת קסנוביוטיקה בסביבה. התהליך מתואר באיור 1. הצעד הראשון הוא להכין פרוסות דקות של מדגם של עניין. דגימות צמחים הן לעתים קרובות קשה יותר לחתוך מאשר דגימות בעלי חיים, כמו הרקמות הטרוגניות והוא יכול להכיל מים ו / או א...

Discussion

החלק הקריטי של פרוטוקול זה הוא הכנת המדגם: המדגם חייב להיות רך ושלם. חיתוך הוא החלק הקשה ביותר, שכן הטמפרטורה ועובי המדגם יכולים להשתנות בהתאם לסוג המדגם שנחקר. רקמות בעלי חיים הן בדרך כלל הומוגניות וקל יותר לחתוך. דגימות צמחים לעתים קרובות לשלב מבנים שונים ולכן קשה יותר לשמור על שלם כמו הל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed