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Résumé

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

Résumé

Le silençage des microARN à base de virus (VbMS) est un outil rapide et efficace pour la caractérisation fonctionnelle des microARN (miARN) dans les plantes. Le système VbMS a été développé et appliqué pour diverses espèces végétales, notamment Nicotiana benthamiana, la tomate, l’Arabidopsis, le coton et les plantes monocotylédones telles que le blé et le maïs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des vecteurs VbMS basés sur PVX pour faire taire les miARN endogènes dans la pomme de terre. Pour éliminer l’expression d’un miARN spécifique, des molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont conçues, intégrées dans des vecteurs de virus végétaux et exprimées dans la pomme de terre par infiltration d’Agrobacterium pour se lier directement au miARN endogène d’intérêt et bloquer sa fonction.

Introduction

Les microARN végétaux (miARN) sont caractérisés comme des ARN régulateurs codés nucléairement de 20 à 24 nucléotidiques1 et jouent un rôle fondamental dans presque tous les aspects des processus biologiques des plantes, y compris la croissance et le développement2,3, la photosynthèse et le métabolisme4,5,6,7, la synthèse et la signalisation hormonales8,9, les réponses biotiques et abiotiques10, 11,12,13, et la régulation des nutriments et de l’énergie14,15. Les rôles régulateurs des miARN végétaux sont bien programmés et remplis généralement aux niveaux post-transcriptionnels en clivant ou en réprimant par translation les ARNm cibles.

D’énormes progrès ont été réalisés en ce qui concerne l’identification, le profilage transcriptionnel et la prédiction des miARN dans la pomme de terre16,17,18,19,20,21. Cependant, la caractérisation fonctionnelle des miARN dans les plantes, y compris la pomme de terre, a pris du retard par rapport à d’autres organismes en raison du manque d’approches génétiques efficaces et à haut débit. Il est difficile d’effectuer une analyse fonctionnelle des miARN individuels par analyse standard de perte de fonction, car la plupart des miARN appartiennent à des familles présentant une redondance génétique considérable22. De plus, un seul miARN peut contrôler plusieurs gènes cibles23 et plusieurs miARN différents peuvent moduler la même voie moléculaire de manière collaborative24,25. Ces propriétés rendent difficile la caractérisation de la fonction d’un miARN spécifique ou d’une famille de miARN.

Une grande partie de l’analyse fonctionnelle des miARN s’est fortement appuyée sur des approches de gain de fonction qui ont des limites évidentes. La méthode des miARN artificiels (amiRNA) exploite les transcriptions primaires endogènes (pri-miARN) pour produire des miARN à un niveau élevé, conduisant à l’inhibition de l’expression du gène cible26,27,28,29. Cependant, le marquage d’activation et la surexpression de miARN à l’aide d’un puissant promoteur constitutif de 35S conduisent souvent à une expression accrue de miARN qui ne sont pas représentatifs des conditions in vivo et peuvent donc ne pas refléter la fonction endogène des miARN30. Une autre approche a été développée impliquant l’expression de formes résistantes aux miARN de gènes cibles contenant des mutations indésirables dans les sites de liaison et/ou de clivage31,32,33. Mais cette approche peut également potentiellement entraîner une mauvaise interprétation du phénotype dérivé du transgène cible résistant aux miARN en raison d’artefacts transgéniques. Par conséquent, les conclusions de ces études sur le gain de fonction doivent être tirées avec prudence34. Une autre limitation majeure des approches décrites ci-dessus est qu’elles nécessitent une transformation, ce qui nécessite beaucoup de travail et de temps. De plus, les approches dépendantes du transgène ne sont guère applicables aux espèces végétales transformatrices-récalcitrantes. Par conséquent, il est essentiel de développer une approche rapide et efficace de perte de fonction pour démêler la fonction des miARN.

Pour contourner la condition préalable de la procédure de transformation, le silençage des microARN à base de virus (VbMS) a été établi en combinant les stratégies d’imitation de cible (TM) avec des vecteurs dérivés du virus. Dans le système VbMS, les molécules de MT conçues artificiellement sont exprimées transitoirement à partir d’une colonne vertébrale virale, offrant un outil puissant, à haut débit et permettant de gagner du temps pour disséquer la fonction des miARN endogènes végétaux35,36. VbMS a été initialement développé chez N. benthamiana et la tomate avec le virus du hochet du tabac (TRV)35,36,37 et a été étendu à Arabidopsis, coton, blé et maïs en utilisant divers autres systèmes d’expression du virus, y compris le virus de la pomme de terre X (PVX)38, le virus de la déformation des feuilles de coton (ClCrV)39, le virus de la mosaïque du concombre (CMV)40,41,42, le virus de la mosaïque du blé chinois (CWMV)43 et le virus de la mosaïque des bandes d’orge (BSMV)44,45.

La pomme de terre (Solanum tuberosum) est la quatrième culture vivrière la plus importante et la culture non céréale la plus cultivée au monde, principalement en raison de sa valeur nutritionnelle élevée, de sa production d’énergie élevée et de ses besoins en intrants relativement faibles46. Plusieurs caractéristiques de la pomme de terre en font une plante modèle dicotylédone attrayante. Il s’agit d’une culture polyploïde à multiplication végétative avec un taux de croisement élevé, une hétérozygotie et une diversité génétique élevée. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun rapport caractérisant la fonction des miARN dans la pomme de terre utilisant VbMS. Nous présentons ici une approche VbMS de pomme de terre basée sur le PVX de pomme de terre adaptée au clonage indépendant de la ligature (LIC) pour évaluer la fonction des miARN dans les plants de pommes de terre38. Nous avons choisi la famille miR165/166 pour illustrer le test VbMS parce que la famille miR165/166 et leurs ARNm cibles et les facteurs de transcription homéodomaine/fermeture à glissière Leu de classe III (HD-ZIP III) ont été largement caractérisés22,47,48. Les gènes HD-ZIP III sont des régulateurs clés du développement du méristème et de la polarité des organes, et la suppression de la fonction miR165/166 conduit à une expression accrue des gènes HD-ZIP III, entraînant des défauts de développement pléotropes tels qu’une dominance apicale réduite et des modèles aberrants de polarité des feuilles22,35,38,41 . Les phénotypes de développement facilement enregistrables corrélés avec le silence des miRNA165/166 permettent une évaluation précise de l’efficacité du test VbMS à base de PVX.

Dans cette étude, nous démontrons que le système VbMS basé sur PVX peut bloquer efficacement la fonction des miARN dans la pomme de terre. Étant donné que le système de silençage génique induit par le virus (VIGS) à base de PVX a été établi dans un certain nombre de variétés de pommes de terre49,50,51,52, cette approche VbMS basée sur PVX peut probablement être appliquée à un large éventail d’espèces de pommes de terre diploïdes et tétraploïdes.

Protocole

1. Cultivez des plants de pommes de terre.

  1. Propager des plants de pommes de terre in vitro dans des tubes de culture (25 x 150 mm) avec des milieux Murashige et Skoog (MS) plus la vitamine de Gamborg (mélange de sel basal MS, vitamine gamborg, 30 g/L de saccharose, 3,5 g/L de gélose, pH = 5,7). Placez les tubes dans la salle de croissance sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1.
    REMARQUE: De nouvelles pousses et racines se développent normalement en 1 à 2 semaines à partir des plantes. Propager les plantes avec des milieux vitaminiques frais de MS / Gamborg tous les mois.
  2. Quatre semaines plus tard, transplantez des plantes in vitro dans le sol et cultivez-les dans une serre sous 20–22 °C, 16 h de photopériode claire/8 h sombre et intensité lumineuse 120 μmol/m2∙s1.
    REMARQUE: Les plantes avec des racines et des feuilles nouvellement développées conviennent à la transplantation. Maintenez l’humidité pour les plantes fraîchement transplantées pendant les 3 à 4 premiers jours.

2. Construisez les vecteurs VbMS.

  1. Concevoir et cloner les molécules TM en tandem court (STTM, Figure 1)22,53 pour les miARN d’intérêt.
    REMARQUE: Acquérir des séquences de miARN basées sur des données expérimentales ou à partir de la base de données miRbase54,55,56,57,58,59. La séquence miR166 utilisée dans cette étude a été décrite précédemment60.
    1. Concevez le module TM en insérant une séquence d’inadéquation, normalement 5'-CTA-3', dans la séquence du complément inverse des miARN au site correspondant aux 10e à 11e nucléotides du miARN.
      REMARQUE: Par exemple, la séquence Stu-miR160 est 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, où les 10e à 11e nucléotides sont en gras. La séquence inverse du complément (dans les désoxynucléotides) est 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' et le site d’insertion du renflement de discordance est indiqué en gras. La séquence moléculaire TM (désoxynucléotide) doit être 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Concevoir des amorces pour le clonage du fragment STTM (Figure 1). Utilisez des oligonucléotides d’ADN avec la séquence d’espacement 48-nt comme modèle pour le clonage par PCR. L’amorce avant se compose d’un liant LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), de la séquence avant de ce qui précède conçue pour la molécule TM et de la séquence partielle 5' de l’espaceur 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). L’amorce inverse se compose d’un liant LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), de la séquence du complément inverse de la molécule TM et d’un complément inverse partiel à la séquence 3' de l’espaceur 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      REMARQUE: La séquence d’espacement 48-nt est 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Par exemple, pour STTM-miR160, l’amorce avant doit être 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTATGGT-3'; l’amorce inverse doit être 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figure 1).
    3. Amplifiez le fragment STTM dans un volume de 50 μL par PCR en utilisant l’espaceur universel 48-nt synthétisé comme modèle et une ADN polymérase haute fidélité.
      1. Configurez la réaction de PCR en mélangeant 0,5 μL de chaque amorce (40 μM), 0,5 μL d’oligo d’espacement 48-nt (40 μM), 5 μL de tampon PCR 10x, 1 μL de mélange dNTP (10 mM chacun), 0,1 μL d’ADN polymérase haute fidélité (10 U/μL) et 43 μL de ddH2O pour un volume total de 50 μL. Effectuez l’amplification PCR standard comme suit : 94 °C pendant 3 min, 32 cycles de 94 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 45 s et 72 °C pendant 60 s.
    4. Purifier le fragment STTM par précipitation d’éthanol. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) aux produits PCR. Mélanger vigoureusement et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et rincez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Sécher la pastille et la dissoudre dans 20 μL de ddH2O.
      REMARQUE: Utilisez l’électrophorèse de l’ADN pour vérifier l’amplification des produits de PCR STTM.
    5. Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL de produit STTM PCR purifié, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M de dithiothréitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) et 1,6 μL de ddH2O pour un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min, et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min pour inactiver l’ADN polymérase T4.
  2. Préparez la construction VbMS basée sur PVX.
    1. Digérer 5 μg de plasmide PVX-LIC38 avec 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) dans un volume de 100 μL.
    2. Ajouter un volume égal de phénol:chloroforme:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) aux produits PVX-LIC digérés et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter un volume égal de chloroforme:isopropanol (24:1) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min.
      REMARQUE: Le vecteur PVX-LIC héberge la cassette LIC pour le clonage. La cassette LIC du vecteur PVX-LIC contient un gène ccdB et un gène résistant au chloramphénicol et doit être maintenue/propagée dans la souche DB3.1 d’E. coli à l’aide d’un milieu LB contenant de la kanamycine (50 μg/L) et du chloramphénicol (15 μg/L).
    3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (pH = 4,0) et mélanger vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
    4. Rincez vigoureusement la pastille avec 1 mL d’éthanol à 70 % et vortexez vigoureusement. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant. Sécher la pastille et dissoudre le plasmide PVX-LIC digéré avec 100 μL de ddH2O.
    5. Mettre en place la réaction de l’ADN polymérase T4 sur la glace en mélangeant 2,5 μL d’ADN vecteur PVX-LIC digéré, 0,5 μL de tampon d’ADN polymérase T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP et 0,1 μL d’ADN polymérase T4 (3 U/μL) dans un volume total de 5 μL. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min et traiter les produits à 75 °C pendant 20 min à inactiver l’ADN polymérase T4.
  3. Clonez la séquence STTM dans le vecteur PVX-LIC à l’aide d’une réaction LIC. Mélanger les produits DE PCR STTM traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL) et les plasmides PVX-LIC traités à l’ADN polymérase T4 (5 μL). Incuber à 70 °C pendant 5 min, refroidir à 22 °C à une rampe de 0,1 °C/s et maintenir à 22 °C pendant 30 min à l’aide d’une machine PCR.
    REMARQUE: Prolongez le temps d’incubation jusqu’à la nuit à 4 ° C pour obtenir une plus grande efficacité du clonage LIC.
  4. Transformer 5 μL des produits de réaction LIC en E. coli DH5α et croître sur une plaque LB contenant 50 μg/mL de kanamycine62,63. Choisissez et vérifiez les colonies positives par PCR avec les amorces de clonage et l’amorce universelle pour le vecteur PVX-LIC suivi du séquençage.
    1. Effectuer la PCR de colonie avec l’amorce avant pour PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') en combinaison avec l’amorce inverse pour le clonage STTM afin d’identifier les clones positifs. La taille de la bande PCR doit être d’environ 300 pb.
      REMARQUE : Vérifiez les séquences de fragments STTM par séquençage du cycle de terminaison64,65.
  5. Isolez les plasmides PVX-STTM des clones validés et transformez-les en souches Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Vérifier les colonies d’Agrobacterium par PCR.
    REMARQUE: Confirmer les colonies d’Agrobacterium par PCR en utilisant l’amorce avant pour PVX-LIC et l’amorce inverse pour le clonage STTM.

3. Effectuer un test VbMS à base de PVX dans les plants de pommes de terre.

  1. Transplantez des plants de pommes de terre in vitro de 4 semaines dans le sol. Les plantes transplantées seront soumises au test VbMS 3 à 4 jours plus tard.
  2. Inoculer les plants de pommes de terre avec Agrobacterium contenant les plasmides PVX-STTM.
    REMARQUE: Pour le test VbMS dans la pomme de terre, l’infiltration médiée par Agrobacterium et l’inoculation de grattage de cure-dents sont effectuées simultanément.
    1. Prélever et inoculer des transformants positifs contenant des vecteurs PVX-STTM en 50 mL de LB liquide contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine. Cultiver dans un incubateur à 28 °C à 220 tr/min pendant 16 h jusqu’à OD600 = 1,0.
    2. Dans le même temps, strier les colonies positives d’Agrobacterium sur au moins deux nouvelles plaques LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine et croître à 28 °C pendant 1 jour. Inclure le vecteur PVX-LIC38,66 comme témoin et le PVX-GFP67,68 pour surveiller la propagation du virus.
    3. Recueillir la culture liquide d’Agrobacterium par centrifugation à 3 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules d’Agrobacterium avec un volume égal de tampon d’infiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES et 200 μM acétosyringone, pH = 5,6) et ajuster à OD600 = 1,0. Incuber à température ambiante pendant 6 h.
    4. Infiltrer la culture d’Agrobacterium dans la face abaxiale des feuilles complètement dilatées avec une seringue sans aiguille de 1 mL.
      1. Retournez et tenez une feuille d’une main, puis utilisez un doigt pour soutenir la lame de la feuille du côté adaxial sur le site d’infiltration. Gardez la seringue verticale à la surface de la feuille avec l’autre main et infiltrez la culture d’Agrobacterium dans le côté abaxial de la lame.
    5. Grattez la culture d’Agrobacterium des plaques LB et grattez la surface de la tige des deux premiers entre-nœuds des plants de pommes de terre infiltrés avec un cure-dent. Grattez doucement l’épiderme de la tige. Évitez de percer la tige, ce qui peut causer de graves dommages aux plantes.
  3. Cultivez les plantes infiltrées à 22 °C avec une photopériode sombre de 16 h/8 h et une intensité lumineuse de 120 μmol/m2∙ s1 dans une serre.
    REMARQUE: Les phénotypes causés par le silençage du miARN apparaissent généralement dans les 2 à 4 semaines suivant la post-ininoculation (Figure 2, Figure 3). Il faut généralement 10 à 20 jours pour que le phénotype VbMS apparaisse après l’infiltration. Le phénotype VbMS dépend des propriétés des miARN spécifiques et des gènes cibles, des conditions de croissance et des variétés de pommes de terre.

4. Effectuer une analyse d’expression.

  1. Lorsque les phénotypes apparaissent à 2 à 4 semaines après la post-vaccination, collectez des tissus tels que des pousses, des feuilles, des fleurs ou des racines avec des phénotypes des plantes VbMS et des tissus des plantes témoins avec des ciseaux. Isoler les ARN totaux des tissus prélevés.
  2. Vérifiez la qualité de l’ARN par électrophorèse62,63 et quantifiez la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance OD260 avec un spectrophotomètre.
  3. Utilisez la PCR à transcription inverse en temps réel en boucle tige (RT-PCR) pour analyser l’expression des miARN.
    1. Pour des miARN spécifiques, concevez une amorce de transcription inverse tige-boucle. Les amorces RT à boucle tige contiennent une colonne vertébrale universelle de 5' et une extension de 3' 6-nt d’un miARN spécifique. Concevoir une dorsale universelle de 5' (5'- GTCTCCTCTGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') qui forme une structure tige-boucle. (La majuscule correspond à une séquence répétée inversement et la minuscule à la région de boucle).
    2. Une partie de la séquence dorsale 5' qui forme une boucle sert d’amorce inverse pour l’amplification PCR ultérieure (séquence gras-italique dans la séquence dorsale). Ajoutez une séquence d’extension 6-nt qui est inversement complémentaire à l’extrémité 3' du miARN d’intérêt à l’amorce de boucle tige pour fournir une spécificité pour la transcription inverse (Figure supplémentaire 1A).
      REMARQUE: Concevoir l’amorce de transcription inverse tige-boucle telle que décrite par Chen et al.69 et Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Par exemple, l’amorce de transcription inverse en boucle tige pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 de pomme de terre est conçue comme 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (Les séquences majuscules en gras fournissent la spécificité de la transcription inverse pour des miARN spécifiques).
    3. Mettre en place la réaction de transcription inverse en mélangeant 50 à 200 ng d’ARN total, 1 μL de l’amorce de transcription inverse tige-boucle (100 μM), 2 μL de tampon 10x, 0,2 μL d’inhibiteur de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM chacun) et 1 μL de transcriptase inverse (200 U/μL) sur glace. Ajouter le ddH2O sans nucléase à un volume total de 20 μL.
    4. Effectuez une transcription inverse à l’aide de la procédure de transcription inverse pulsée. Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 16 °C pendant 30 min, effectuer un cycle de température de 30 °C pendant 30 s, 42 °C pendant 30 s et 50 °C pendant 1 s, pour un total de 60 cycles, et inactiver la transcriptase inverse par incubation à 85 °C pendant 5 min.
    5. Pour l’analyse PCR en temps réel de l’expression des miARN, concevez l’amorce avant en fonction de la séquence de miARN, mais n’incluez pas les séquences qui chevauchent l’amorce de transcription inverse de la boucle de tige conçue ci-dessus. Ajoutez une extension de 3 à 7 pouces aux 5' de l’amorce avant pour optimiser la longueur, la température de fusion et la teneur en GC (figure supplémentaire 1).
      REMARQUE: L’amorce inverse universelle est 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Par exemple, l’amorce de transcription inverse tige-boucle pour Stu-miR160 est conçue comme 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. L’amorce de transcription inverse tige-boucle pour la famille miR165/166 est 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Les séquences en gras servent d’extensions 5' pour l’optimisation de l’amorce. Les amorces de transcription inverse en boucle de tige et les amorces de PCR en temps réel pour le miARN peuvent être conçues à l’aide de l’outil de conception d’amorces miRNA73.
  4. Synthétiser les ADNc des ARNm cibles par PCR à transcription inverse standard (RT-PCR). Incuber le mélange réactionnel de transcription inverse à 37 °C pendant 60 min et inactiver la transcriptase inverse en chauffant à 85 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : (1) Prédire les ARNm cibles à l’aide du programme psRNATarget74 si les ARNm cibles ne sont pas connus. (2) L’amorce universelle de transcription inverse pour l’ARNm est une amorce ancrée 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. Configurez la réaction pcR en temps réel pour les miARN d’intérêt et les ARNm cibles. Mélanger 0,5 μL d’ADNc modèle, 5 μL de 2x tampon PCR en temps réel avec du vert SYBR, 0,05 μL de chaque amorce avant et arrière (40 μM) et 4,4 μL de ddH2O dans un volume total de 5 μL sur glace.
  6. Incuber à 95 °C pendant 3 min, 40 cycles de 95 °C pendant 3 s et 60 °C pendant 30 s. Effectuer une analyse ultérieure de la courbe de fusion comme suit : Incuber à 95 °C pendant 15 s, refroidir à 60 °C à une rampe de 20 °C/s, maintenir à 60 °C pendant 60 s, chauffer à 95 °C à une rampe de 0,2 °C/s et maintenir à 95 °C pendant 15 s. Analysez les valeurs Ct à l’aide des méthodes ΔΔCt76,77 et tracez les moyennes avec des erreurs-types.
    REMARQUE: (1) Les amorces de PCR en temps réel pour les ARNm cibles peuvent être conçues comme décrit75. (2) Le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre peut servir de contrôle interne pour la normalisation dans la pomme de terre. L’amorce avant pour le gène de la polyubiquitine 10 de la pomme de terre est 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' et l’amorce inverse 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Pour l’analyse PCR en temps réel, la contamination et la formation d’amorces-dimères peuvent générer des résultats faussement positifs. Pour surveiller l’amplification non spécifique et augmenter la responsabilité de l’analyse PCR en temps réel, il est recommandé d’inclure des contrôles sans modèle et une transcriptase inverse pour les tests PCR en temps réel.

Résultats

La figure 2 montre les plants de pommes de terre PVX-STTM165/166 (Katahdin) avec une croissance ectopique des tissus foliaires du côté abaxial de la lame des feuilles le long des veines. Des phénotypes plus sévères tels que la formation de feuilles en forme de trompette ont également été observés. En revanche, aucune anomalie phénotypique n’a été observée dans les usines témoins pvx. Ces résultats montrent que le système VbMS était efficace pour supprimer la fonction endog...

Discussion

Nous présentons un système de silencieux miARN à base de PVX pour caractériser la fonction des miARN endogènes dans la pomme de terre en intégrant la conception STTM dans le vecteur PVX. Le système VbMS s’est avéré efficace pour faire taire les miARN165/166 dans la pomme de terre, une famille de miARN hautement conservée parmi les espèces végétales.

L’approche DE MT a été développée pour interférer avec l’expression des miARN sur la base d’une imitation artificielle d...

Déclarations de divulgation

Aucun.

Remerciements

Nous remercions le Dr Yule Liu de l’Université Tsinghua d’avoir fourni le vecteur PVX-LIC. Ce travail a été soutenu par un fonds de démarrage du Texas A & M AgriLife Research et le projet Hatch TEX0-1-9675 de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à JS.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µM dATP and 100 µM dTTPOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USATQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0.Teknova, Hollister, CA 95023, USA#S0297
AcetosyringoneTCI America, Portland, OR 97203, USAD2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
ChloroformVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSOTCI America, Portland, OR 97203, USAD0798-25G
DTTVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0281-25G
E. coli DB3.1for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5αfor the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather FeedICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USAG99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPsRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		7958960001
Isoamyl alcoholVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 ProofDecon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USAV1005M
MESTCI America, Portland, OR 97203, USAM0606-250G
MgCl2ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAMFCD00149781
M-MuLV Reverse TranscriptaseNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermoFisher, Waltham, MA 02451, USAND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR SystemBio-Rad, Hercules, California 94547, USA170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler proEppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA950030010
pH meterSper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USABenchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USAVWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan GumAlfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USAJ63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LICZhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) KitRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		7959389001
Restriction enzyme: SmaINew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAR0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMixQuanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA KitOmega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USASKU: D3485-01
RNase Inhibitor MurineNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0314L
RNAzol RTSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USAR4533
Soil: Metro-Mix 360Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USAMetro-Mix 360
T4 DNA polymerase and bufferNew England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USAM0203S

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