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摘要

我们提出了基于马铃薯病毒X（PVX）的microRNA沉默（VbMS）系统的详细方案，以功能性地表征马铃薯中的内源性microRNA（miRNA）。将目标miRNA的靶向拟态（TM）分子整合到PVX载体中，并在马铃薯中瞬时表达，以沉默靶miRNA或miRNA家族。

摘要

基于病毒的microRNA沉默（VbMS）是一种快速有效的工具，用于植物中microRNA（miRNA）的功能表征。VbMS系统已被开发并应用于各种植物物种，包括 Nicotiana benthamiana，番茄，拟南芥，棉花和单子叶植物，如小麦和玉米。在这里，我们描述了一个详细的方案，使用基于PVX的VbMS载体来沉默马铃薯中的内源性miRNA。为了降低特定miRNA的表达，设计了目标miRNA的靶向模拟（TM）分子，将其整合到植物病毒载体中，并通过 农杆菌 浸润在马铃薯中表达，以直接与感兴趣的内源性miRNA结合并阻断其功能。

引言

植物微RNA （miRNA） 的特征是 20–24 个核苷酸长、核编码的调节性 RNA1 ，在植物生物过程的几乎每个方面都起着重要作用，包括生长和发育2、3、光合作用和代谢4、5、6、7、激素合成和信号传导8、9、生物和非生物反应10，11，12，13，以及营养和能量调节14，15。植物miRNA的调节作用是良好编程的，通常在转录后水平上通过切割或翻译抑制靶标mRNA来实现。

在马铃薯中miRNA的鉴定、转录谱分析和靶标预测方面取得了巨大进展16、17、18、19、20、21。然而，由于缺乏高效和高通量的遗传方法，包括马铃薯在内的植物中miRNA的功能表征落后于其他生物体。通过标准功能丧失分析对单个miRNA进行功能分析具有挑战性，因为大多数miRNA属于具有相当遗传冗余的家族22。此外，单个miRNA可以控制多个靶基因23 ，几个不同的miRNA可以协同调节相同的分子途径24，25。这些特性使得难以表征特定miRNA或miRNA家族的功能。

miRNA的大部分功能分析在很大程度上依赖于具有明显局限性的功能增益方法。人工miRNA（amiRNA）方法利用内源性原代转录本（pri-miRNA）在高水平上产生miRNA，从而抑制靶基因表达26，27，28，29。然而，使用强本构35S启动子的活化标记和miRNA过表达通常会导致miRNA的表达升高，这些表达不代表体内条件，因此可能无法反映miRNA30的内源性功能。已经开发了一种替代方法，涉及表达在结合和/或切割位点中含有不易脱位突变的靶基因的miRNA抗性形式31，32，33。但是，由于转基因伪影，这种方法也可能导致对源自miRNA耐药靶基因的表型的误解。因此，应谨慎从这些功能获得研究中得出结论34。上述方法的另一个主要局限性是它们需要转换，这是劳动密集型和耗时的。此外，转基因依赖性方法几乎不适用于顽固的植物物种。因此，必须开发一种快速有效的功能丧失方法来解开miRNA的功能。

为了绕过转化过程的先决条件，通过将靶向模拟（TM）策略与病毒衍生载体相结合，建立了基于病毒的microRNA沉默（VbMS）。在VbMS系统中，人工设计的TM分子从病毒骨架瞬时表达，为解剖植物内源性miRNA的功能提供了一种功能强大，高通量和省时的工具35，36。VbMS最初是在边 楸 和番茄中与烟草拨浪鼓病毒（TRV）35，36，37 一起开发的，并且已经扩展到拟南芥，棉花，小麦和玉米，使用各种其他病毒表达系统，包括马铃薯病毒X（PVX）38，棉花屑病毒（ClCrV）39，黄瓜花叶病毒（CMV）40，41，42，中国小麦花叶病毒（CWMV）43和大麦条纹花叶病毒（BSMV）44，45。

马铃薯（Solanum tuberosum）是世界上第四大粮食作物，也是种植最广泛的非藜麦作物，主要是因为它具有高营养价值、高能量产量和相对较低的投入要求46。马铃薯的几个特点使其成为一种有吸引力的双子叶植物模型植物。它是一种营养繁殖的多倍体作物，具有高越交率，杂合性和遗传多样性。然而，迄今为止，还没有报告使用VbMS表征马铃薯中miRNA的功能。在这里，我们提出了一种基于结扎独立克隆（LIC）的马铃薯PVX的VbMS方法来评估miRNA在马铃薯植物中的功能38。我们选择了miR165/166家族来说明VbMS测定，因为miR165/166家族及其靶标mRNA和III类同源域/Leu拉链（HD-ZIP III）转录因子已被广泛表征22，47，48。 HD-ZIP III 基因是分生组织发育和器官极性的关键调节因子，miR165/166功能的抑制导致 HD-ZIP III 基因表达增加，导致顶端优势降低和叶极性异常模式等多向性发育缺陷22，35，38，41.与miRNA165/166沉默相关的易于评分的发育表型能够准确评估基于PVX的VbMS测定的有效性。

在这项研究中，我们证明了基于PVX的VbMS系统可以有效地阻断马铃薯中miRNA的功能。由于基于PVX的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统已经在许多马铃薯品种中建立49，50，51，52，因此这种基于PVX的VbMS方法可能适用于广泛的二倍体和四倍体马铃薯品种。

研究方案

1. 种植马铃薯植物。

  1. 用Murashige和Skoog（MS）培养基加上Gamborg维生素（MS基盐混合物，Gamborg维生素，30g / L蔗糖，3.5 g / L琼脂，pH = 5.7）在培养管（25 x 150 mm）中繁殖马铃薯植物。将试管置于生长室中，温度为20-22°C，16小时光照/ 8小时黑暗光周期，光强度为120μmol/ m2∙s1。
    注意:新芽和根通常在植物的1-2周内发育。每月用新鲜的MS / Gamborg维生素培养基繁殖植物。
  2. 四周后，将体外植物移植到土壤中，并在20-22°C，16小时光照/ 8小时黑暗光周期和光强度120μmol/ m2∙s1下的温室中生长。
    注:根叶新长的植物适合移栽。在前3-4天内保持新鲜移植植物的水分。

2. 构造 VbMS 向量。

  1. 设计并克隆短串联TM分子（STTM， 图1）22，53 用于感兴趣的miRNA。
    注:根据实验数据或从miRbase数据库获取miRNA序列54，55，56，57，58，59。本研究中使用的miR166序列之前已经描述过60。
    1. 通过将不匹配序列（通常为5'-CTA-3'）插入到miRNA的反向补体序列中来设计TM模块，该序列位于与miRNA的第10-11个 核苷酸相对应的位点。
      注意:例如，Stu-miR160序列是5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61，其中第10-11个核苷酸以粗体显示。反向补体序列（在脱氧核苷酸中）为5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3'，不匹配凸起插入位点以粗体显示。TM分子序列（脱氧核苷酸）应为5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'。
    2. 设计用于克隆STM片段的引物（图1）。使用具有 48-nt 间隔序列的 DNA 寡核苷酸作为 PCR 克隆的模板。正向引物由LIC1连接子（5'-CgACgACAAgACCgT-3'），上述为TM分子设计的正向序列以及48-nt间隔物的部分5'序列（5'-GTTTTGTTGTTATGGT-3'）组成。反向引物由LIC2连接子（5'-gAggAgAagAgCCgT-3'），TM分子的反向补体序列和48-nt间隔物（5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'）的3'序列的部分反向补体组成。
      注意:48-nt间隔序列是5'-GTTGTTGTTGTGTTCTAATTTAAATAATATGGTCTAAGAAGAAGAAT-3'。例如，对于STTM-miR160，前向引物应为5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTGTTGGT-3';反向引物应为5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'（图1）。
    3. 使用合成的通用48-nt垫片作为模板和高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增50μL体积的STTM片段。
      1. 通过将每个引物0.5 μL（40 μM）、0.5 μL48-nt间隔物（40 μM）、5 μL 10x PCR缓冲液、1 μL dNTP混合物（每个10 mM）、0.1 μL高保真DNA聚合酶（10 U/μL）和43 μL ddH2O混合至总体积为50 μL来设置PCR反应。 94°C 3分钟，32次循环94°C持续45秒，60°C循环45秒，72°C循环60秒。
    4. 通过乙醇沉淀纯化STTM片段。向PCR产物中加入2.5体积的乙醇和1/10体积的3M乙酸钠（pH = 4.0）。剧烈混合并以14，000× g 离心10分钟。除去上清液并用1mL 70%乙醇冲洗沉淀。干燥沉淀并将其溶解在20μL的ddH 2 O中。
      注:使用DNA电泳检查STTM PCR产物的扩增。
    5. 通过将2.5μL纯化的STTM PCR产物，0.5μL10x T4 DNA聚合酶缓冲液，0.05μL1M二硫脑油醇（DTT），0.25μL100mM dATP，0.1μLT4 DNA聚合酶（3 U / μL）和1.6μLdH2O混合至总体积为5μL，在冰上建立T4 DNA聚合酶反应。 并在75°C下处理产物20分钟以灭活T4 DNA聚合酶。
  2. 准备基于 PVX 的 VbMS 构造。
    1. 在100μL的体积中消化5μgPVX-LIC质粒38和2.5μLSmaI（20 U / μL）。
    2. 向消化后的PVX-LIC产品中加入等体积的苯酚:氯仿:异丙醇（25:24:1，pH = 6.7/8.0）并剧烈混合。以14，000× g 离心10分钟，并将上清液转移到新的离心管中。加入等体积的氯仿:异丙醇（24:1）并剧烈涡旋。以14，000× g 离心10分钟。
      注:PVX-LIC 载体包含用于克隆的 LIC 盒。PVX-LIC载体的LIC盒含有 ccdB 基因和耐氯霉素基因，需要使用含有卡那霉素（50μg/ L）和氯霉素（15μg/ L）的LB培养基在 大肠杆菌 菌株DB3.1中维持/繁殖。
    3. 将上清液转移到新的离心管中。加入2.5体积的乙醇和1/10体积的3M乙酸钠（pH = 4.0）并剧烈混合。以14，000× g 离心10分钟，除去上清液。
    4. 用1mL 70%乙醇冲洗沉淀并剧烈涡旋。以14，000× g 离心10分钟，除去上清液。干燥沉淀并用100μLddH 2O溶解消化的PVX-LIC质粒。
    5. 通过将2.5μL消化的PVX-LIC载体DNA，0.5μL10x T4 DNA聚合酶缓冲液，0.05μL1 M DTT，0.25μL100mM dTTP和0.1μLT4 DNA聚合酶（3 U / μL）混合在冰上建立T4 DNA聚合酶反应。将混合物在37°C下孵育15分钟，并在75°C下处理产物20分钟至20分钟灭活T4 DNA聚合酶。
  3. 使用 LIC 反应将 STTM 序列克隆到 PVX-LIC 载体中。混合T4 DNA聚合酶处理的STTM PCR产物（5μL）和T4 DNA聚合酶处理的PVX-LIC质粒（5μL）。在70°C下孵育5分钟，以0.1°C / s的斜坡冷却至22°C，并使用PCR机器在22°C下保持30分钟。
    注意:将孵育时间延长至4°C过夜，以实现更高的LIC克隆效率。
  4. 将5μL的LIC反应产物转化为 大肠杆菌 DH5α，并在含有50μg/ mL卡那霉素的LB板上生长62，63。通过PCR选择阳性菌落，并使用PVX-LIC载体的克隆引物和通用引物，然后进行测序。
    1. 使用 PVX-LIC 正向引物 （5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3'） 结合用于 STTM 克隆的反向引物进行菌落 PCR，以鉴定阳性克隆。PCR条带的大小应为~300 bp。
      注:通过终止器循环测序验证STTM片段的序列64，65。
  5. 从经过验证的克隆中分离PVX-STTM质粒，并将其转化为农杆菌菌株GV3101，GV2260或EHA10562，63。通过 PCR 验证农杆菌菌落。
    注:使用 PVX-LIC 的正向引物和 STTM 克隆的反向引物通过 PCR 确认 农杆菌菌 落。

3. 在马铃薯植物中执行基于 PVX 的 VbMS 测定。

  1. 将4周龄的体外马铃薯植物移植到土壤中。移植的植物将在3-4天后进行VbMS测定。
  2. 用含有PVX-STTM质粒的 农杆菌 接种马铃薯植物。
    注意:对于马铃薯中的VbMS测定，同时进行 农杆菌介导的浸润和牙签刮擦接种。
    1. 将含有 PVX-STTM 载体的阳性转化剂选取并接种到含有 50 μg/mL 卡那霉素和 50 μg/mL 利福平的 50 mL 液体 LB 中。在28°C培养箱中以220rpm生长16小时，直到OD 600 = 1.0。
    2. 同时，将阳性的农杆菌菌落划到至少两个含有50μg/ mL卡那霉素和50μg/ mL利福平的新LB板上，并在28°C下生长1天。包括 PVX-LIC38，66 载体作为对照，将 PVX-GFP67，68 作为监测病毒传播。
    3. 通过在室温下以3，400×g离心10分钟收集农杆菌液体培养物。重悬具有等体积浸润缓冲液（10 mM MgCl2，10 mM MES和200μM乙酰汗根，pH = 5.6）的农杆菌细胞，并调节至OD 600 = 1.0。在室温下孵育6小时。
    4. 用1mL无针注射器将 农杆菌 培养物浸润到完全膨胀的叶子的轴侧。
      1. 翻转并用一只手握住叶子，然后用一根手指从浸润部位的轴侧支撑叶片。用另一只手将注射器垂直到叶表面，并将 农杆菌 培养物浸入层的轴侧。
    5. 从LB板中刮下 农杆菌培养物 ，并用牙签刮擦浸润的马铃薯植物的前一个或两个节间的茎表面。轻轻划伤茎的表皮。避免刺穿茎，这可能会对植物造成严重损害。
  3. 在温室中以16小时光照/ 8小时黑暗光周期和120μmol/ m2∙s1 的光强度在22°C下生长浸润的植物。
    注意:由miRNA沉默引起的表型通常出现在接种后2-4周（图2， 图3）。浸润后 VbMS 表型通常需要 10–20 天才能出现。VbMS表型取决于特定miRNA和靶基因的特性、生长条件和马铃薯品种。

4. 执行表达式分析。

  1. 当表型出现在接种后2-4周时，用剪刀从VbMS植物中收集具有表型的组织，例如芽，叶，花或根，以及来自对照植物的组织。从收集的组织中分离总RNA。
  2. 通过电泳检查RNA质量62，63 ，并通过用分光光度计测量OD260 吸光度来量化RNA浓度。
  3. 使用茎环实时逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 分析 miRNA 表达。
    1. 对于特定的miRNA，设计一个茎环逆转录引物。茎环RT引物包含一个通用的5'主链和一个3'6-nt的特异性miRNA延伸。设计一个5'通用骨架（5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'），形成茎环结构。（大写对应于反向重复序列，小写对应于循环区域）。
    2. 形成环路的5'骨架序列的一部分用作后续PCR扩增的反向引物（骨架序列中的粗体斜体序列）。向茎环引物添加一个与感兴趣的miRNA的3'端反向互补的6-nt延伸序列，以提供逆转录的特异性（补充图1A）。
      注意:设计Chen等人69和Erika Varkonyi-Gasic等人描述的茎环逆转录引物，如70，71，72所述。例如，Stu-miR160的茎环逆转录引物被设计为5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'。马铃薯miR165/166家族的茎环逆转录引物被设计为5'-GTCTTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGGGG（A/G）A-3'。（粗体大写序列提供了特定miRNA逆转录的特异性）。
    3. 通过在冰上混合50-200ng总RNA，1μL茎环逆转录引物（100μM），2μL10x缓冲液，0.2μLRNase抑制剂（40 U / μL），0.25μLdNTPs（每个10mM）和1μL逆转录酶（200 U / μL）来设置逆转录反应。将不含核酸酶的ddH 2 O加入到20μL的总体积中。
    4. 使用脉冲逆转录程序执行逆转录。将逆转录反应混合物在16°C孵育30分钟，进行30°C的温度循环30秒，42°C30 s和50°C共1 s的温度循环，共60个循环，并通过在85°C下孵育5分钟来灭活逆转录酶。
    5. 对于miRNA表达的实时PCR分析，请根据miRNA序列设计正向引物，但不包括与上述设计的茎环逆转录引物重叠的序列。在前向引物的5'处添加3-7-nt延伸，以优化长度，熔化温度和GC含量（补充图1）。
      注意:通用反向引物是5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。例如，Stu-miR160的茎环逆转录引物被设计为5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'。miR165/166家族的茎环逆转录引物是5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'。粗体序列用作引物优化的5'扩展。用于miRNA的茎环逆转录引物和实时荧光定量PCR引物可以使用miRNA引物设计工具73进行设计。
  4. 通过标准逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 合成靶标 mRNA 的 cDNA。将逆转录反应混合物在37°C下孵育60分钟，并通过加热至85°C灭活逆转录酶5分钟。
    注意:（1）如果靶标mRNA未知，则使用psRNA靶向程序74 预测靶标mRNA。（2）mRNA的通用逆转录引物是锚定引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. 为目标 miRNA 和靶 mRNA 设置实时荧光定量 PCR 反应。在冰上混合0.5μL模板cDNA，5μL2x实时PCR缓冲液与SYBR绿色，0.05μL每个正向和反向引物（40μM）和4.4μLdH 2 O，总体积为5μL。
  6. 在95°C下孵育3分钟，在95°C下循环40次3秒，60°C孵育30秒。执行随后的熔融曲线分析，如下所示:在95°C下孵育15 s，在20°C / s的斜坡下冷却至60°C，在60°C下保持60 s，在0.2°C / s的斜坡上加热至95°C，并在95°C下保持15 s。使用ΔΔCt方法分析Ct值76，77并绘制具有标准误差的均值。
    注:（1）靶标mRNA的实时荧光定量PCR引物可以按所述设计75。（2）马铃薯 多泛素10 基因可作为马铃薯正常化的内部对照。马铃薯 多泛素10 基因的前向引物为5'-ATGTTGCCTTTTTTGTGTGGTTG-3'，反向引物为5'-TTATTTATTCACATAACACGACAGTC-3'。（3）对于实时荧光定量PCR分析，污染和引物二聚体的形成可能会产生假阳性结果。为了监测非特异性扩增并增加实时荧光定量 PCR 分析的责任，建议在实时荧光定量 PCR 测定中包括不带模板和逆转录酶的对照。

结果

图2 显示了PVX-STTM165/166马铃薯植株（Katahdin），其叶组织从叶片的轴侧沿叶脉异位生长。还观察到更严重的表型，如喇叭形叶的形成。相比之下，在PVX控制工厂中没有观察到表型异常。这些结果表明，VbMS系统可有效抑制四倍体马铃薯植株的内源性miRNA功能，PVX-VbMS系统是确定特定miRNA或miRNA家族功能的强大遗传工具。

图3 显示了PVX-STTM...

讨论

我们提出了一种基于PVX的miRNA沉默系统，通过将STTM设计整合到PVX载体中来表征马铃薯中内源性miRNA的功能。VbMS系统被证明可以有效地沉默马铃薯中的miRNA165/166，马铃薯是跨植物物种的高度保守的miRNA家族。

TM方法已被开发用于干扰基于人工miRNA靶标模拟的miRNA的表达，该拟态旨在在miRNA互补序列内的预期切割位点处创建不匹配环，从而导致靶向miRNA的封存并阻止其活性

披露声明

没有。

致谢

我们感谢清华大学的廖玉乐博士提供PVX-LIC载体。这项工作得到了德克萨斯州A&M AgriLife Research的启动基金和美国农业部国家食品和农业研究所的Hatch Project TEX0-1-9675的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µM dATP and 100 µM dTTPOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USATQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0.Teknova, Hollister, CA 95023, USA#S0297
AcetosyringoneTCI America, Portland, OR 97203, USAD2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
ChloroformVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSOTCI America, Portland, OR 97203, USAD0798-25G
DTTVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0281-25G
E. coli DB3.1for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5αfor the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather FeedICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USAG99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPsRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		7958960001
Isoamyl alcoholVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 ProofDecon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USAV1005M
MESTCI America, Portland, OR 97203, USAM0606-250G
MgCl2ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAMFCD00149781
M-MuLV Reverse TranscriptaseNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR SystemBio-Rad, Hercules, California 94547, USA170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler proEppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA950030010
pH meterSper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USABenchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan GumAlfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USAJ63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LICZhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) KitRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		7959389001
Restriction enzyme: SmaINew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAR0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMixQuanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA KitOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USASKU: D3485-01
RNase Inhibitor MurineNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0314L
RNAzol RTSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USAR4533
Soil: Metro-Mix 360Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USAMetro-Mix 360
T4 DNA polymerase and bufferNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0203S

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