用Janus碱纳米管和纤维素制造用于干细胞粘附的仿生纳米矩阵

摘要

该协议的目的是展示与Janus碱纳米管（JBNTs）和纤维素（FN）的生物仿生纳米三角星（NM）的组装。当与人类间质干细胞 （hMSC） 共同培养时，NMs 在鼓励 hMSC 粘附方面表现出出色的生物活性。

摘要

一种仿生NM被开发为组织工程生物脚手架，可以增强干细胞锚定。生物仿生NM由JBNT和FN通过水溶液中的自组装而形成。JBNT 的长度为 200-300μm，内有疏水空心通道和外部亲水表面。JBNT 带正电荷，FN 收取负费用。因此，当注入中性液态溶液时，它们通过非价粘合粘合在一起，形成 NM 束。自组装过程在几秒钟内完成，没有任何化学启动器、热源或紫外线。当 NM 解决方案的 pH 度低于 FN 的等电点（pI 5.5-6.0）时，NM 捆绑包将由于带正电荷 FN 的存在而自行释放。

众所周知，NM 在形态上模仿细胞外矩阵 （ECM），因此可以用作注射脚手架，这为增强 hMSC 粘附性提供了绝佳的平台。细胞密度分析和荧光成像实验表明，与负控制相比，NMS显著增加了 hMSC 的锚定。

引言

人类间质干细胞（hMSCs）已经显示出沿着不同的间质血统自我更新和自我分化的潜力，这有助于组织¹的再生和维持。基于分化潜力，hMSC被认为是间质组织损伤和造血障碍治疗²的候选者。hMSC已经显示出通过增加组织修复，血管生成和减少炎症³促进伤口愈合的能力。然而，如果没有生化或生物材料的帮助，hMSC在预期位置达到目标组织和功能的效率很低^。虽然各种工程脚手架已被利用来吸引 hMSC 粘附在病变上，但一些部位（如长骨中间的生长板断裂）不容易被传统的预制脚手架使用，这些脚手架可能无法完全适应不规则形状的受伤部位。

在这里，我们开发了一种生物仿生纳米材料，可以就地自组装，并注射到难以到达的目标区域。注射生物脚手架NM由Janus基纳米管（JBNTs）和纤维素（FN）组成。JBNTs，也被称为罗塞特纳米管（RNTs），来自DNA碱基对，特别是胸腺素和腺苷，这里^5，6，7。如图1所见，纳米管形成时，六个分子的衍生DNA碱基对自组装通过氢键形成平面

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研究方案

1. JBNT的合成

注:JBNT单体是如前^11年出版的。

1. 化合物A1的合成
   1. 在 25 mL 甲苯和 2.5 mL N、二甲基甲酰胺中准备含有 8.50 克 2 氰乙酸和 9.80 克乙基碳酸的溶液。向下添加 4.90 mL 氯化磷。然后将混合物加热至70°C，并保持搅拌1.5小时。
   2. 冷却反应混合物到室温，倒入100克冰水。用乙酸乙酸乙酯（3 x 250 mL）提取水层，用100mL盐水清洗。将有机层干燥在硫酸氢钠上，过滤并蒸发真空下的挥发物，以获得淡黄色固体。
   3. 将黄色固体受制于二氧化硅凝胶闪光柱色谱（3% 甲醇/二氯甲烷），以产生 15.61 克复合 A1 作为白色粉末。
2. 化合物A2的合成
   1. 将3.12克化合物A1和2.75克碳酸钾混合在50mL的N-二甲基酰胺中。在室温下搅拌2小时。
   2. 在反应悬浮物中添加2.6 mL的二氧化碳。继续搅拌4小时。
   3. 在 0 °C 下将绝对乙醇添加到反应混合物中。 过滤黄色沉淀物，用二乙醚清洗。在真空下干燥过夜，产生6.18克的复合A2作为淡黄色固体。
3. 化合物A3的合成
   1. 在15mL的丙酮三烯中加入2.7 mL的甲基碘化物。此外，通过添加 6.18 克 A2 至 ....

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结果

我们的研究发现，JBNT和FN的NM形成速度很快，在10秒内发生。如图2所示，当JBNT溶液与FN溶液混合并多次吹笛时，获得白色絮凝。NM的形成过程完全是生物仿生。无需外部刺激。制造过程比一些新兴生物材料容易得多，这些生物材料基于紫外线或化学启动器，用于交叉链接^13。

我们捕获并分析了 FN、JBNT 和 NM（图 3）?.......

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讨论

在这项研究中，我们开发了一种自组装的仿生NM，它是由DNA启发的JBNT和FN形成的。在准备 JBNT 解决方案时，JBNT 亲血粉应该溶解到水中，而不是 PBS 中，因为 PBS 会导致 JBNT 的聚集，从而抑制其组装。此外，如果我们想要观察NM的纳米纤维结构，NM也应该在水中组装，因为PBS中的盐会与NM纤维捆绑在一起，从而大大降低图像的分辨率。

NM已显示出巨大的潜力，作为一个新的组织工?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056